靶向传染性法氏囊病病毒VP1基因siRNA对病毒复制的抑制

根据传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP1基因保守区序列,选择设计了3个靶向VP1的小干扰RNA序列（siR-NA）：VP1-siRNA668、VP1-siRNA1034和VP1-siRNA2250,化学合成DNA序列,体外转录合成siRNA,转染鸡胚成纤维细胞（CEF）后接种IBDV,分析siRNA对病毒复制的影响。结果显示,病毒接种后72h,3个VP1-siRNA转染组未出现明显的细胞病变（CPE）,病毒滴度分别为102.75,102.00,101.75 TCID50/0.1mL,而siRNACON转染和单纯IBDV接种对照组均出现明显CPE,病毒滴度均为106 TCID50/0.1mL;用荧光定量RT-PCR分析VP1基因水平,3个VP1-siRNA转染组比对照组分别降低了73.10%,81.79%,90.28%。结果表明,本试验选择设计的3个siRNA具有明显抑制IBDV复制功能,其中2 250位点的siRNA抑制效果最明显,推测该区域是VP1基因的重要功能区,是新型抗IBDV药物与疫苗设计的重要靶标。     

表达传染性法氏囊病病毒VP2基因的重组鸡痘病毒的构建及其免疫保护性研究

以脂质体转染技术构建了表达鸡传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）ＶＰ２基因的重组鸡痘病毒ＦＰＶ－ＶＰ２，该病毒在鸡胚成纤维细胞及鸡体内均能稳定产生子代病毒，经翅皮下５×１０５ＰＦＵ／羽免疫１日龄ＳＰＦ鸡，免疫后４周以１００ＬＤ５０／羽ＩＢＤＶ超强毒株Ｇ株攻毒，获得了５／６的保护，但不能有效预防临床发病及法氏囊受损萎缩。实验结果证明了ＶＰ２是ＩＢＤＶ的宿主保护性抗原，提示Ｔ细胞介导的免疫可能在ＩＢＤＶ的免疫中起着较为重要的作用。本研究为ＩＢＤＶ重组病毒疫苗研制进行了有益探索。     

四株鸡传染性法氏囊病病毒毒力的研究

对从黑龙江省分离的４株鸡传染性法氏囊病病毒通过易感鸡接种,用病理学技术进行了致病力的研究。结果表明,各毒株毒力有一定差异,基保Ｈ３,Ｈ４株毒力高于Ｈ１,Ｈ２株,且有迅速致法氏囊萎缩的特性;Ｈ３,Ｈ４株引起试验鸡法氏囊指数显著下降（Ｐ〈０．０５）,脾脏指数明显增加（Ｐ〈０．０５）,Ｈ３,Ｈ４株接种５０日龄Ｄ７８疫苗免疫病,免疫保护指数分别为５０％,６０％,传统疫苗不能提供以分保护。     

鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因突变对病毒体外复制的影响

为了进一步了解影响鸡传染性法氏囊病病毒( IBDV)复制效率和致病力的分子基础,作者在序列分析的基础上,利用反向遗传操作技术,针对VP2上2个重要的氨基酸位点(222和279),修饰和拯救了相应的2株突变病毒,并研究了突变病毒在体内外的生物学特性.复制动力学数据显示,VP2的222位由酪氨酸突变为脯氨酸可将IBDV在鸡胚成纤维细胞(CEF)上的复制滴度提高6倍以上,而279位氨基酸对病毒复制效率无显著影响.SPF鸡的感染试验显示,222位和279位氨基酸与IBDV的致病力没有关系.本研究首次报道了VP2 222位和279位氨基酸与IBDV复制效率和致病力的关系,有助于更加全面地了解IBDV的基因功能,也将为新型IBDV疫苗的设计提供依据和思路.     

