鳜鱼病毒核酸的初步分析

提取鳜鱼病毒核酸,分别用ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ和绿豆芽核酸酸处理表明,该病毒为双链ＤＮＡ病毒,用带ＥｃｏＲⅠ酶切位点的随机引物扩增病毒核酸,获得扩增核酸带谱。经低熔点琼脂糖回收ＰＣＲ产物,与质粒ｐＵＣ１９连接,获得三个重组子,已经对两个小插入片断进行了序列分析,插入序列分别为３６９ｂｐ和４５０ｂｐ。ＧｅｎＢａｎｋ检测显示,尚未有类似的序列报导。     

一种检测鳜鱼病毒方法

<专刊>= <栏目>=研究简报 <图片>=N <表格>=N <连载>= <来源>= <中图分类号>= <主题分类>= <行业分类>= <本刊专题>= <本刊编号>= <基金项目>= <注释>= <参考文献>= <责任编辑>= <备注1>= <备注2>= <备注3>= <正文>=     

提高鳜鱼苗种成活率的技术

对鳜人工繁殖及苗种培育等6个方面进行了分析与讨论。     

成鱼池套养鳜鱼的技巧

成鱼池内套养鳜鱼,能有效清除池内野杂鱼类,避免野杂鱼与主养鱼类争饵料、争溶氧、争空间;同时还能清除池内体质弱、规格小的劣质鱼种。笔者结合生产实践,总结了以下套养技巧,现介绍如下。一、以草食性鱼为主养鱼类的成鱼池更适合套养鳜鱼草鱼、鲂鱼等草食性鱼类与鳜鱼一样,喜生活于水质清新、溶氧丰富的水域环境中,同时用于投喂的水草大多从湖泊、河道等自然水域中捞取,水草内附有大量的野杂鱼幼鱼与鱼卵等,为鳜鱼生长提供了丰富的饵料来源。另外在采用注换水、增氧等水质调控的措施时,这些鱼类的要求基本一致,管理上较为方便。二、套养的…     

重庆地区一例鹅感染鸭圆环病毒病的PCR诊断

利用PCR技术对重庆荣昌地区患病鹅进行圆环病毒检测的过程中,发现一例鹅感染鸭圆环病毒的阳性病例,说明水禽之间的圆环病毒可能存在交叉感染的现象。     

蛙病毒PCR检测方法的建立与比较分析

为了进一步丰富蛙虹彩病毒检测方法，实验针对蛙病毒3型(frog virus 3,FV3)核衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因保守区设计一对特异性引物，并选取另外2种蛙病毒PCR检测方法进行对比实验，通过反应体系的优化、反应特异性和敏感性实验，建立了一种针对FV3的PCR检测方法。结果显示，该方法最低检测限可达1.2个拷贝数的病毒粒子，与神经坏死病毒、虾血细胞虹彩病毒、大口黑鲈虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒、鲤浮肿病毒、传染性脾肾坏死病毒、加州鲈弹状病毒等常见水产动物致病毒株无交叉反应。临床样品检测表明，该方法所获得的检测结果与另外2种方法一致，结果可靠。本研究所建立的FV3 PCR检测方法，具有简便、快速、敏感度好、特异性高、低成本等特点，可用于FV3蛙病毒的快速诊断和分子流行病学调研。     

猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立

根据猪圆环病毒2型(PCV2)的基因序列,设计一对能特异性扩增PCV2ORF2基因的引物,通过对PCR方法的优化,建立了快速的PCR检测方法用于病料中PCV2感染的检测。用本方法对猪瘟病毒(HCV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)进行了扩增,均未有条带出现,表明该方法具有良好的特异性;敏感性试验表明,该方法能够检测到的最低DNA模板浓度为1.0×10-5ng/μL;重复性试验表明,该方法具有良好的稳定性。     

