家兔黄艾美耳球虫血清抗体ELISA检测法的建立

应用制备的孢子化卵囊可溶性抗原作了包被抗原建立了兔球虫血清抗体的ＥＬＩＳＡ检测法。其最适条件为：抗原包被浓度，２００μｇ／ｍＬ；包被温度，３７℃（２ｈ）；血清反应时间，１．５ｈ；酶标抗体标准工作浓度，１：１０００；反应时间，１ｈ待检血清稀释度，１：１００：ＥＬＩＳＡ试验的规定吸收值为０．０６，孢子化卵囊可溶性抗原比非孢子化卵囊可溶性抗源更适于作为ＥＬＩＳＡ包被抗原。     

黄艾美耳球虫单卵囊分离及PCR鉴定

为了获得纯种黄艾美耳球虫,从张家口某兔场的兔粪中分离黄艾美耳球虫孢子化卵囊,单卵囊接种无球虫兔,以饱和盐水漂浮法收集子代卵囊,利用CTAB法提取黄艾美耳球虫卵囊基因组DNA,并根据Gen Bank中发表的艾美耳属球虫保守序列设计引物,PCR扩增ITS并测序,设计特异性引物鉴定黄艾美耳球虫。结果表明:黄艾美耳球虫ITS1序列长330 bp,5.8S r DNA序列长157 bp,ITS2序列长522 bp。在黄艾美耳球虫ITS1/2序列高变区设计种特异性引物,与大型艾美耳球虫和肠艾美耳球虫无交叉反应。说明建立的鉴定黄艾美耳球虫的PCR方法灵敏、特异。     

四种兔艾美耳球虫卵囊产量的比较

分别用4种兔艾美耳球虫经口接种45日龄无球虫感染兔,接种剂量为1×104个卵囊/兔。感染后4d～20d,以麦克马斯特氏法计数每天排出的卵囊。结果表明,肠艾美耳球虫排卵量最多,为365.76×106个,中型艾美耳球虫为317.26×106个、黄艾美耳球虫为304.36×106个,大型艾美耳球虫排卵量最少,为200.12×106个。大型艾美耳球虫在感染后第6.5天有卵囊排出,第10.5天达到高峰(66.50×106个/只),占总量的33.23%;肠艾美耳球虫在感染后第9天有卵囊排出,第13天达到高峰(138.40×106个/只),占总量的37.83%;黄艾美耳球虫在感染后第9天有卵囊排出,第11天达到高峰(102.80×106个/只),占总量的33.78%;中型艾美耳球虫在感染后第4.5天有卵囊排出,第6.5天达到高峰(167.8×106个/只),占总量的52.89%。     

宁夏地区家兔球虫的形态观察

兔球虫病是家兔特别是幼兔的主要疫病，其发病率40．5％，病死率约80％，即使不死，生长发育停滞，体重下降，严重影响养兔业发展。国内外学者曾对兔球虫进行了大量的研究，迄止目前，文献记载家兔体内发现17种艾美属(Eimeria)球虫，加之林孟初等在我国首次报道的大孔等孢球虫共18种。宁夏地区的兔球虫未见报道，我们从1987年以来对全区家兔球虫进行了随机调查。     

堆型艾美耳球虫与柔嫩艾美耳球虫卵囊最短孢子发育时间的测定

将收集到的新排出的堆型艾美耳球虫(E.acervulina)与柔嫩艾美耳球虫(E．tenella)卵囊于29℃静态系统中孢化。以30min为间隔，对卵囊孢子发育的4个阶段在显微镜下进行观察。以1h为间隔，用发育中的卵囊连续接种无球虫鸡，以确定最短孢子发育时间(MST)。对影响孢子发育的外部因素进行了初步探讨。用堆型艾美耳球虫比较不同卵囊浓度，不同悬液深度在卵囊孢化过程中第20h时子孢子形成的卵囊百分率。E.acervulina与E.tenella的MST分别为11b与18b。卵囊浓度和悬液深度与孢子发育时间呈明显反比关系。     

家兔艾美耳球虫感染情况的调查

采用饱和盐水漂浮法试验,收集门源县东川镇克图地区李某饲养的40只幼兔的新鲜粪便,镜检阳性家兔29只,感染率为72.5%。说明在该养殖户的兔群中存在兔艾美尔耳球虫病的感染。     

