普通小麦品种豫麦34和郑丰5号ω-醇溶蛋白基因的克隆与序列分析

ω-醇溶蛋白是影响小麦加工品质和诱发乳糜泻(celiac disease,CD)的面筋蛋白之一。为给小麦加工品质的分子改良和预防乳糜泻提供参考依据,利用3对特异引物,采用基因组PCR法,从优质小麦品种豫麦34和郑丰5号中克隆获得41个ω-醇溶蛋白序列。NCBI BLAST分析表明,克隆序列与已知序列的相似度均在91%~99%之间,推断其为ω-醇溶蛋白基因家族的基因。开放阅读框识别分析表明,11个序列(Y34W-1~Y34W-7,ZFW-1~ZFW-4)具有完整的开放阅读框,可编码203~377个氨基酸残基。ZFW-4和Y34W-1在重复区的插入片段中存在1个额外的半胱氨酸残基。CD免疫肽识别分析表明,11个基因中均分布有3种ω-醇溶蛋白的T细胞免疫肽,且肽段PQQPFPQQ存在多个拷贝。聚类分析显示,ω-醇溶蛋白具有一定的基因组特异性,11个克隆的基因与尾状山羊草(Aegilops markgrafii)和粗山羊草(Aegilops tauchii)的ω-醇溶蛋白基因序列具有相对较高的同源性。     

栽培一粒小麦α-，γ-，ω-醇溶蛋白基因的克隆与序列分析

为全面揭示栽培一粒小麦诱发乳糜泻（Celiac disease,CD) 的毒性和在小麦品质改良中的应用价值,根据已注册基因的保守序列分别设计2~3对特异引物,采用AS-PCR技术对栽培一粒小麦的醇溶蛋白新基因进行克隆、CD毒性肽识别和同源性分析。结果表明,从栽培一粒小麦中分别克隆得到26个具有独特编码区的α-（命名为：Gli-A-1~Gli-A-7,GenBank登陆号为JN831382-JN831385和JX828193~JX828195）、γ-（命名为：Gli-R-1~Gli-R-6,GenBank登陆号为HM120220,JX828376~JX828380）、ω-（命名为：Gli-w-1~ Gli-w-13）醇溶蛋白新基因和1个已知基因（Gli-R-7,ACJ03494）。CD毒性肽的识别分析表明,栽培一粒小麦具有较强的CD毒性,分布于醇溶蛋白的5种主要T细胞优势多肽和4种“毒性肽”除A基因组来源的α-醇溶蛋白中不含有的毒性肽Glia-α2和Glia-α外,其余多肽在克隆基因的编码蛋白中均有分布。克隆基因与已知基因的同源性分析表明,α-、γ-醇溶蛋白的推断氨基酸序列存在明显的基因组来源的差异性,而ω-醇溶蛋白基因的基因组来源差异不明显。此外,所克隆的7个α-醇溶蛋白变异相对广泛,而γ-、ω-醇溶蛋白基因的组成则相对单一,具有极高的相似度。     

栽培一粒小麦α 醇溶蛋白新基因的克隆与序列分析

α-醇溶蛋白是人们生活中消费最多的蛋白,由于含有引起乳糜泻(CD)的主要毒性肽成分,也是引起CD的最活跃的蛋白。为了解一粒小麦在小麦品质育种中的潜力,利用1对α-醇溶蛋白的特异引物,采用基因组PCR法从栽培一粒小麦中克隆α-醇溶蛋白新基因,共获得片段大小为856～882bp的4个基因序列,分别命名为AA-6、AA-8、AA-9和AA-21(GenBank登录号为JN831382～JN831385)。其中,AA-8、AA-9和AA-21均在102位因C→T替换而导致TAG终止子出现成为假基因;AA-6由882个核苷酸构成,可编码293个氨基酸,与已知基因的最高同源性为99%,推断氨基酸序列具有α-醇溶蛋白的典型结构,是α-醇溶蛋白家族的新成员。AA-6的CD毒性肽分析表明,除不含A基因组所没有的glia-α和glia-α2毒性肽外,其他已知的7种毒性肽均有分布。AA-6和86个来源于小麦及其祖先供体种的α-醇溶蛋白的同源性分析表明,α-醇溶蛋白基因存在基因组来源的差异性,其中,A、D基因组来源的α-醇溶蛋白基因的相似性较高。     

