定量分离土壤绿僵菌的多果定高效选择性培养基

为了定量评估生防真菌绿僵菌在土壤中的存活能力和种群数量,需要确定高效的选择性培养基及其分离效率。本文研究了不同浓度多果定对绿僵菌的选择作用和分离检出率,结果表明,在以氯霉素抑制土壤细菌的基础上,多果定浓度在50~200 mg/L时能够有效抑制土壤中的非目标真菌而选择出可清晰鉴别和计数的绿僵菌;当浓度为25 mg/L时,对杂菌的抑制不完全,残留杂菌数占总数50%左右。随着多果定浓度增高,绿僵菌生长减缓、产孢颜色变黄、分离检出率降低。在多果定50 mg/L浓度下,接种培养绿僵菌4 d和6 d的菌落检出率分别69.20%和71.43%,显著低于对照培养基的检出率95.56%和94.72%;在200 mg/L的高浓度下,4 d和6 d检出率分别只有45.45%和61.24%,又显著低于前者低浓度下的检出率。试验确定了在蔗糖基础培养基中添加50 mg/L多果定为选择剂,能够有效抑制土壤中非目标真菌99%以上,对绿僵菌的分离效率稳定在70%左右。选择剂的抑制作用和选择效率是土壤微生物定量检测中不可忽略的因子。正确地评估田间绿僵菌数量是研究其种群动态、生态效应和持续生防作用的必要基础。     

紫外线诱变莱氏绿僵菌对敌敌畏的耐药性

为筛选出对常用有机磷杀虫剂敌敌畏具有较强耐药性的莱氏绿僵菌Metarhizium rileyi突变菌株,本文通过紫外线照射诱变莱氏绿僵菌,并利用敌敌畏对紫外突变菌株进行4次药剂理化诱变,并对突变株进行了抗性水平、遗传稳定性测定,得出敌敌畏对莱氏绿僵菌孢子的致死浓度为1 291 mg/L,适合莱氏绿僵菌紫外线诱变的最佳照射时间为2 min和2.5 min,得到6株能耐1 291 mg/L敌敌畏的突变菌株,其中突变株Nr-UVY6的抗性水平是出发菌株的2.57倍,抗药性遗传稳定性也最佳。     

一株淡剑灰翅夜蛾病原性真菌莱氏绿僵菌的多基因序列鉴定

为明确从草坪害虫淡剑灰翅夜蛾Spodoptera depravata(Butler)罹病虫体分离得到的病原性真菌菌株DT2011N7的分类地位,通过形态学观察、BLAST序列比对以及基于ITS、β-tubulin和rpb2a的单基因序列分析和3个基因联合的多基因序列分析对菌株进行了鉴定。结果显示,菌株DT2011N7在萨氏麦芽糖酵母浸粉培养基上培养时,菌落初期呈白色,产孢后表面密布孢子呈淡绿色;分生孢子为椭圆形,大小为3.5~5.5μm×2.0~2.8μm。BLAST序列比对结果显示菌株DT2011N7与莱氏绿僵菌Metarhizium rileyi一致性最高,达99%~100%;在3个单基因及多基因系统进化树中,该菌株均与莱氏绿僵菌聚在同一进化分支中,自展值达99~100。结合形态学特征、同源性比对结果及系统进化树分析,将菌株DT2011N7鉴定为莱氏绿僵菌M.rileyi。     

金龟子绿僵菌固态培养生物变量优化研究

金龟子绿僵菌属于真菌类生物杀虫剂,本文研究了接种量、种龄、菌种代数等生物因素对金龟子绿缰菌生长及产孢量的影响,并对液—固两步发酵工艺进行了研究。经过优化,得到金龟子绿僵菌产孢的最佳生物参数是:接种量为2.5g/100g、种龄为5-6天;采用固体二代种,培养6天,孢子产量可达1.531×10~(10)孢子/g干培养基。     