球虫消毒剂的筛选及氨水对艾美耳球虫卵囊抑杀条件的优化

为了筛选有效的球虫消毒剂,本研究将柔嫩艾美耳球虫卵囊分别与16种常用消毒剂和1种高效抗球虫药物溶液(250mg/L妥曲珠利溶液)混合作用2h然后在2.5%重铬酸钾溶液中孢子化培养,或混合作用4h后接种14日龄雏鸡,根据卵囊孢子化率、孢子化抑制率、每克粪便卵囊数量(oocysts per gram of feces,OPG)、病变计分和血便情况评价消毒剂和抗球虫药物抑杀球虫卵囊效果。结果显示,8%氨水对未孢子化卵囊和孢子化卵囊均表现为100%的抑杀效果;250mg/L妥曲珠利、3%甲醛、4%苯酚、0.5%过氧乙酸、5%NaOH+10%NaCl和5%NaOH对球虫卵囊活性具有一定的抑制作用,孢子化抑制率超过10%,但是对孢子化卵囊抑杀作用不明显;而剩余10种常用消毒剂对球虫卵囊没有明显的抑杀作用。氨水抑杀球虫卵囊条件优化的试验结果显示,1%～8%氨水与未孢子化卵囊作用1h以上,均可100%抑杀球虫卵囊活性。粪便干扰试验结果显示,粪便不影响2%和4%氨水对球虫卵囊的抑杀效果。本研究结果说明常用消毒剂和抗球虫药物不能有效杀灭球虫卵囊的活性,而氨水是一种高效球虫消毒剂。本研究结果可为开发新型高效球虫消毒剂和球虫病控制提供参考。     

球虫消毒剂的筛选及氨水对艾美耳球虫卵囊抑杀条件的优化

为了筛选有效的球虫消毒剂,本研究将柔嫩艾美耳球虫卵囊分别与16种常用消毒剂和1种高效抗球虫药物溶液（250 mg/L妥曲珠利溶液）混合作用2 h然后在2.5%重铬酸钾溶液中孢子化培养,或混合作用4 h后接种14日龄雏鸡,根据卵囊孢子化率、孢子化抑制率、每克粪便卵囊数量（oocysts per gram of feces,OPG）、病变计分和血便情况评价消毒剂和抗球虫药物抑杀球虫卵囊效果。结果显示,8%氨水对未孢子化卵囊和孢子化卵囊均表现为100%的抑杀效果;250 mg/L妥曲珠利、3%甲醛、4%苯酚、0.5%过氧乙酸、5% NaOH+10% NaCl和5% NaOH对球虫卵囊活性具有一定的抑制作用,孢子化抑制率超过10%,但是对孢子化卵囊抑杀作用不明显;而剩余10种常用消毒剂对球虫卵囊没有明显的抑杀作用。氨水抑杀球虫卵囊条件优化的试验结果显示,1%~8%氨水与未孢子化卵囊作用1 h以上,均可100%抑杀球虫卵囊活性。粪便干扰试验结果显示,粪便不影响2%和4%氨水对球虫卵囊的抑杀效果。本研究结果说明常用消毒剂和抗球虫药物不能有效杀灭球虫卵囊的活性,而氨水是一种高效球虫消毒剂。本研究结果可为开发新型高效球虫消毒剂和球虫病控制提供参考。     

鸡胚接种柔嫩艾美耳球虫和堆形艾美耳球虫活卵囊的免疫保护试验

给18日龄鸡胚接种一定剂量的柔嫩艾美耳球虫(Eim eria tenella)和/或堆形艾美耳球虫(E.acervulina)孢子化卵囊,出雏后在无球虫环境中笼养,1~10日龄每天收集各组粪便样本,计数克粪便卵囊数(OPG),并于14日龄时以大剂量同源孢子化卵囊攻虫,以相对增重率(RWG)、饲料转化率(FCR)、相对卵囊产量(ROP)评价免疫保护效果。结果显示,以E.tenella或E.acervulina卵囊免疫18日龄鸡胚,其卵囊排出的潜隐期及达到峰值的时间与1日龄雏鸡接种组相一致,有相似的排卵囊曲线,提示其诱导免疫的建立是在出雏后开始建立的。攻虫后各免疫组的RWG由攻虫对照组的31.9%~51.7%提高到了76.5%~83.6%,RCR由攻虫对照组的4.11~4.89改善为2.72~2.96,ROP降至4.7%~23.5%。结果表明以一定剂量E.tenella和E.acervulina卵囊单独或混合经羊膜腔免疫18日龄鸡胚都可以建立起针对出雏后14日龄同源攻虫的良好免疫保护力。比较混合免疫E.tenella和E.acervulina卵囊组与单一接种E.tenella或E.acervulina卵囊组的免疫效果发现,混合免疫组的各项指标均稍优于后者。     