波兰小麦醇溶蛋白遗传变异分析

为了解波兰小麦物种的遗传变异水平和种内不同材料间的遗传关系,利用APAGE技术对72份来源于全世界的波兰小麦材料醇溶蛋白位点进行了检测。结果表明,波兰小麦醇溶蛋白位点存在丰富的变异类型,共产生48条迁移率不同的醇溶蛋白谱带,每个材料具有8~24条不等,平均16.2条。材料间平均遗传相似系数(GS)为0.5132,变幅为0.1429~1.000。当GS水平为0.50时,所有材料可聚为4个大类,其中CItr13919等16个来源于埃塞俄比亚的材料均聚在一起,而另一大类为5份来自于葡萄牙的材料。可以认为,APAGE揭示的种内遗传关系与其地理分布有一定的相关性。     

济麦20 α 醇溶蛋白基因的克隆与序列分析

α 醇溶蛋白不仅与小麦面粉的加工品质密切相关,也是诱发乳糜泻（celiac disease,CD）的主要活力蛋白。为了解强筋优质小麦济麦20的α 醇溶蛋白组成及其CD毒性,利用1对α 醇溶蛋白特异引物,采用基因组PCR法,从济麦20中扩增、克隆了27个具有独特编码区的核苷酸序列(命名为：JM20A 1~ JM20A 27,GenBank注册号为：JN831386~JN831392和JX828280~JX828311)。其中,18个核苷酸序列（ JM20A 1~ JM20A 18）具有完整的开放阅读框, 可编码280~313个氨基酸残基组成的α 醇溶蛋白。这18个基因的氨基酸序列除JM20A 1和JM20A 2在特征II区含有1个额外的半胱氨酸外,其他16个均具有α 醇溶蛋白的典型结构特点,含有6个保守的半胱氨酸。对CD免疫肽的分布分析发现,这18个基因的编码蛋白均符合D基因组来源的α 醇溶蛋白的特点,以不同的组合含有2~4种主要的T细胞免疫优势多肽,定位于6D染色体。与来源于栽培一粒小麦（Triticum monococcu）、拟斯脾尔脱山羊草（Aegilops speltoides）和粗山羊草（Aegilops tauschii）的92个α 醇溶蛋白的氨基酸序列的同源性分析表明,这18个基因均与来源于粗山羊的α 醇溶蛋白基因的同源性最高,进一步说明这些基因很可能来源于6D染色体。     

小麦醇溶蛋白的遗传与品质改良

醇溶蛋白是小麦胚乳中的重要贮藏蛋白,由它在组成上的高度异质性以及品质的重要作用长期以一直上受到广泛关注,本文综述了近年来国内外在醇溶蛋白基因定位,后代遗传规律,等位基因变异及其与品质和农艺性状的关系进行了研究进展,并讨论了通过醇溶蛋白组成的电泳筛选改良小麦品质的可行性及前景。     

小麦醇溶蛋白组分的遗传研究

为探讨醇溶蛋白在小麦杂种后代的遗传特点,选用2个小麦杂交组合(苏引10号×晋农190、晋麦47×晋农190),用酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(APAGE,pH 3.1)对其亲本及后代材料(F_1、F_2代)进行了电泳分析.结果表明,醇溶蛋白在F_1代表现出共显性和倾母性(剂量效应)遗传特点;F_2代蛋白谱带发生分离,具体表现为:Gli-13.9、23.2、26.0、34.8、40.2、46.2、50.0、71.5、73.8等9个组分的分离符合一对基因的分离规律,而Gli-12.7、15.7、16.5、19.1、26.9、30.5、30.8、32.2、76.8等9个组分的分离符合两对基因的分离规律;Gli-17.8既不符合一对基因的分离规律,又不符合两对基因的分离规律.这表明前9种蛋白受控于一对基因,后9种蛋白受控于两对基因;最后一种蛋白尚无法确定,需借助双向电泳做进一步研究.     

