牛副流感病毒3型双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立牛副流感病毒3型(BPIV3)双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测方法,本研究采用纯化的病毒分别免疫小鼠与家兔,制备鼠抗BPIV3单克隆抗体(MAb)与兔抗BPIV3多克隆抗体(PAb)。以纯化的兔抗BPIV3 PAb作为包被抗体,鼠抗BPIV3 MAb作为检测抗体,采用棋盘滴定法确定DAS-ELISA的最适工作条件。结果显示,纯化的兔抗BPIV3 PAb与鼠抗BPIV3 MAb的效价分别为1:25 600和1∶12 800,均可与BPIV3病毒蛋白特异性结合。建立的DAS-ELISA方法捕获抗体最佳包被浓度为10μg/m L,37℃孵育1 h;检测抗体最佳工作浓度为2.5μg/m L,37℃孵育1 h;TMB室温显色30 min。判定的临界值为0.451。本研究建立的DAS-ELISA方法与牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒均无交叉反应,特异性较强。检测下限为10~3TCID_(50)。批间和批内变异系数均小于10%,具有良好的重复性。利用该方法和RT-PCR对75份牛鼻拭子临床样品进行检测,两者符合率为94.6%。本研究建立的检测BPIV3的DAS-ELISA方法适用于兽医基层临床样品的大规模检测。     

牛副流感病毒3型核衣壳蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

为建立以牛副流感病毒3型(BPIV3)核衣壳蛋白(NP)为包被抗原的间接ELISA方法,本研究扩增BPIV3的NP基因并克隆于原核表达载体,获得重组表达质粒p ET30-NP。将其转化至表达菌BL21(DE3),获得了可溶性表达的重组N蛋白,用镍柱在非变性条件下纯化后将其作为包被抗原,建立了检测BPIV3抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果显示作为包被抗原的重组N蛋白仅与BPIV3阳性牛血清发生特异性反应,与牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒等牛的常见病原无血清学交叉反应,表明其特异性较强。牛BPIV3阳性血清在1:640倍稀释时按该方法检测仍为阳性,显示该方法具有较高的敏感性。重复性试验显示批内变异系数小于6%,批间变异系数小于12%,表明该方法具有较好的稳定性。对94份牛血清的比较试验显示,本研究建立的间接ELISA方法与病毒中和试验的符合率为98%。利用该方法检测了394份采自接种过BPIV3灭活苗牛场的血清样品和95份未接种疫苗牛场的血清样品,结果接种疫苗的牛血清均呈强阳性,而95份未接种疫苗牛血清的阳性率为80%。本研究建立的间接ELISA方法可以试用于国内BPIV3的流行病学调查和免疫监测,为国内BPIV3的防控提供技术支持。     

抗A型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及抗原捕获ELISA检测方法的建立

为建立A型口蹄疫病毒(FMDV)病原学诊断方法,本研究应用纯化的A型FMDV免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选获得一株稳定分泌单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株5F7.经IFA特异性鉴定,5F7为一株血清型特异性MAb.亚类为IgG1/k.间接ELISA检测杂交瘤细胞上清和腹水抗体效价分别为1:12 800和1:105.硫氰酸盐洗脱法测定其相对亲和力常数为1.5 mol/L.应用该A型特异性MAb及实验室已制备的MAb 3D9初步建立了检测A型FMDV的抗原捕获ELISA方法.该方法可以检出2.0 ng纯化FMDV和1.0×104 TCID50病毒,与O型、Asial型FMDV及牛肠道病毒、牛呼肠孤病毒、牛传染性鼻气管炎病毒等均无交叉反应,组内及组间重复性试验显示变异系数小于8％.本研究建立的抗原捕获ELISA方法为A型FMDV抗原检测提供了一种实用有效的技术手段.     