大口黑鲈溃疡综合征病毒MCP基因序列分析及PCR快速检测方法的建立

为了早期快速诊断近年来流行于广东省养殖大口黑鲈(Micropterussalmoides)中的病毒性溃疡综合征,本研究用基因组步移的方法获得了大口黑鲈溃疡综合征病毒(Largemouthbassulcerativesyndromevirus,LBUSV)主要衣壳蛋白(MCP)基因,该基因编码区全长1392bp。通过序列比较分析,在MCP基因内确定了一段241bp的特异性较强的片段作为靶序列,设计并合成引物,经过优化PCR反应条件,建立了可以快速检测大口黑鲈溃疡综合征病毒的PCR方法。实验表明,在PCR进行到30个循环反应时可以检测到的质粒最小浓度是104拷贝数/μL,相当于104个病毒粒子。利用该方法,从天然感染LBUSV的大口黑鲈脾脏组织DNA可扩增出241bp的片段,而健康大口黑鲈和感染了传染性脾肾坏死病毒样病毒的大口黑鲈脾脏组织则没有扩增条带。本研究建立的PCR检测方法具有检测快速、成本低、准确性高的特点,适用于大范围早期病害诊断的推广应用。     

病毒性出血性败血症病毒数字PCR检测方法的建立

为建立病毒性出血性败血症病毒精准快速检测方法,以病毒性出血性败血症病毒基因组特异保守的糖蛋白基因片段为靶目标,设计合成了特异性引物及探针,优化退火温度等关键反应条件,分别进行灵敏性试验、特异性试验及重现性试验,构建病毒性出血性败血症病毒数字PCR检测技术体系,同时,与实时荧光定量RT-PCR方法进行对比分析。试验结果显示,病毒性出血性败血症病毒数字PCR最佳退火温度为58.5℃。灵敏性试验显示,随着病毒性出血性败血症病毒基因组RNA连续10倍稀释,稀释至10⁵倍数时,数字PCR体系仍可以检测到阳性微滴,因此,确定RNA基因组核酸含量19拷贝/μL为病毒性出血性败血症病毒数字PCR的检测低限。特异性试验表明,该方法只与目标病毒——病毒性出血性败血症病毒有特异性扩增,与传染性胰脏坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒、鲤春病毒血症病毒、流行性造血器官坏死病毒、牙鲆弹状病毒、病毒性神经坏死病毒、锦鲤疱疹病毒、鲤浮肿病毒、真鲷虹彩病毒、淋巴囊肿病毒等10种病毒均无扩增反应。重复性试验结果表明,病毒性出血性败血症病毒数字PCR批内与批间试验的变异系数均小于1%,具备良好的重复性。...     

草鱼呼肠孤病毒三重PCR检测方法的建立及其应用

针对草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)各类型毒株的保守区域分别设计3对引物,优化反应条件和体系,建立了草鱼呼肠孤病毒三重RT-PCR检测方法,通过PCR扩增分别获得大小约为530 bp、297 bp和196 bp的DNA片段。进一步分析表明,该检测方法具有良好的敏感性、特异性和稳定性,可以检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型核酸最低量分别约为260、190与230拷贝的病毒量,且某一类型的引物只能检测到同一类型的GCRV。用建立的多重RT-PCR方法对2008—2011年采集自江西、广东、湖北、浙江、重庆、四川、福建等地的草鱼(Ctenopharyngodonidellus)主养区的86份草鱼出血病样品进行检测和初步流行病学分析。结果表明,Ⅰ型阳性率为9.3%,Ⅱ型阳性率为45.3%,Ⅲ型阳性率为2.3%,Ⅰ型和Ⅱ型混合感染阳性率为5.8%,Ⅱ和Ⅲ型混合感染阳性率为2.3%,其他类型的混合感染未检测到。表明目前主要流行的草鱼呼肠孤病毒为Ⅱ型。本研究建立的GCRV三重PCR检测方法可以特异性的检测各种类型的草鱼呼肠孤病毒,且具有较高的敏感性;利用该方法进行草鱼出血病初步的流行病学分析表明,目前主要流行的草鱼呼肠孤病毒为Ⅱ型,不同毒株类型混合感染的现象也普遍存在。本方法的建立旨在对草鱼出血病的快速诊断和分子流行病学调查提供实用的可操作手段。     