虫尸表面罗伯茨绿僵菌产孢、致病力及其相关基因的表达特征

为明确绿僵菌在其致死害虫表面生长发育和致病力等相关分子机制,通过显微观察大蜡螟Galleria mellonella虫尸表面罗伯茨绿僵菌Metarhizium robertsii生长和产孢特性,并测定其致病力,分别对虫尸表面和PDA培养基上罗伯茨绿僵菌的菌丝生长阶段和大量产孢阶段进行高通量测序,对虫尸表面罗伯茨绿僵菌产孢及致病力通路相关基因进行系统分析,并采用荧光定量PCR技术对高通量测序结果进行验证。结果表明,PDA培养基上培养5 d后,罗伯茨绿僵菌开始大量产孢,培养14 d时产孢量最高,为4.6×10~7个/cm~2,大蜡螟幼虫注射罗伯茨绿僵菌4 d后,其体表出现菌丝,5.5 d后虫尸表面罗伯茨绿僵菌大量产孢,9 d后产孢量最高,为2.6×10~8个/cm~2。与PDA培养基上罗伯茨绿僵菌对大蜡螟幼虫的半致死时间(7.09 d和4.66 d)相比,体壁侵染法和显微注射法侵染的虫尸表面罗伯茨绿僵菌对大蜡螟幼虫的半致死时间(6.33 d和4.49 d)分别显著缩短和无显著变化。高通量测序结果显示,在菌丝生长阶段和大量产孢时期,虫尸表面罗伯茨绿僵菌中共有810个基因上调表达,452个基因...     

金龟子绿僵菌固态培养生物变量优化研究

金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisoplae)是真菌类生物杀虫剂。其孢子发芽侵入昆虫体壁后可在血腔内大量增殖,引起昆虫死亡。通过研究接种量、种龄、菌种代数等生物因素对金龟子绿僵菌生长及产孢量的影响,并对液—固两步发酵工艺进行了研究。经过优化,得到金龟子绿僵菌产孢的最佳生物参数是接种量2.5g/100g,种龄5～6d;采用固体二代种,培养6d,孢子量可达1.531×1010孢子/g干培养基。金龟子绿僵菌固态培养生物变量优化研究@吴振强$华南理工大学生物工程系!广州510640     

一株引起田间昆虫流行病的虫生真菌的多基因序列鉴定

本研究采用形态学鉴定、单基因、多基因序列系统发育进化分析等方法对引起山东临沂地区的白菜地夜蛾科昆虫流行病的病原真菌进行鉴定,明确了此病原真菌的系统分类地位。通过菌株的菌落特征、培养特征和产孢特性初步确定引起山东临沂地区夜蛾科昆虫流行病的病原菌系绿僵菌属Metarhizium spp.,通过多基因序列测定、系统发育进化分析,进一步确定引起流行病的菌株为莱氏绿僵菌Metarhizium rileyi,菌株命名为SDMr01。用浓度为1.0×108个/mL的SDMr01孢子悬浮液分别浸泡小菜蛾Plutella xylostella及斜纹夜蛾Spodoptera litura 2龄幼虫进行致病性测定,14 d后累计校正死亡率分别为77.1％、80.5％。结果表明,莱氏绿僵菌SDMr01对部分夜蛾科害虫具有良好的生防潜力及开发应用前景。     

一株罹病草地贪夜蛾成虫莱氏绿僵菌的分离鉴定及其致病力

从草地贪夜蛾成虫尸体中分离获得一株杀虫真菌。经形态和分子鉴定,确定该虫生真菌为莱氏绿僵菌,并命名为Nr Sfadult202104。生物学特性的研究结果显示,该菌株在SMAY+0.5%草地贪夜蛾蛹粉培养基上生长速率和分生孢子产量最佳;在28℃时菌落生长速率最快,20℃时产孢最为适宜;在全光照条件下该菌株产孢量最高。对草地贪夜蛾成虫和3龄幼虫的致病力测定结果显示,该菌株对草地贪夜蛾雌、雄成虫以及3龄幼虫都具有一定的毒力效果。当孢子浓度为1.0×10⁸孢子/m L时,其感染雌、雄成虫校正死亡率分别为61.2%和58.1%;菌株接种3龄幼虫后,随孢子悬浮液浓度的升高,幼虫的感病死亡率也随之增加,当浓度达到1.0×10⁸孢子/m L时,3龄幼虫的致死中时(LT₅₀)为5.30 d,接种8 d后3龄幼虫的校正死亡率为66.12%。综合以上结果,莱氏绿僵菌Nr Sfadult202104菌株对草地贪夜蛾具有潜在的生防作用,值得深入研究。     