鸡传染性法氏囊病TL株VP2基因克隆及部分特性分析

传染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease Virus IBDV）是引起禽免疫抑制性疾病的一种主要病原体，属于双链RNA病毒科，禽双节段RNA病毒属成员。其基因组由两个节段dsRNA（A、B）构成，大片段A长约3．4kb，编码一条多聚蛋白，该蛋白随后裂解为VP2、VP3和VP4。小片段B长约为2．9kb，编码VP1。其中VP2携带宿主保护性抗原决定簇，具有至少两到三个中和性抗原位点，可以诱导产生保护性中和抗体，并且有血清型特异性。Ⅰ型IBDV毒株的VP2cDNA核苷酸及相应氨基酸残基序列中，共同存在着一个高度可变区（AccⅠ～SpeⅠ）含有两个亲水区和一个七肽区。     

鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的融合表达及兔抗血清的制备

以鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)Gt株基因组RNA为模板,通过RT-PCR扩增VP2基因,经EcoR Ⅰ/Sal Ⅰ酶双酶切处理后与经相同酶切处理的pET30a原核表达载体连接,将酶切、PCR及序列鉴定正确的阳性重组子转化E. coli DE3菌,经IPTG诱导,表达的VP2蛋白通过Ni-NTA树脂纯化后,免疫新西兰白兔,制备兔抗血清,并对其进行间接ELISA、IFA和Western blot分析.SDS-PAGE分析表明,在IVFG诱导下成功表达了约为50 kDa的His-VP2融合蛋白;间接ELISA检测制备的兔抗血清效价在1:25 600以上;IFA及Western-blot分析结果表明,其可特异性结合真核表达的VP2蛋白以及IBDV全病毒.研究结果提示,免抗VP2血清可用于VP2蛋白及病毒的检测,为进一步研究IBDV分子生物学功能提供了物质基础.     

单克隆抗体在鸡传染性法氏囊病病毒研究中的应用

自１９７５年Ｋｏｈｌｅｒ和Ｍｉｌｓｔｅｉｎ发明淋巴细胞杂交瘤技术以来,单克隆抗体（ＭＡｂ）已对生物学诸学科的发展产生了巨大影响。同样,ＭＡｂ在鸡传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）的研究中也已得到广泛应用,特别是１９８５年以后,ＭＡｂ在ＩＢＤＶ结构蛋白作用...     

鸡传染性法氏囊病病毒变异的分子生物学研究进展

鸡传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的鸡和火鸡的一种急性、高度接触性传染病.     

鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的可溶性表达及其免疫原性研究

VP2蛋白是鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的主要结构蛋白及保护性抗原,为了研究原核表达的IBDV VP2可溶性蛋白的免疫原性,从IBDV超强毒SD株克隆出VP2基因,将其克隆于pET-30a原核表达质粒,并转化至大肠杆菌菌株BL21中,诱导表达后,经SDS-PAGE及Western blot分析,发现在37 kDa处出现特异性蛋白条带,与预期结果一致,且大部分VP2蛋白存在于菌液上清液中。经诱导条件的优化,菌液上清液表达的VP2蛋白琼脂扩散(AGP)效价可达1∶16。用不同AGP效价的VP2蛋白乳化配苗,免疫SPF鸡,免疫后21 d,进行AGP抗体效价测定及攻毒保护试验,发现VP2蛋白以AGP效价不低于1∶8配苗,免疫鸡用超强毒SD株及经典株BC6/85株攻毒,保护率均为10/10。结果表明,成功获得了表达VP2可溶性蛋白的基因工程表达菌BL21-VP2,且表达的VP2蛋白具有良好的免疫原性,为IBDV基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

Reduction of infectious bursal disease virus replication by shRNAs targeting the VP1 and VP2 genes driven by chicken U6 promoter