鳜鱼病毒传播途径的初步研究

采用PCR方法,追踪养殖鳜的亲鱼、子代、饵料鱼及与鳜养殖环境相关的水体生物和非生物因子中鳜鱼病毒的存在状况,并探讨鳜鱼病毒的传播途径。本研究中,鳜鱼塘水体中采集的除鳜以外的其他生物、底泥及水样的核酸抽提样本PCR扩增病毒结果呈阴性;感染病毒的亲鱼,其性腺中可检测出病毒,其子代组织病毒检测亦呈阳性。研究获得病毒可以在鳜体内呈潜伏状态存在和病毒可以垂直传播的一些证据。     

鳜传染性脾肾坏死病毒的纯化和酶切分析

鳜传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）是近年来危害广东地区鳜养殖业的主要病原，本文用回接感染健康鳜获得病毒原料，分离纯化了大量高纯度的ISKNV病毒粒子，电镜下可见病毒粒子为二十面体，直径平均为150mm，抽提病毒核酸，对其基因组DNA进行酶切分析，病毒基因组为双链DNA分子，表现脊椎动物虹彩病毒基因组的特点即其胞嘧啶5′端高度甲基化，以限制性内切酶EcoRI、BamHI、HindⅢ、KpnI和PstI酶切ISKNV基因组DNA，经电泳分离后，分别得到1、8、9、18、22条清晰的酶切片段，并根据酶切片段算得基因组的大小超过108.7kbp。     

鳜鱼SSR-PCR反应条件的优化探索

以鳜(Siniperca chuatsi)基因组DNA为试验材料,研究MgCl2浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶3个反应参数对微卫星PCR的影响,建立一套适合鳜微卫星PCR反应的最佳体系.结果表明,在25μL的反应体系中,Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶3个参数的适宜浓度分别为1.2 mmol/L、0.2 μmol/L和0.04 U/μL.PCR反应程序为94℃变性5 min,94℃30 s,56℃ 1 min,72℃ 1 min,共30个循环,最后72℃延伸5 min.     

鳜免疫球蛋白 D 重链基因的克隆与表达分析

用RACE-PCR和RT-PCR方法获得鳜(Siniperca chuatsi)膜结合型免疫球蛋白D(Membrane-bounded IgD,mIgD)重链基因的全长cDNA序列。鳜mIgD的cDNA全长为3358bp,其5l非编码区包含30bp,3l非编码区包含337bp;开放阅读框包含2991bp,编码996个氨基酸,基因结构为VDJ-μ1-δ1-δ2-δ3-δ4-δ5-δ6-δ7-TM。鱼类IgD恒定区氨基酸序列比对结果显示,鳜mIgD存在半胱氨酸和色氨酸保守位点,与其他鱼类IgD的相似性在37%～72%之间。用邻接法(Neighbor Joining)构建的鱼类免疫球蛋白基因的系统发育树表明,鱼类IgD形成独立的一支,鳜mIgD与牙鲆和庸鲽IgD聚为一支。荧光定量PCR结果显示,鳜mIgD的mRNA主要分布于外周血白细胞、胸腺、头肾、中肾和脾脏中。     

pH对大眼鳜和翘嘴鳜蛋白酶活性的影响

研究了不同pH值对大眼鳜消化道不同部位蛋白酶活性的影响及在最适pH条件下与翘嘴鳜消化道蛋白酶活力的差异。结果表明,大眼鳜消化道不同部位蛋白酶的活性强弱顺序为:幽门盲囊>胃>前肠>后肠,其最适pH分别是:10.4、2.8、9.5、10.1。翘嘴鳜的胃和幽门盲囊蛋白酶活力明显高于大眼鳜(P<0.01),而肠的蛋白酶活力略低,差异不显著(P>0.05)。     