黄艾美球虫侵犯宿主组织的超微研究

利用透射电镜和扫描电镜相结合的技术对黄艾美球虫（E.flavescens）人工感染后的子孢子移动过程及被虫体寄生的宿主细胞形态学变化和粘膜形态学变化进行了观察。子孢子在进入小肠腺上皮过程中需白细胞介导，在白细胞内可发育成球形的滋养体，观察到有两个子孢子侵入同一白细胞的现象，但分别存在于各自的带虫空泡中，黄艾美球虫引起的肠粘膜损伤主要发生于感染177小时之后，其损伤主要表现在绒毛大片脱落，结缔组织裸露，表面可见到大量破损的孔洞及大量肠杆菌，被虫体寄生的腺上皮细胞基部膨胀，微绒毛脱落，细胞核膨大并部分包被虫体，有些细胞核裂解为二。     

黄艾美耳球虫大配子体发育及卵囊壁形成超微结构的研究

黄艾美耳球虫大配子的发育在盲肠和结肠腺上皮中的带虫空泡内进行。大配子发育过程中出现两种成囊颗粒（ＷＦＢＩ和ＷＦＢⅡ），且ＷＦＢⅡ先于ＷＦＢⅠ出现。其带虫空泡内有被膜空泡存在。作者观察到了被膜空泡从虫体表面脱落的现象。此外，还发现一例大配子体在宿主细胞核中发育的现象。成熟的大配子受精后，囊被开始形成。卵囊形成的标志是大配子两层膜（ｍ１，ｍ２）松弛，ＷＦＢⅠ迁移到两层膜松弛后留下的空隙内，崩解并融合形     

鸡巨型艾美耳球虫卵囊呼吸作用的研究

采用纯种巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)卵囊,人工感染3周龄的石歧杂雏鸡,及时收集卵囊,以0.1N硫酸溶液悬浮,用微量呼吸检压仪检测卵囊呼吸作用。试验表明:孢子化过程中最初十小时内该球虫卵囊的耗氧量为3.59μl/小时/10~6个卵囊。耗氧量的变化与其细胞分裂过程相对应,耗氧量在三次核分裂前夕降低,但在分裂期升高。最高耗氧量出现于子孢子形成期,达18.91μl/小时/10~6卵囊。孢子化后卵囊的呼吸作用较缓慢,耗氧量为0.85μl/小时/10~6个卵囊。完成孢子化所需时间为26小时。     

家兔球虫的单卵囊分离和感染技术研究

家兔球虫的单卵囊分离和感染技术研究张龙现（河南农业大学牧医系４５０００２）张百灵（河南省汝阳县农牧局）球虫病是家兔中普遍发生且危害严重的一种寄生虫病，到目前为止，家兔体内已发现的球虫有１７个种。由于在自然发病情况下，多系混合感染，因此对于免球虫病的研...     

三种艾美耳球虫感染鸡卵囊排泄期的观察

三种艾美耳球虫感染鸡卵囊排泄期的观察黄兵，赵其平，何林华，吴薛忠，陈兆国，史天卫（中国农科院上海家畜寄生虫病研究所）鸡球虫是危害养鸡业发展的重要寄生虫，几乎所有养鸡的地方都有球虫，共有９个种，不同虫种对鸡的致病性、免疫性以及感染后的＿卵囊最早排出时间...     