对不同小麦品种醇溶蛋白亚组的定性测定

本文对来自不同家和基因型的１６个小麦品种的ω－、α－和γ－型醇溶蛋白亚组的含量及比率进行了分析。这１６个品种的技术性状不同。在用盐溶液预前洗提后，再用６０％（Ｖ／Ｖ）的含水乙醇作洗提液，则能从面粉中获得最适量的醇溶蛋白洗提物。利用Ｃ１８硅胶上的逆相关活性液态图粉仪进行分离和定性测定。醇溶蛋白及其亚组的总含量存在着显著的种间差异。在各种醇溶蛋白中，只有ω－醇溶蛋白以低水平存在。在面粉蛋白质含量同醇溶     

波兰小麦对普通小麦醇溶蛋白的改良作用

为研究波兰小麦对普通小麦醇溶蛋白的改良作用,利用酸性聚丙烯酰胺凝胶(A-PAGE)电泳技术对60个波兰小麦×普通小麦中13后代株系的醇溶蛋白位点进行了检测.结果表明,波兰小麦与普通小麦杂交后代醇溶蛋白存在丰富的变异类型,共产生了34条迁移率不同的醇溶蛋白谱带,其中,α区2条,β区24条,γ区4条,ω区4条.每个株系具有7～21条带,多数株系为12～19条,平均15.68条.醇溶蛋白遗传多样性指数(H')及多态性信息含量(PIC)分析结果显示,β区醇溶蛋白组成最为丰富,而α区最低.供试材料间存在较大的遗传变异,在GD值0.38水平上可聚为4类.波兰小麦醇溶蛋白谱带在BC<,1F<,2中出现的频率比BC<,2中更高,变异更为丰富.杂交后代中出现了4条双亲不具有的新谱带.分析表明,波兰小麦对普通小麦醇溶蛋白的改良有十分明显的作用.     

青海省小麦种质材料醇溶蛋白的遗传多样性分析

为了解当前青海省普通小麦种质材料醇溶蛋白的遗传多样性,利用酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(A-PAGE)技术对青海省77份普通小麦种质材料进行了醇溶蛋白遗传多样性分析。结果表明,供试材料中共分离出蛋白谱带1 237条,迁移率不同的谱带类型37种,其中迁移率编号为2、19和3号的谱带出现频率最高,分别为98.7%、98.7%和97.4%;3条谱带(15、16和17号)出现频率低于10.5%;其余31条谱带出现频率为19.5%～84.4%。供试材料醇溶蛋白谱带多态性较高,每个材料可电泳分离出11～21条谱带,其中具有14～18条谱带的材料居多。不同材料间的遗传相似系数变化范围为0.55～0.94,说明供试材料具有丰富的遗传多样性。聚类分析将供试材料分成6大类,聚类结果在一定程度上反映了供试材料间的亲缘关系。     

河南省地方小麦品种醇溶蛋白的遗传多样性分析

为给河南省小麦地方品种资源的利用提供科学依据,采用A-PAGE方法,对小麦地方品种白和尚头、白麦、白芒糙、出山豹等15种243份地方小麦品种进行了同质检验,对同质地方品种进行了同名品种间和非同名品种问醇溶蛋白构成分析,并将聚类结果与农艺性状相结合进行分析.结果表明,243份材料中有156份同质,占总样品的64.2%.这156份地方品种共产生72条谱带,其中a区21条、p区22条,Υ区16条、ω区13条,共147种构型;谱带分布频率范围为0.6%～100%,平均为25.6%;多样性指数为0.957,其中α区0.801、β区0.836、Υ区0.897、ω区0.870.15种同名品种产生谱带的范围为27～41条;品种间遗传距离最小为0,最大为2.033,平均遗传距离分布在0.330～0.574之间;遗传多样性指数分布在0.940～0.958之间.将聚类结果与农艺性状进行比较,农艺性状相近的材料大都能在遗传距离为1.0时被聚为一类.相同的带型在同名品种间和非同名品种间都有出现,表明小麦地方品种问存在同名异种、同种异名的现象.     

部分普通小麦醇溶蛋白的遗传多样性分析

为了揭示普通小麦(Triticum aestivum L.)品种间醇溶蛋白的遗传多样性,采用A-PAGE方法对60份普通小麦品种(系)进行了醇溶蛋白分析.结果表明,全部供试品种(系)共检测到943条带,每份材料可电泳出9～21条带,平均15.7条.试验共获得迁移率不同的谱带74条,其中第2和第4条谱带出现的频率最高,分别为45.00%和、51.67%,其余的谱带多态性很高,说明小麦种质间存在丰富的醇溶蛋白遗传异质性.供试材料间的遗传距离(Genetic distance,GD)变异范围为0.40～0.84,平均为0.62.聚类分析在GD值为0.82水平上可将供试材料分为4大类群.     