基于转录组测序对翘嘴鳜(Siniperca chuatsi) 2种肌球蛋白重链基因的克隆与分析

肌球蛋白重链(Myosin heavy chain,MYH)是骨骼肌粗肌丝的重要组成单位,其表达量高低影响肌纤维的组成和肌肉生长.为了解其在翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)早期生长过程中的作用,本研究从前期生长差异显著的2组(快长组和慢长组)翘嘴鳜幼鱼转录组差异表达Unigene中筛选出2个MYH基因,RACE (Rapid amplification of cDNA ends)克隆到其全长cDNA(MYH-7a,MYH-7b).MYH-7a全长为6071bp,开放阅读框为5820 bp;MYH-7b全长为5896 bp,开放阅读框为5745 bp.序列分析显示,2个MYH均有Loopl、Loop2环、ATP结合位点等关键结构域;进化树聚类分析显示,MYH-7a与MYH-7b均属于慢肌球蛋白.实时荧光定量PCR验证发现,其在快长组样本中表达量显著高于慢长组,与转录组测序结果一致;检测其在翘嘴鳜心肌、红白肌和皮肤等14种组织的表达水平,结果显示,MYH-7a主要在心肌中表达,而MYH-7b主要在红肌中表达;在胚胎发育不同阶段,二者随着胚胎发育的进行,表达量不断增加;在幼鱼早期生长过程(孵化出膜后15 dph、30 dph和60 dph)的翘嘴鳜白肌中,在15 dph和30 dph快长组的表达量显著高于慢长组,而到60 dph时快长组的表达量均显著低于慢长组.翘嘴鳜MYH-7a、MYH-7b在快长组与慢长组鱼中的差异表达提示它们在翘嘴鳜胚胎及其早期生长发育过程中发挥重要作用.     

应用聚合酶链式反应(PCR)检测锦鲤疱疹病毒

为建立并优化锦鲤疱疹病毒检测方法,针对目前国内集约化养殖鲤鱼大面积流行的病死现象进行有针对性的检测,对在疫区采集到的病鱼肾脏、肝胰脏、肠等组织,提取基因组DNA,应用锦鲤疱疹病毒特异性引物进行PCR反应,同时设立阴性对照(TE buffer)。通过1%琼脂糖凝胶进行鉴定,与阴性对照比较,在484bp处出现特异性目的条带。经序列测定,所得PCR产物的基因序列与NCBI上锦鲤疱疹病毒的同源率达到99%以上。对同一批次的样品进行重复检测,结果表明该方法具有较好的可重复性,可据此判定结果。通过对锦鲤疱疹病毒的检测,确定了疫区引起框镜鲤(Cyprinus carpio)和建鲤(Cyprinus carpio var Jian)大批死亡的病原为锦鲤疱疹病毒(Koi Herpesvirus,KHV),从而对疫区控制、防治方案的制定提供了理论依据。建议尽快在鲤鱼主要养殖区开展KHV流行病学、诊断与检测及免疫预防等方面的研究。     

传染性脾肾坏死病毒_ConA和L_省略_对体外鳜的头肾淋巴细胞转化的影响

采用MTT颜色反应法研究传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）、伴刀豆球蛋白A（concanavallin A,ConA)和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS）在离体状态下对健康和ISKNV感染后存活30d或60d的鳜的头肾淋巴细胞转化的影响。结果表明，ConA和LPS能促进健康鳜头肾淋巴细胞的转化，而对感染后存活30d或60d的鳜头肾淋巴细胞没有作用；纯化的ISKNV对健康鳜头肾淋巴细胞没有促进淋巴细胞转化的作用，但对ConA的作用有抑制，对感染后存活的30d或60d的鳜头肾淋巴细胞，纯化的ISKNV有一定的促进转化的作用，感染存活的鳜头肾中有对ISKNV的免疫记忆性T细胞。另外，用建立的ISKNV PCR检测方法对健康和ISKNV感染后存活的鲜组织进行了检测，结果显示，健康鳜为阴性，而ISKNV感染后存活的鱼，头肾、后肾、脾脏和部分鱼的心脏为阳性。ISKNV在鳜体内形成潜伏感染。     

生物改良池塘养鳜试验

为建立低消耗、低排放、高效益的新型养殖模式,在鳜养殖池塘引入微生物、水生植物以及投放其他鱼种进行生产试验。在0.2 hm2鱼池中,投放4 cm鳜鱼种2790尾,经过185 d的饲养,单产达到415 kg/667m2。鳜池连同饵料鱼池共0.65 hm2面积,平均利润3977元/667m2,商品率90%。在局部生态系统条件下,池塘水质实现了自净,水质指标符合鳜生长要求,养殖用水比常规养殖相对减少。