金龟子绿僵菌CQMa117的营养要求与培养特性初探

金龟子绿僵菌大孢变种Metarhizium anisopliae var.major菌株CQMa117是新分离到的一株对天牛有良好杀虫活性的绿僵菌菌株。通过单因素试验,测试不同温度、pH、碳源、氮源及无机盐类对CQMa117菌株生长和产孢的影响,确定了蔗糖、葡萄糖、可溶淀粉、蛋白胨、尿素、硫酸铵以及Cu^2＋、K^＋、Ca^2＋是菌落生长和产孢的最适碳源、氮源和无机盐类;培养基初始pH6.0、培养温度25℃是菌株的最适产孢条件。通过碳源、氮源及无机盐3个较优水平的正交试验,确定菌株最适合的产孢固体培养基为：1000ml固体培养基中加入10.0g蔗糖、2.5g尿素、5.0g酵母膏和0.001%Cu^2＋,可使CQMa117菌株产孢量比基础培养基增加30.2%。     

不同浓度增效剂对金龟子绿僵菌、黄绿绿僵菌和球孢白僵菌产孢的影响

生防菌作为一种重要的生物杀虫剂,被开发成多种制剂应用于农林害虫的防治;微生物制剂的生产成本高、耗时长,极大影响其生产效率。本试验通过液固两相发酵法筛选出提高金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae、黄绿绿僵菌Metarhizium flavoviride和球孢白僵菌Beauveria bassiana产孢量的最优增效剂浓度。结果表明0.1%浓度增效剂对金龟子绿僵菌的促产孢作用达最大化,浓度达4.48×10⁹孢子/g;黄绿绿僵菌的最适增效剂浓度为0.05%,浓度达2.75×10⁹孢子/g;当增效剂浓度小于0.1%时利于黄绿绿僵菌的产孢,增效剂高于0.1%时抑制产孢;而球孢白僵菌的产孢量与增效剂浓度正相关,最大浓度达7.41×10⁹孢子/g。在真菌液体发酵过程中添加产孢增效剂,有效提高了真菌产孢量,缩短了真菌培养周期,为提高真菌制剂生产效率、节约成本提供理论支持。     

杀菌剂对玉米穗腐病菌的毒力及毒素产生的影响

为筛选防治玉米穗腐病同时减少病原菌毒素积累的化学药剂,采用菌丝生长速率法、涂布平板法分别测定了4种药剂多菌灵、百菌清、吡唑醚菌酯和氰烯菌酯对玉米穗腐病的3种主要致病镰孢菌拟轮生镰孢菌、层出镰孢菌和禾谷镰孢菌菌丝生长和孢子萌发的影响,并采用高效液相色谱法测定了4种药剂对其毒素积累的影响。结果表明:层出镰孢菌菌株127-1和禾谷镰孢菌菌株125-3的最佳产毒时间为第10天。供试4种药剂对3种镰孢菌菌丝生长的EC50值范围为0.18~5.71μg/m L,对孢子萌发的EC50值范围为0.02~8.14μg/m L,均表现出一定的抑制作用。但对3种镰孢菌产伏马毒素、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰孢菌烯醇的影响不尽相同,吡唑醚菌酯浓度在1~500μg/m L时能够抑制拟轮生镰孢菌和层出镰孢菌产生伏马毒素,氰烯菌酯能够在0.05~0.8μg/m L浓度范围内显著抑制禾谷镰孢菌产生玉米赤霉烯酮,当多菌灵浓度为0.05~0.5μg/m L时,几乎可以完全抑制禾谷镰孢菌产生脱氧雪腐镰孢菌烯醇。     

18种化学农药与绿僵菌相容性研究

本文检测了18种常用低毒化学农药对生防真菌绿僵菌Metarhizium anisopliae孢子萌发、菌丝生长及产孢的影响,分析它们与绿僵菌的相容性。总体看,杀虫剂、植物生长调节剂和除草剂与绿僵菌的相容性好于杀菌剂。其中,氰戊菊酯与绿僵菌相容性最好,即使在10倍的推荐浓度下,对孢子萌发无影响,对菌丝生长速度和产孢量的抑制率只有25.13%和38.63%。高效氯氟氰菊酯和乐果与绿僵菌也有较好的相容性,在推荐的田间使用浓度下,孢子萌发抑制率为30%左右,对菌丝生长和产孢量基本没有抑制。溴氰菊酯、啶虫脒、吡虫啉、甲霜灵、氟乐灵、阿维菌素、敌百虫、毒死蜱和波尔多液与绿僵菌有一定的相容性。矮壮素、哒螨灵、多菌灵、甲基硫菌灵、代森锰锌和三唑酮与绿僵菌相容性很差。     