牛传染性鼻气管炎病毒单克隆抗体的制备及阻断ELISA方法的建立

为建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)血清抗体的阻断ELISA方法,本研究以经蔗糖密度梯度离心法纯化的IBRV作为免疫原制备1株单克隆抗体(MAb),命名为cp-1-1。经间接ELISA、IFA和western blot鉴定,该MAb与IBRV呈阳性反应,与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)及牛副流感病毒3型(BPIV3)呈阴性反应,具有较强的特异性。质谱分析结果显示MAb cp-1-1识别的表位位于IBRV VP8蛋白。以纯化的IBRV作为包被抗原、MAb cp-1-1作为检测抗体,建立检测IBRV血清抗体的阻断ELISA方法。该检测方法的抗原包被量为0.89μg/孔,样品稀释度为12,检测抗体MAb量为1.3μg/孔,二抗稀释度为15000。利用50份IBRV抗体呈弱阳性的牛血清(中和抗体效价为14~116)作为标准参考血清,确定该检测方法的阻断率Cut Off值为52.06%,即阻断率高于52.06%时判为阳性,低于52.06%时判为阴性。阻断ELISA方法特异性试验显示仅IBRV阳性血清检测为阳性,而BVDV、BPIV3、牛腺病毒3型(BADV-3)和O型口蹄疫病毒(O-FMDV)阳性牛血清均检测为阴性,表明该方法具有较强的特异性;该方法可检测的最低中和抗体效价为14,与病毒中和试验的敏感性一致,表明该方法具有较高的敏感性;重复性试验显示该方法批内、批间变异系数均小于10%,显示较好的重复性。对130份现地牛血清检测结果显示,该方法与病毒中和试验的符合率为98.46%。用该方法对某牛场接种IBRV灭活疫苗的牛血清进行检测,抗体阳性率为99.51%(205/206)。另外,采用该方法对我国8个省(市、自治区)的801份牛血清进行检测,IBRV的抗体阳性率为41.6%(333/801)。本研究建立的阻断ELISA方法可以用于IBRV疫苗免疫监测和血清流行病学调查,为我国IBR的防控提供技术支持。     

非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

p54蛋白是非洲猪瘟病毒(ASFV)进入宿主细胞的重要结构蛋白，参与病毒的早期感染，具有较强的免疫原性，常作为研制非洲猪瘟(ASF)疫苗和检测方法的重要靶点。为制备ASFV p54蛋白的单克隆抗体(MAb)，本研究通过构建重组质粒p ET28a-p54并经原核表达重组p54蛋白(rp54)，采用镍柱亲和层析方法对rp54纯化后经SDS-PAGE鉴定。结果显示，rp54主要在沉淀中出现17 ku的目的条带，经纯化效果较好。采用纯化的rp54免疫BALB/c小鼠，三免后采用间接ELISA方法测定小鼠血清的抗体效价。选择抗体效价最高的小鼠冲击免疫，3 d后取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，通过间接ELISA筛选稳定分泌p54蛋白MAb的杂交瘤细胞。结果显示，三免后小鼠血清抗体效价最高达1∶256 000，表明该蛋白的免疫原性很好。间接ELISA筛选结果显示，获得了3株稳定分泌p54蛋白MAb的杂交瘤细胞株。分别采用western blot、间接免疫荧光试验(IFA)检测该3株MAb的反应原性，采用间接ELISA检测3株MAb的特异性。Western blot结果显示，3株MAb均在...     

牛副流感病毒3型抗体间接ELISA检测方法的建立与初步应用

旨在建立牛副流感病毒3型(BPIV3)抗体间接ELISA检测方法。克隆NP-HN截短串联基因并构建原核表达载体pET28a(+)-NP-HN,诱导纯化NP-HN重组蛋白作为包被抗原,优化ELISA反应条件,建立BPIV3抗体间接ELISA检测方法,进一步与病毒中和试验和进口ELISA试剂盒进行比较,应用本方法对270份临床血清样本进行了检测。结果表明,表达的NP-HN重组蛋白大小为44ku,具有良好的反应原性,建立的ELISA检测方法特异性强,与牛的主要呼吸道病原如牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒等均无交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数小于8%,与病毒中和试验和进口商品化ELISA试剂盒的总符合率分别为96.67%和98.89%。对采自山东、辽宁和天津的270份临床血清样本检测后总的阳性率为82.59%(223/270)。建立的BPIV3抗体间接ELISA方法具有较好的特异性和敏感性,可应用于BPIV3的流行病学调查和抗体检测研究。     