普通小麦及其近缘种醇溶蛋白遗传多样性分析

为了解小麦近缘种的醇溶蛋白多样性分布规律,应用A-PAGE方法对63份普通小麦及其近缘种材料进行醇溶蛋白遗传多样性分析.结果表明,电泳出现99条迁移率不同的谱带,构成63种组合,总体多态性信息指数达到0.984,以ω区最高,γ和β次之,α区最低.不同基因组构成材料多态性信息指数的分区比较发现,近缘种材料与普通小麦在α区相差最大,其中AA、AABB、AAGG基因组在α区的多态性信息指数均比地方小麦和斯卑尔脱小麦高0.164,而与广泛杂交改良的高代品系类似.谱带分布频率分析发现,高频带和中频带主要出现在ω、γ和β三个区,频率低于0.05的低频带主要出现在α区.聚类分析反映的亲缘关系基本和进化一致,但近缘种与普通小麦高代品系有交叉.此外,本文亦对小麦近缘种的醇溶蛋白分布规律及其在品质育种中的应用潜力进行了讨论.     

小麦和黑麦品种醇溶蛋白的比较分析

为了分析普通小麦醇溶蛋白和黑麦醇溶蛋白的异同,运用酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳法和反相高效液相色谱法对4个普通小麦品种和4个黑麦品种的醇溶蛋白进行了比较分析。在酸性电泳分析方法中,4个普通小麦品种共分离出16条迁移率不同的谱带,而4个黑麦品种共分离出10条谱带,每个品种在α、β、γ、ω四个区的分布频率也不相同。从谱带出现的频率和染色的深浅可明显看出普通小麦的醇溶蛋白含量远远大于黑麦品种。在反相高效液相色谱分析方法中,普通小麦分离出12～18个组分,黑麦品种分离出6～12个组分;普通小麦不同类型的醇溶蛋白出峰时间比较紧凑,而黑麦的出峰时间差异较大。反相高效液相色谱分析方法能很好地分离醇溶蛋白,且其更快速、简便、所需样品量少。     

99份国内小麦新品种（系）醇溶蛋白的遗传多样性分析

为了解目前普通小麦育成品种（系）间醇溶蛋白的遗传多样性,利用酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Acid polyacrylamide gel electrophoresis, APAGE）技术对国内99份小麦新品种（系）进行了醇溶蛋白分析。结果表明,供试材料中共分离出蛋白带2 192条,迁移率不同的谱带类型106种,其中迁移率编号为9和11的2种谱带出现频率最高,均为82.11%;有38条谱带的出现频率低于10%,这些低频率谱带仅出现在极少数的材料中;其余66条谱带出现频率为10.53%~64.21%,具有较高的多态性。每个被检测材料可电泳分离出15 ~ 30条带,其中大部分为18 ~ 24条。供试材料间遗传距离（Genetic distance, GD）为0.07 ~ 0.73,平均为0.59,遗传变异较大。聚类分析可将其分为4大类。与过去的小麦品种醇溶蛋白研究结果相比,新品种（系）的平均遗传距离缩小,遗传基础变窄。     

波兰小麦醇溶蛋白遗传差异及其与新疆稻麦的关系

利用酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＡＰＡＧＥ）对９份波兰小麦和２份新疆稻麦进行了醇溶蛋白分析。结果表明：⑴波兰小麦具有明显的醇溶蛋白多态性,９份材料具有７种醇溶蛋白带型,电泳分离出的２７条带中,２３条具有多态性;⑵供试波兰小麦间遗传距离在０－０．７５之间,平均值为０．４９,遗传变异较大。供试波兰小麦在遗传距离０．４９水平上聚为３类,其醇溶蛋白聚类与收集地关系不大;⑶新疆稻麦与波兰小麦的醇溶蛋白电泳图谱具     

改良ISTA醇溶蛋白电泳方法及其应用

本文以ＩＳＴＡ醇溶蛋白标准电泳程序为基础，在吸收其简便、快速的优点同时，着重对其分辨率低、应用范围小的缺点进行改良。主要通过改变凝胶组成及关键操作步骤，建立了一套分辨率高，重复性好，简便快速且适用于我国仪器和试剂的电泳程序，并论述了该方法的应用领域。