兔病毒性出症疫苗毒株的保存及免疫效力研究

采用１９８５年本实验室分离鉴定的一株ＲＨＤＶ（武汉分离株）,制备ＲＨＤＶ－抗血清治疗剂,推广应用１２年无获得较好的防治效果。长期保存,反复活化的ＲＨＤＶ肝组织血凝效价在１：６４０－１：２５６０;疫苗保护率约９９Ａ％;ＲＨＤＶ－抗血清治愈率８０％。结果显示该株ＲＨＤＶ的免疫原性稳定,同时亦表明近１２年在武汉周边地区ＲＨＤＶ的抗原性变异不大。     

兔病毒性出血症抗血清的制备及效价测定

本试验采用兔病毒性出血症灭活疫苗、兔病毒性出血症灭活疫苗和兔病毒性出血症病毒强毒两种不同的免疫程序来免疫家兔．采用血凝及血凝抑制试验检测血清的抗体效价。结果表明：经3次免疫后,疫苗免疫程序组免疫家兔的抗血清平均效价为9log2,未免疫家兔的抗体平均效价为2log2。     

兔出血症病毒在患兔各组织器官内的分布

为确定兔出血症病毒在兔各组织器官内的分布,给１０只兔人工接种ＲＨＤＶ,对典型发病的各患兔体内１５种组织器官的病毒血凝效价进行测定。结果,其病毒血凝效价的排列顺序为肝脏、脾脏、血液、骨髓、心肌、肾脏、肌肉、胰脏、肺脏、淋巴结、脑组织、粪、气管、胆汁、尿。     

兔病毒性出血症免疫程序的探讨

经对不同日龄仔兔病毒性出血症的母源抗体测定表明，仔兔在３０日龄时其抗体已有近８０％降至阴性水平，ＨＩ均值仅为１．０（ｌｏｇ２），仔兔母源抗体效价与母兔抗体效价之间有相关性。强毒攻击试验结果表明，家兔的ＨＩ抗体达到３ｌｏｇ２以上时有坚强的保护力。３０日龄、４５日龄两次免疫的仔兔对强毒攻击保护率为１００％，免疫期可达１０个月，并可使处于免疫空缺期的３０～４５日龄仔兔免受兔病毒性出血症的侵袭。     

兔病毒性出血症基因工程疫苗研究进展

兔病毒性出血症,俗称兔瘟,该病流行早期也被称为兔致死性病、兔小RNA病毒出血热、兔出血性败血综合征、比利时野兔传染性坏死性肝炎等。它是由兔出血症病毒     

兔病毒性出血症研究概况及前景

兔病毒性出血症(RHD)是由兔病毒性出血症病毒(RHDV)引起的一种急性、高度致死性传染病,对易感兔致病率可达90%,病死率高达100%。本文对兔病毒性出血症病毒的形态及理化特性、体外培养、分子生物学、病毒的检测和疫苗等方面做了系统深入综述,并提出了存在的问题及展望。     

兔病毒性出血症基因工程疫苗的研究进展

兔病毒性出血症俗称兔瘟,它是由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起的一种急性、烈性、高度接触性、致死性传染病。1984年中国首次报道了该病。RHDV曾是兔的一种毁灭性传染病,因给养兔业带来巨大的经济损失而备受养兔业的关注。1989年,世界动物卫生组织(OIE)将该病正式列为B类传染病,我国将其列为二类传染病。     

兔病毒性出血症研究概况

本文对兔病毒性出血症病毒的形态及理化特性、兔病毒性出血症病毒的分子生物学、兔病毒性出血症病毒的诊断、兔病毒性出血症病毒的疫苗等方面进行了简要综述。     

兔病毒性出血症灭活疫苗免疫程序研究

为了解仔兔母源抗体消长规律,将健康种兔在配种前20日左右免疫兔病毒性出血症灭活疫苗,母兔产仔后,每批仔兔中挑选10只仔兔,分别于3日龄、7日龄、14日龄、28日龄、35日龄、40日龄、45日龄、50日龄时采血,测定兔病毒性出血症病毒抗体效价,结果7日龄左右仔兔母源抗体均值达到高峰,后随日龄增大抗体均值缓慢下降,35~40日后逐渐低于有效保护值;取不同日龄家兔进行免疫,结果免疫日龄越晚,抗体产生的越快,一个月内,抗体值也越高,例如,35、40、45、50日龄仔兔免疫后7日,血凝抑制抗体均值分别为26.8、26.5、27.9及28.6,免疫后6个月,抗体均值均在保护性抗体水平。     

西藏兔病毒性出血症的研究--病原鉴定及疫苗免疫效力试验

１９９４年６￣７月,西藏林芝地区家兔大批急性死亡同,经过流行病学调查,临诊断症状观察,病理剖检等结果与兔病毒性出血症特征相符。进一步作病毒学检查表明,病变组织超薄发切片经电子显微镜观察发现有大量直径约３０ｎｍ的球状裸听病毒粒子,自然病死兔肝组织匀交涉 清能凝集入）型红细胞,而且血凝兔出血症病毒阳性抗血清所抑制,致病性试验结果表明,该病毒对兔有很强的致病性;用西藏自然病死兔肝组织匀浆试制的矩形疫苗兔     