山羊地方性鼻内肿瘤病毒MAb的制备及间接ELISA方法的建立

为建立检测山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)的间接ELISA方法，本研究以纯化的ENTV-2免疫BALB/c小鼠，采用间接ELISA方法筛选阳性细胞克隆，经3次克隆纯化后获得1株能够稳定分泌ENTV-2特异性单克隆抗体(MAb)的细胞株，命名为6E4，并采用鼠MAb亚类鉴定试剂盒鉴定6E4 MAb的亚类，结果显示，MAb 6E4的亚类为κ链、Ig G1亚型。进一步以6E4为检测抗体，经各反应条件的优化建立了检测鼻液样品中ENTV-2的间接ELISA方法，该方法的临界值为0.323。利用该方法 检测羊口疮病毒(ORFV)、绵羊肺炎支原体(Movi)、丝状支原体山羊亚种(Mmc)以及纯化的ENTV-2和ENTV-2患病羊鼻液样品，结果显示，除纯化的ENTV-2及ENTV-2患病羊鼻液样品的检测结果呈阳性外，ORFV、Movi、Mmc的检测结果均为阴性，该方法特异性较强。将纯化的ENTV-2 (以蛋白浓度换算) 2倍倍比稀释(20μg/mL～0.08μg/mL)后，利用建立的间接ELISA方法检测，结果显示，纯化的ENTV-2稀释至0.3125μg/mL时检测结果仍可判定为阳性，该方法敏...     

鸡Mx蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

Mx蛋白为GTP酶动态蛋白家族成员,已被证明具有抗禽流感病毒、Thogoto病毒和水泡性口膜炎病毒等的作用.为制备鸡Mx蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究以原核表达并纯化的鸡Mx蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,分离脾细胞与SP2/0细胞融合,采用间接ELISA方法筛选阳性克隆,经3次细胞克隆纯化后获得4株稳定分泌抗鸡Mx蛋白抗体的杂交瘤细胞株.间接ELISA测定4株MAb纯化后腹水的效价介于1∶3.2×104～1∶2.5×105之间.Westem blot结果证实4株MAb均具有良好的反应性;间接免疫荧光试验表明其中一株MAb与真核表达的鸡Mx蛋白发生反应.本研究为鸡Mx蛋白功能及表达鸡Mx蛋白的转基因动物等研究奠定了基础.     

利用真核表达的猪流感病毒NP蛋白制备其特异性的单克隆抗体

为制备猪流感病毒(SIV)核蛋白(NP)单克隆抗体(MAb),本研究将重组质粒pMD-NP中含有的SIVNP基因亚克隆于pCAGGS真核表达质粒中,获得重组质粒pCAGGS-NP,将其转染293T细胞,通过间接免疫荧光(IFA)和western blot检测表明NP蛋白在293T细胞中获得了表达。将pCAGGS-NP以100μg/只剂量免疫4周龄～5周龄BALB/c小鼠,3次免疫后,利用杂交瘤细胞融合技术获得1株稳定分泌抗SIVNP的MAb杂交瘤细胞株(3D7);该MAb经Ig亚类鉴定为IgM,轻链为κ链,其诱导小鼠产生的腹水ELISA效价为1:105;纯化3D7腹水并对其进行亲和力及抗原结合活性的测定,ELISA曲线图显示亲和力常数为1.02×106M-1,IFA结果显示其可与H1N1、H3N2、H9N2亚型SIV发生特异性反应,具有良好的反应活性。该MAb的制备将为进一步建立猪流感的诊断方法以及分析NP蛋白抗原表位等方面的研究奠定基础。     

猪流行性腹泻病毒M蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗M蛋白单克隆抗体(MAb),本研究以截短表达的His-M重组蛋白免疫BALB/c小鼠;以截短表达的GST-M重组蛋白作为包被抗原,采用常规的淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA进行筛选,得到一株稳定分泌抗M蛋白MAb.MAb亚类鉴定为IgG2b型,轻链为к链,杂交瘤细胞培养上清和诱导的小鼠腹水抗体效价分别为1:3000和1:2×105.Western blot试验表明该MAb能够识别重组及天然的PEDV M蛋白.间接免疫荧光试验表明该MAb能够与PEDV感染的Vero E6细胞产生特异性免疫荧光.     