Infectious bursal disease virus (IBDV) causes a highly contagious and immunosuppressive disease in young chickens and results in considerable economic losses for the poultry industry. To suppress the replication of IBDV, two short hairpin RNAs (shRNAs) were designed for targeting the VP1 and VP2 genes of IBDV. Recombinant plasmids carrying each shRNA or two shRNAs were constructed based on vector pSilencer2.1-U6 in which the human U6 promoter was replaced with chicken U6 promoter. In chicken embryo fibroblasts, transfection with these shRNA plasmids 24 h before infection with IBDV B87 reduced 50% tissue culture infectious doses (TCID₅₀) from 10^8.75 TCID₅₀/0.1 mL to 10^3.75–10^1.0 TCID₅₀/0.1 mL. In 10-day old specific pathogen-free (SPF) chicken embryos, incubation with a mixture of IBDV B87 and a shRNA plasmid via the allantoic cavity resulted in 100% mortality and high IBDV virus titer in the control group but 25–0% mortality and near normal embryo development in the specific shRNA groups; additionally, IBDV VP1 and VP2 mRNA levels were reduced by 72–95% in the shRNA groups as compared with the control groups. When challenged with a virulent strain IBDV GX8/99, 14-day-old chickens pre-treated with the single shRNA plasmids or the dual shRNA plasmid showed approximately 70% or 90% survival at 5 days post-challenge while those pre-treated with control plasmid or saline had less than 5% survival. The current study suggests that two IBDV shRNAs expressed by a plasmid under chicken U6 promoter could effectively and synergistically reduce IBDV replication in vitro and in vivo.     

鸡传染性腔上囊病病毒VP2基因在昆虫细胞中的表达

为了深入研究鸡传染性腔上囊病病毒（IBDV）VP2基因的结构和功能,利用Bac-to-Bac系统研制出含有VP2基因的重组杆状病毒rBac-VP2,将rBac-VP2感染Sf9细胞,并用抗IBDV VP2特异性单克隆抗体经间接免疫荧光试验检测,证实感染重组病毒Sf9细胞能高效表达IBDV VP2基因产物;Western-blotting分析结果表明,VP2基因表达产物的分子质量约为40 ku.     

传染性法氏囊病病毒VP2与C3d串联基因重组表达质粒的构建及其免疫功能研究

为提高传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因核酸疫苗的免疫效力,本研究根据已发表的鸡源补体C3d序列,设计并合成在5’端添加编码连接肽(Gly4Ser)2序列的C3d基因。用同尾酶BglⅡ和BamHⅠ构建含有3拷贝C3d与VP2基因融合的重组表达质粒pcDNA-VP2-3C3d。用脂质体法转染BHK21细胞,48 h后,westernblot分析表明,表达的重组蛋白为162 ku;间接免疫荧光试验检测转染细胞中具有特异性荧光。用pcDNA-VP2-3C3d与前期构建的pcDNA-VP2分别免疫2周龄SPF鸡,二免14 d后,间接ELISA法检测IBDV抗体效价,pcDNA-VP2-3C3d组抗体水平显著高于pcDNA-VP2组;MTT法检测鸡脾淋巴细胞增殖活性,pcDNA-VP2-3C3d组免疫诱导的特异性淋巴细胞增殖活性显著高于pcDNA-VP2组(p<0.05)。本研究表明C3d可以增强VP2基因免疫诱导的IBDV特异性体液和细胞免疫应答。     

鸡传染性法氏囊病病毒DK株VP2基因序列分析及其对SPF雏鸡的致病力

为探究鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)DK分离株的致病性和遗传变异情况,本研究测定了该分离株的鸡胚半数致死量(ELD50)、对SFP雏鸡的致病力以及扩增病毒的VP2基因并分析其序列。结果显示,DK分离株对鸡胚的ELD50为104.5/0.2mL,以2×10^3ELD50剂量感染SFP雏鸡出现典型IBD的临床症状、剖检和组织学病变;实验鸡发病率为100%,致死率为44.4%;DK株VP2基因序列与参考株的同源性为93.1%~97.0%、氨基酸序列同源性为93.6%~97.5%,其基因序列和氨基酸序列均与Cu-1wt参考株(经典株)同源性最高;DK株VP2氨基酸序列的七肽区SASWSGS及249Q、253Q、279D、284A、290M、313V、330S氨基酸位点均与强毒株的氨基酸位点一致;但其222P、256V、299N3个氨基酸不符合IBDV超强毒株的特征;而其第222、249位氨基酸为P和Q,与抗原变异株(vIBDV)的T和K也不相同。结果表明:IBDVDK株为中等偏强毒力病毒。本研究为IBD的防控提供参考依据。     