兔出血症病毒CD株衣壳蛋白(VP60)基因的克隆、核酸及氨基酸序列比较分析

以兔出血症病毒 CD株人工感染家兔 ,发病死亡后 ,取肝脏匀浆 ,用 Trizol试剂从匀浆上清中提取病毒 RNA。根据 Gen Bank已发表序列保守区设计并合成引物 ,采用 RT- PCR方法扩增了 RHDV衣壳蛋白 VP6 0基因。将所扩增片段克隆到 p MD18- T载体上 ,并进行了序列测定 ,测序结果表明 ,CD株 VP6 0基因全长 174 0 bp。该序列与已发表的其他分布于世界各地的 14株 RHDV序列进行了比较和基因进化树分析。无毒株与各强毒株之间的同源性为 85 .3%～86 .5 % ,强毒株间的同源性较高 ,为 92 .1%～ 10 0 %。根据进化树可把强毒株分为 2大群 ,一群为 CD株、Iowa2 0 0 0株、0 0 - 139株、99- 0 5株 ,其余的为另一群。进一步细分 ,还可以分为 4个亚群和 7个组。但毒株之间的地域性差异并不明显。同时根据 15株 RHDV VP6 0基因的核苷酸序列推导了其所编码的氨基酸序列 ,并进行氨基酸序列的比较和亲水性、柔性区、抗原性和表面结构的比较分析。结果显示 ,各毒株氨基酸之间的的同源性在 90 .5 %～ 10 0 %之间 ,其中无毒株与各强毒株之间的同源性为 90 .5 %～ 91.9% ,强毒株间的同源性在 95 %～ 10 0 %之间 ;氨基酸变异分析未发现突变造成的 VP6 0蛋白高级结构的根本性变化     

RHDV CD株VP60主要抗原表位基因的克隆与序列分析

本实验用RHDV CD株人工感染家兔,发病死亡后,取肝脏匀浆,用Trizol试剂从匀浆上清中提取病毒RNA。根据Genbank已发表序列保守区设计并合成引物,采用RT-PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60主要抗原表位基因。PCR产物纯化后,进行序列测定。测序结果表明,VP60主要抗原表位基因长525bp。该序列与已发表的其它13株RHDV VP60同一核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性比较。结果显示,CD株核酸序列与WX-84株同源性最高为97.5%,与其它毒株的同源性在92.0%～96.6%之间。氨基酸序列与WX-84株、墨西哥Mexi-co-89株同源性最高为99.4%,与其它毒株的同源性在96.6%～98.3%之间。     

兔病毒性出血症病毒保藏及其对疫苗效果的研究

将不同地区收集到的8株兔病毒性出血症典型病料，放在－30℃低温冰箱中分别保藏5年和10年，保藏期满后取样检测血凝效价，并用保藏5年的RHDV病料和2001年活化增殖的新鲜病料分别制成病毒疫苗。试验结果表明RHDV以病料形式（主要是肝、肺等脏器）保藏，在－30℃低温冰箱中，经5年后，病毒血凝效价稳定不变，保藏10年后总下降率为25％，但病毒效价仍大于2560，可用于疫苗生产，说明该商毒在上述条件下保藏5－10年病毒是比较稳定的，不同保藏年限的病料批量生产疫苗，安全性和免疫保护率均达到100％。     

用抗原免疫构建分泌兔出血症病毒抗独特型抗体的杂交瘤细胞

用纯化的兔出血症病毒（ｒａｂｂｉｔｈａｅｍｏｒｈａｇｉｃｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ,简称,ＲＨＤＶ）免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠。正如网络学说所指出的,从免疫鼠的杂交瘤细胞克隆中,不仅筛选出能分泌抗ＲＨＤＶ抗体（Ａｂ１）的细胞克隆,同时也筛选出能分泌抗ＲＨＤＶ独特型抗体（ａｎｔｉ－ｉｄｉｏｔｙｐｉｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ,Ａｂ２）的杂交瘤细胞,用抗原而不用单克隆抗体（Ａｂ１）免疫,诱导产生抗独特型抗体（Ａｂ２）是一种具有广阔的应用前景的新技术     