布氏白僵菌和金龟子绿僵菌两变种的生长性状及其对蛴螬的毒力测定

以蛴螬病原真菌--布氏白僵菌、绿僵菌小孢变种作参照菌,研究了新分离鉴定的绿僵菌大孢变种的生物学特性,测定了不同温度、不同培养基条件下各菌株对蛴螬的致病能力.结果表明：绿僵菌大孢变种与两种参照菌的培养条件接近,最适宜生长的温度为25℃,所试的3种培养基中,最适宜的培养基为PPDA,其次为SDAY;绿僵菌大孢变种在偏低温（10～20℃）的环境下对蛴螬的毒杀能力比布氏白僵菌强,土壤处理和喷雾处理后,累计僵虫率分别达88.23%和76.47%,有很好的田间应用前景.两种真菌的拌土处理效果高于直接喷雾.鉴于绿僵菌Ma1的致病力较强,在生产上可用该菌进行土壤处理,防治蛴螬等地下害虫.     

草地贪夜蛾莱氏绿僵菌的分离鉴定

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda(J.E.Smith)是2019年入侵我国的一种迁飞性害虫,已成为严重影响我国玉米生产的重要害虫。目前国内关于草地贪夜蛾昆虫病原真菌的研究报道很少。2019年6月,在云南省曲靖市沾益县安东村玉米田调查发现了被虫生真菌感染的草地贪夜蛾幼虫。经室内分离培养,结合形态和ITS序列相似性分析鉴定确认,感染草地贪夜蛾幼虫病原性真菌为莱氏绿僵菌Metarhizium rileyi,编号为ZYSP190701菌株。调查表明,2019年7月17日田间草地贪夜蛾的莱氏绿僵菌感染率为15.46%±2.52%,8月2日感染率达29.83%±13.71%。用莱氏绿僵菌ZYSP190701菌株1×10~8个/mL孢子浓度接种草地贪夜蛾3龄幼虫后第7天时草地贪夜蛾的感染死亡率高达100%。上述结果表明,莱氏绿僵菌ZYSP190701对草地贪夜蛾有良好的生防潜力,具有草地贪夜蛾生防菌剂开发应用的前景。     

新农药介绍

中文通用名称:绿僵菌英文通用名称:Metarhizium anisopliae(拉丁文)农药登记名称及商品名:100亿孢子/毫升绿僵菌油悬浮剂(克洛卡)理化性质:该药的有效成分为金龟子绿僵菌的分生孢子。金龟子绿僵菌是由重庆缙山自然保护区黄脊竹蝗僵虫体内分离出的,菌株编号为CQ102。经鉴定该菌株CQ102属于菌物界、丰知菌亚门、丝孢纲、绿僵菌属、金龟子绿僵菌(异名:黄绿绿僵菌)。其菌落特征:在SDA(萨氏葡萄糖)培养基上菌落初期为白色茸状,产孢时灰绿色至橄榄绿色,自菌落中心由里向外长出成丛的绿色分生孢子堆。分生孢子梗单生或聚集或紧密排列,帚状分枝…     

青海省樱桃叶斑病菌生物学特性及室内药剂毒力测定

为明确青海省樱桃叶斑病菌链格孢Alternaria alternata的生物学特性及筛选出对其防效最佳的药剂,本研究采用菌丝生长速率法和孢子计数法研究了不同培养条件对该病原菌菌丝生长和产孢量的影响,并用菌丝生长抑制率法对9种杀菌剂进行室内毒力测定。结果表明,菌丝生长和产孢的最适培养基分别为马铃薯蔗糖琼脂(PSA)培养基和马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基,最适温度为25℃, 最适氮源为蛋白胨,最适碳源分别为肌醇和乳糖,最适pH分别为6~8和6~7,24 h持续黑暗处理更有利于菌丝生长和产孢。9种化学药剂对病原菌均有不同程度的抑制作用,其中250 g/L嘧菌酯悬浮剂抑菌效果最好,EC50为1.258 mg/L。该研究结果可为青海省樱桃叶斑病的防治提供理论依据。     