猪毛色遗传的研究进展

本文概述了猪的毛色类型、猪的毛色遗传模式,着重综述了猪毛色基因分子基础的研究进展,指出存在问题并就未来发展方向做了思考。     

不同样本商品蜂蜜中硒含量的测定

用硝酸和高氯酸消化蜂蜜,使硒游离出来,在微酸性环境下,硒和2,3-二氨基萘(DAN)生成有较强荧光的物质,用环己烷萃取,在激发波长378nm,荧光波长518nm处测定其荧光强度。蜂蜜中硒含量范围:0.10～0.82μg/g。表明:蜂蜜应视为天然富硒营养品。     

乳酸杆菌益生作用机制的研究进展

乳酸杆菌作为益生菌广泛用于人和动物。本文综述了乳酸杆菌改善宿主健康的机制。乳酸杆菌可通过产生抗菌物质如乳酸、过氧化氢、细菌素,或者通过竞争营养或肠道黏附位点来抑制致病菌;通过诱导黏附素的分泌或阻止细胞凋亡而增强肠道的屏障功能,从而保护肠道。文章重点讨论了乳酸杆菌表面成分（表面蛋白、脂磷壁酸和肽聚糖）与肠道受体（Ｃ型凝集素受体、Ｔｏｌｌ样受体和 Ｎｏｄ样受体）,阐述了他们结合后启动免疫调节信号,调控肠道免疫功能以发挥改善健康作用的机制。     

Comparison of four techniques of arthrocentesis of the lateral compartment of the femorotibial joint of the horse

Reasons for performing study: Clinical experiences indicate that centesis of the lateral compartment of the femorotibial joint is often unsuccessful. Objective: To determine the accuracy of 2 published and 2 unpublished techniques of centesis of the lateral compartment of the femorotibial joint. Hypothesis: It was hypothesised that a drug can be administered into the lateral compartment of the femorotibial joint via a diverticulum of this joint that surrounds the medial aspect of the long digital extensor tendon and that this technique is more accurate than described techniques of centesis of this compartment. Methods: Twenty‐four stifles of 12 horses were divided equally into 4 groups and a radiocontrast medium injected into the lateral compartment of the femorotibial joint of each group using a hypodermic needle inserted: 1) caudal to the lateral patellar ligament and proximal to the tibial plateau, 2) caudal to the long digital extensor tendon and proximal to the tibial plateau, 3) between the long digital extensor tendon and bone of the extensor groove of the tibia or 4) directly through the long digital extensor tendon until it contacted bone. Twelve veterinary students who had no experience using any of these techniques performed the injections. Accuracy of each technique was determined by examining radiographs obtained after injecting the contrast medium. Results: The most successful technique for arthrocentesis was by inserting a needle through the long digital extensor tendon. This approach was successful in all attempted cases, whilst other techniques had lower rates of success. Conclusions: The lateral compartment of the femorotibial joint can be accessed accurately by inserting a needle through the long digital extensor tendon as it lies within the extensor groove. Other techniques may not be as accurate for clinicians inexperienced in arthrocentesis of the lateral compartment of the femorotibial joint.     

商会自治的基石——商会自治规范研究

在现代法律秩序中,商会自治规范是制定法的基础和必要的补充,甚至在某些方面替代了制定法;商会自治规范主要包括商会组织规范、行为规范、惩罚规范以及争端解决规范等;其效力仅及于其内部成员;商会自治规范和制定法之间存在冲突,但也存在整合的基础。     

鸡败血支原体垂直传播模式及其阻断方法

以国际标准强毒Ｒ株人工感染非免疫产蛋鸡,定时扑杀,分别从鼻窦、眶下孔、气管、肺、气囊、卵巢和输卵管分离ＭＧ,并收集感染鸡所产蛋分离ＭＧ。结果表明,人工感染４８小时后上、下呼吸道及肺已被全面感染,９６小时气囊已被感染,１２０小时输卵管已能分离到ＭＧ,卵巢始终分离不到ＭＧ。人工感染鸡自１４４小时便能在其所产蛋中分离出ＭＧ。药物治疗能在７２小时内消除感染,油乳剂苗则需２４天后逐渐降低蛋内ＭＧ分离率,药物卵内注射、种蛋药浴、高温处理均能杀死卵内ＭＧ,但以研制的种蛋浸泡剂药浴效果为最好。     