兔出血症病毒镇江株的分离鉴定及VP60蛋白活性表达

试验旨在分离兔出血症病毒（rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV）镇江株,分析其遗传进化变异,并表达具有良好活性的重组VP60蛋白。通过排除细菌感染、血凝（HA）和血凝抑制（HI）检测、动物攻毒试验与病毒传代、LD₅₀测定等方法,自江苏省镇江市某兔场发病死亡动物肝脏组织样品中分离病原并鉴定;RT-PCR方法获得VP60基因,通过分析VP60基因核苷酸及氨基酸序列研究其遗传进化;将VP60基因与pCold-Sumo载体连接,构建低温诱导、融合Sumo标签原核表达载体,15℃、IPTG诱导表达重组VP60蛋白并对表达产物进行反应原性鉴定。结果显示,分离鉴定获得RHDV ZJ2015毒株,该毒株能凝集人"O"型红血球,HA效价为11log2,其血凝性能被RHDV （AV33）抗血清抑制,该毒株的LD₅₀为10^-6.38/mL,具有较强的毒力;RT-PCR扩增得到大小约为1 740 bp的特异性条带,系统进化树分析显示,该毒株属于RHDV1抗原遗传变异株（RHDVa）,与RHDV1和RHDV2 VP60基因核苷酸序列同源性分别为89.4%~97.6%和81.1%~81.5%,氨基酸序列同源性分别为93.8%~98.3%和87.4%~87.6%。构建的低温原核融合表达质粒pCold-VP60在大肠杆菌Rosetta （DE3）中成功表达,通过SDS-PAGE及Western blotting分析,在分子质量74 ku处有特异性表达蛋白条带,且与抗血清发生特异性抗原抗体结合反应,说明重组蛋白具有良好的反应原性。本研究为开展兔病毒性出血症流行病学研究、开发新型重组疫苗与诊断试剂提供参考依据。     

一株兔出血症病毒某些性质的研究

采用氯仿,聚乙二醇一硫酸葡聚糖钠盐二相系统和蔗糖密度梯离心法,从患兔出血症死亡兔肝组织中提取,纯化病毒。该病毒粒子无囊膜,呈２０面体对称,直径一般为３３－３７ｎｍ。共三角剖分数Ｔ＝３,共有３２个子粒,每一子粒为中空,外径为９ｎｍ左右的圆形轮廓。     

兔病毒性出血症病毒“LQ”株的分离鉴定

对成都龙泉某兔场疑似兔病毒性出血症(RHD)发病兔的病料进行细菌学检查以及血凝性、特异性鉴定,并进一步进行致病性鉴定。结果表明:RHDV LQ株对人"O"型红细胞具有高度血凝性,血凝效价达10×212;RHDV抗血清可特异性抑制RHDV LQ株对人"O"型红细胞的凝集;RHDV LQ株对家兔的LD50为10-6.87/mL,是一株对家兔具有高致病力的强毒株。     

兔出血症病毒(RHDV)全基因组克隆与分子流行病学分析

根据GenBank已发表的多株RHDV全基因组序列，设计3对扩增RHDVCD株的特异性引物，扩增了RHDV CD株包含全序列的3个片段，并分别克隆到pMD18-T载体上。根据引物上唯一的交叉酶切位点，把三个克隆片段同时克隆到pUC18载体上，获得了RHDV CD株全基因组克隆，测定了全基因组序列（GenBank accession number AY523410）。进行了CD株全序列与GenBank上已发布的其他6株全序列比较及基因进化树分析。发现除CD株外，其余6株（西班牙AST-89株、法国SD株、意大利BS89株、德国分离1株、德国分离2株、澳大利亚Czech V351株）之间的同源性均很高，在93．9％～100％之间，而CD株与其他6株之间的同源性均较低，在89．0％～89．6％之间。德国的2个分离株序列完全相同，应为同一毒株：进化树分析表明，此7株病毒可形成2个明显的分支，中国CD株形成一个分支，其余欧洲、澳大利亚分离株开成一个分支，具有明显地域差异特征．     

兔病毒性出血症病毒的提纯及部分特性鉴定

应用建立的SDS—蔗糖密度梯度超速离心法,纯化了从兔肝组织中粗提的兔病毒性出血症病毒。通过血凝、电镜观察、SDS-PAGE、琼脂双向免疫扩散、免疫印迹等试验,证明SDS—蔗糖梯度柱分离的病毒纯度高,具有4种结构多肽。     

法氏囊活性肽对兔瘟灭活疫苗免疫效果影响的研究

采用超滤浓缩技术制备纯化的鸡法氏囊活性肽（分子量1kDa以下，主要成分为法氏囊活性肽），以不同的剂量肌肉注射45日龄母兔，同时颈部皮下接种兔瘟灭活疫苗，观察法氏囊活性肽对兔瘟疫苗免疫效果的影响。结果表明：纯化的法氏囊活性肽能够加快兔瘟抗体产生的速度，缩短诱生抗体时间，提高抗体水平，延长抗体维持时间。实验期间，4mL法氏囊活性肽组的兔瘟HI抗体水平比对照组平均高2－3个滴度。淋巴细胞转化试验结果表明：禽法氏囊活性肽可以短暂地促进T－淋巴细胞的活化。因此，法氏囊活性肽主要对体液免疫具有增强作用。