绿僵菌Ma55抗多菌灵突变株的诱变及抑菌作用研究

在室内条件下测定了供试绿僵菌对多菌灵的抗性。结果表明, 供试菌株对多菌灵均表现为敏感, 其中, Ma55菌株对多菌灵最敏感。采用分生孢子定向筛选的方法获得了金龟子绿僵菌抗多菌灵突变株, 测定了抗性突变株对多菌灵的抗性差异。结果显示, 在获得的抗性突变株中, MC-2的EC50最大, 达到397.064 3μg/mL, 对多菌灵的抗性水平最高, 抗性水平指数达到102.35。对Ma55抗多菌灵突变株的菌丝生长速率、产孢量及对棉花枯萎病菌和棉花红腐病菌的抑制效果的研究结果表明, 抗性突变株的菌丝生长速率均比亲本菌株Ma55小, 但产孢量均比Ma55大, 其中, MC-2的产孢量最大, 为5.12×106个/mL; MC-5次之, 其产孢量为4.81×106个/mL, MC-8的产孢量在抗性突变株中最低。平板对峙培养结果显示, 金龟子绿僵菌抗多菌灵突变株对棉花枯萎病菌和棉花红腐病菌菌丝生长的抑制作用均达到显著水平, 其中, MC-2对棉花枯萎病菌、棉花红腐病菌菌丝生长的抑制作用最强, 与亲本对照菌株Ma55差异不显著。     

一株绿僵菌的鉴定、生物学特性及对东亚飞蝗的致病力

从河南省汝阳县林地里采集到的天然罹病的黑蚱蝉僵虫中,分离到1株绿僵菌Metarhizium spp.,根据菌落培养特征和产孢结构特性,结合菌株ITS1-5.8s RNA-ITS2基因序列,鉴定为金龟子绿僵菌M.anisoliae,编号Ma121.测定了温度、光照、pH值以及碳氮源、微量元素对菌株Ma121菌丝生长和产孢的影响,得到菌株Ma121生长和产孢的适宜条件为温度25～30℃、全黑暗、培养基以大豆粉为碳源和蛋白胨为氮源并添加锰盐、pH 7.室内测定了菌株Ma121对东亚飞蝗若虫的致病力,结果显示菌株Ma121高浓度孢悬液(1×107～1×108孢子/mL)对若虫的校正累计死亡率均达到90％以上,致死中时(LT50)少于5d.说明菌株Ma121能够有效侵染东亚飞蝗若虫并将其致死,菌株Ma121可以作为优良菌株进行杀蝗生物农药的进一步研发.     

绿僵菌与8种红火蚁防控常用农药相容性

研究了茚虫威、多杀菌素、苯氧威、氟虫腈、硼酸、烯虫酯、阿维菌素和高效氯氰菊酯等防控红火蚁的常用农药在田间推荐剂量及亚致死剂量下对黄绿绿僵菌Metarhizium flavoviride SM076和金龟子绿僵菌M. anisopliae M09萌发、生长及产孢的影响。结果表明,0.1 mg/mL茚虫威、0.1 mg/mL多杀菌素和0.5 mg/mL烯虫酯浓度下,对黄绿绿僵菌SM076萌发、生长及产孢等没有影响。0.5 mg/mL茚虫威、0.1 mg/mL阿维菌素、0.01 mg/mL苯氧威、0.5 mg/mL烯虫酯和0.05 mg/mL氟虫腈对金龟子绿僵菌M09的萌发、菌丝生长和产孢量均无影响。因此在田间应用这两种虫生真菌时,可以考虑与上述农药结合使用。     

武夷菌素对活体微生物农药的影响

本文以武夷菌素为主要对象,以牛津杯抑菌测试法和菌丝生长抑制法观察武夷菌素对几种常见的真菌类活体微生物农药之间的影响。武夷菌素对于真菌孢子的抑制试验结果显示,武夷菌素在高浓度处理下对球孢白僵菌的抑制作用显著大于金龟子绿僵菌,其中对球孢白僵菌的最小抑菌浓度为400 mg/L,对金龟子绿僵菌的最小抑菌浓度为200 mg/L。武夷菌素对绿色木霉、哈茨木霉、淡紫拟青霉菌丝生长率的抑制试验结果显示：武夷菌素100 mg/L浓度对于三种真菌菌丝生长的抑制率分别为64.6%、48.6%、39.2%,进行毒力回归方程计算,数据表明武夷菌素对绿色木霉的EC₅₀为57.13 mg/L,对哈茨木霉的EC₅₀为109.81 mg/L,对淡紫拟青霉的EC₅₀为170.03 mg/L。武夷菌素在防治病害过程中实际用药量约100 mg/L,会对金龟子绿僵菌、球孢白僵菌、绿色木霉、哈茨木霉和淡紫拟青霉产生不同程度的抑制,建议应错开使用。本研究所获得的结果对指导武夷菌素及活体微生物农药的生物防治应用具有重要的意义,为生物防治技术集成提供理论基础。