Prevalence of diseases of the spinal cord of cats

A retrospective review of records of 205 cats with histologically confirmed disease of the spinal cord was performed to identify the prevalence of disease in this nonrandomly selected population of cats. Clinical records were reviewed, and age, duration of neurologic illness, and clinical and histopathologic findings in cats with spinal cord disease were abstracted. Disease processes were classified into 7 categories and 23 groups. The most common diseases affecting the spinal cord of cats were feline infectious peritonitis (FIP), lymphosarcoma (LSA), and neoplasia of the vertebral column secondarily affecting the spinal cord. Information on age, onset and duration of clinical signs, and lesion localization at the postmortem examination in cats belonging to the 7 categories of disease were analyzed to create a practical list of differential diagnoses. Cats were also subcategorized into 3 groups based on their age at death. FIP was the most common disease of cats younger than 2 years of age. LSA and vertebral column neoplasia were the most common diseases affecting cats between 2 and 8 years of age. Vertebral column neoplasia was the most common disease affecting cats older than 8 years of age. Results of this histopathologic study showed that FIP and LSA were the most common disease processes affecting the spinal cord of cats. However, at least 21 other groups of diseases and their relative prevalence were identified.     

高效液相色谱法测定鸡肉中土霉素残留量的不确定度评定

根据JJF1059-1999《测量不确定度评定与表示》建立了高效液相色谱法测定鸡肉中土霉素残留测量的不确定度评定方法,评定过程包括建立测量程序、分析不确定度来源、对不确定度分量进行量化。将不确定度归类为两大类。随机效应导致的不确定度可以通过一系列具有统计意义的重复观测值进行A类评定;系统效应导致的不确定度通过各测量器具、设备的说明书、校准证书提供的参数进行B类评定。本方法鸡肉中土霉素残留量的相对合成标准不确定度约为3.9%。     

几个柑橘品种实生苗的抗旱性评价研究

以5个金柑属品种、枳壳、软枝酸橘及广西土柠檬实生苗为材料,进行复水成活率、旱害指数、叶片相对含水量、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、脯氨酸等生理指标及隶属函数的综合分析,为柑橘抗性砧木品种选育提供参考。结果表明：胁迫20d复水后的成活率融安滑皮金柑和长寿金柑最高,为100%,软枝酸橘最低,为88.9%;随着干旱胁迫加剧,各品种的旱害指数呈上升趋势,长寿金柑的旱害指数最低,为0.25,软枝酸橘的旱害指数最高,为0.61;从叶片相对含水量的结果来看,长寿金柑的变化幅度最小,软枝酸橘的变化幅度最大,在第18d时分别为61.19%和37.85%;3种保护酶之间相互协同作用减轻植株受害程度,其活性变化幅度与丙二醛和脯氨酸的含量变化相似。利用隶属函数法综合分析,得出各品种的抗旱性强弱依次为长寿金柑>枳壳>融安滑皮金柑>融安金柑>山金柑>广西土柠檬>金枣>软枝酸橘。     

两种绿头鸭肌肉营养成分分析及评价

本试验旨在研究两种绿头鸭（白羽绿头鸭和绿头鸭）肌肉营养组成和价值,为绿头鸭肉产品的开发利用提供基础数据和理论依据。选择白羽绿头鸭和绿头鸭60只（每个品种各30只,公母各半）,依照国家标准测定胸肌粗蛋白质、粗脂肪、胆固醇含量及氨基酸、脂肪酸、微量元素和维生素的组成和含量,并对胸肌进行氨基酸评价及脂肪酸营养价值评价。结果显示,白羽绿头鸭肌肉粗蛋白质含量显著低于绿头鸭（P<0.05）;两种绿头鸭肌肉中均检测到17种含量大于0.01%的氨基酸,其中白羽绿头鸭肌肉苏氨酸、组氨酸、丝氨酸和脯氨酸含量显著高于绿头鸭（P<0.05）,赖氨酸、谷氨酸和精氨酸含量显著低于绿头鸭（P<0.05）;检测到13种含量均大于0.01%的脂肪酸,其中白羽绿头鸭硬脂酸和油酸含量显著低于绿头鸭（P<0.05）;检测到9种矿物质元素（钠、镁、钾、钙、锰、铁、铜、锌和硒）,两种绿头鸭差异不显著（P>0.05）;检测到8种维生素,白羽绿头鸭肌肉维生素B₁含量显著高于绿头鸭（P<0.05）,维生素D和维生素E含量显著低于绿头鸭（P<0.05）。两种绿头鸭肌肉氨基酸比例接近世卫组织推荐的理想模式,富含人体所需的矿物质元素和维生素,具有广阔的开发利用前景。