柔嫩艾美耳球虫大配子发育和卵囊的超微结构

利用透射电镜对柔嫩艾美耳球虫大配子发育和卵囊的超微结构进行了观察。结果表明，大配子体和小配子体寄生于相邻的宿主细胞内，相伴产生。大配子体的发育、大配子的形成、受精及卵囊形成均于带虫空泡内完成。大配子体系由末代裂殖子侵入肠上皮细胞后，缩短、长大、变圆而形成，大配子体和大配子外被单位膜，细胞核位于大配子体中央，早期大配子体的细胞核有1个明显的核仁，细胞质内逐渐形成大量成囊体1、成囊体2、大量支链淀粉和脂肪体，成囊体1比成囊体2形成的早。卵囊壁有5'层，内有大量支链淀粉和指肪体。含有大配子体、大配子和合子的带虫空泡内有丰富的泡内小管，它们是大配子体、大配子和合子获得营养物质和排出代谢废物的途径。     

鸡艾美耳球虫单卵囊分离技术的建立

以玻璃纸做材料,用毛细吸管分离单卵囊,通过显微镜"重复"鉴定法,对柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)进行分离.单卵囊感染20只鸡,在感染后5 d～15 d,用饱和盐水漂浮集卵法进行检测.结果显示,有15只鸡粪便中检出卵囊,经鉴定均为所要分离的虫种(E. tenella),感染成功率为75%,准确率达100%.另外,应用改进后的玻璃纸单卵囊分离技术还成功分离到毒害、巨型、堆型、布氏、和缓和早熟艾美耳球虫的单一虫种.结果表明,改进后的单卵囊分离技术简单易行,感染方便,成功率和准确率都较高,而且所用材料易于获得,消毒方便.     

鸡球虫病四价活疫苗对毒害艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫的免疫效果观察

为评价一种商品化鸡球虫病四价活疫苗[柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)、毒害艾美耳球虫(E.necatrix)、巨型艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫]对E.necatrix和E.tenella的免疫保护效果,本研究基于试验鸡血便记分、存活率、相对增重率、病变值、卵囊值及抗球虫指数(ACI)等指标对其免疫效果进行检测.结果表明,免疫攻虫组抗E.necatrix和E.tenella的ACI分别为157.3和135.6,均低于160,表明该球虫疫苗抗两种球虫的效果均为低效.然而,免疫攻虫组鸡血便数量、血便记分、增重、卵囊产量和病变记分等指标均优于阳性对照组.综合指标显示,该疫苗对E.necatrix和E.tenella具有一定的免疫保护力,但单纯采用疫苗并不能够达到防控鸡球虫病的目的.     

柔嫩艾美耳球虫与鸡体的相互作用

鸡吞食柔嫩艾美耳球虫卵囊后感染,子孢子穿过绒毛上皮和固有层,进入隐窝上皮细胞,经数次无性生殖和有性生殖,形成裂殖子和配子体。大配子被小配子受精后发育成卵囊,并脱落到粪便中,鸡感染球虫后,鸡体免疫系统抑制球虫的发育有三个时期：子孢子寻找穿透位点时;子孢子在绒毛上皮时;子孢子穿过固有层时。据此,我们研究了抗球虫免疫中诱导和效应阶段的决定因素。结果表明,子孢子在固有层中的穿透诱导了免疫;子孢子是免疫有关的最重要的发育阶段;细胞毒性Ｔ细胞对抑制球虫发育是必需的。     

氨水对柔嫩艾美耳球虫卵囊体外脱囊率的影响

在研究理化因素杀伤球虫孢予化卵囊的效果时,一般通过接种动物后,观察动物的病理指标进行。其周期长,工作量大,一次实验需0.5～1个月左右。由于病理指标较难定量化,并且,实验过程中的影响因素繁多,故误差较大,条件也较难控制。我们试用球虫体外脱囊率作指标,即通过观察理化因素对卵囊体外脱囊率的影响来判断其对孢子化卵囊的杀伤效果。无需特殊仪器设备和场地,一般实验室均能进行。现将结果报道如下。     

电穿孔转染对柔嫩艾美耳球虫卵囊孢子化率影响的观察

柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)是寄生于鸡肠道的7种艾美耳球虫之一,由于其具有繁殖力强、卵囊获取与纯化简单、易于实验室操作,并且可在鸡胚内和细胞内进行发育的特点,常常被选择为艾美耳属球虫生物学研究的模式虫种[1].