鸡传染性法氏囊病病毒vp2基因在杆状病毒表达系统中的表达及免疫原性研究

将鸡传染性法氏囊病病毒超强毒Gx株vp2基因克隆到载体pFastBac HTA中,构建重组转座载体pFVP2,然后将其转化DH10Bac感受态大肠杆菌,将vp2基因整合到Bacmid穿梭载体中,获得重组穿梭载体BacmidVP2;通过脂质体转染将其转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacVP2。用Western blot和间接免疫荧光试验分析表明IBDV VP2蛋白在Sf9昆虫细胞获得正确表达,所表达的重组VP2蛋白分子量约50 Ku。以rBacVP2感染Sf9细胞裂解物免疫3周龄SPF鸡,在免疫后7 d可检测到ELISA抗体;免疫后14 d可检测到琼脂免疫扩散抗体。攻毒试验表明,初次免疫后14 d对IBDV超强毒株的攻击保护率为75%,2次免疫后14 d对其的攻击保护率为100%。     

Molecular characterization of two Bangladeshi infectious bursal disease virus isolates using the hypervariable sequence of VP2 as a genetic marker

Two Bangladeshi infectious bursal disease virus (IBDV) isolates collected in 2007, termed GB1 and GB3, were subjected to comparative sequencing and phylogenetic analyses. Sequence analysis of a 474-bp hypervariable region in the VP2 gene revealed that among four major amino acid substitutions observed in the strains, two were unique to GB1 and GB3 (Ser217Leu and Ala270Thr) while one substitution was only found in GB1 (Asn299Ser). Among IBDVs from Bangladesh including GB1 and GB3, the rate of identity and homology was around 97~99%. The amino acid sequences of GB1 and GB3 differ from those of previous Bangladeshi IBDV isolates and contain amino acid substitutions Pro222Ala and Asn299Ser (in GB3 only). Phylogenetic analysis revealed that GB1 and GB3 are grouped with other very virulent IBDVs of European and American origin in contrast to two previously isolated Bangladeshi IBDV strains (GenBank accession Nos. {"type":"entrez-nucleotide","attrs":{"text":"AF362776","term_id":"14582985","term_text":"AF362776"}}AF362776 and {"type":"entrez-nucleotide","attrs":{"text":"AF260317","term_id":"13957666","term_text":"AF260317"}}AF260317), which belong to the Asian group. It was concluded that GB1 and GB3 belong to a very virulent group of IBDVs. However, amino acid sequences of GB1 and GB3 differ from those of the other Bangladeshi IBDVs by one or two amino acids encoded in the hypervariable region of the VP2 gene.     

鸡传染性法氏囊病病毒地方流行毒株的免疫原性

从河北省一些发病鸡场分离到JD1～JD10共10株鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)毒株,用IBD标准阳性血清以琼扩试验进行了初步鉴定.并进行了IBDV分离物及其鸡胚适应毒免疫原对标准强毒IBDV-BC6/85株免疫保护试验,D78弱毒疫苗对IBDV各分离毒株的免疫保护试验以及分离毒株间交互免疫保护试验.结果表明,D78疫苗对JD2,JD5和JD10 IBDV分离株的保护率较低,分别为40%、50%和60%.分离毒株JD5、JD2及其鸡胚传代物E-JD2对强毒株的免疫保护率可达100%.交互免疫保护试验表明,JD2对其余各分离株的免疫保护指数达到80%以上,对标准强毒株和地方分离株均可产生有效免疫保护.     

传染性法氏囊病病毒株VP2基因在重组腺病毒中的表达

用RT-PCR方法从传染性法氏囊病(IBD)免疫预防失败的病鸡法氏囊组织AH1与AH2中扩增传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因。序列分析结果显示,AH1与AH2病毒VP2基因长度均为1350nt,编码450aa,核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为98.2%、99.3%,七肽基序均为SWSASGS,在222、253、256、279、284、294和299位上的氨基酸残基分别是A、Q、I、D、A、I和S,具有IBDV强毒的分子特征。进一步将VP2基因克隆入人5型腺病毒穿梭载体(pShuttle-CMV),与腺病毒骨架载体(pAdEasyTM)共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组并转染HEK-293A细胞,经多次亚克隆获得了重组腺病毒rAd-(IBDV)VP2。利用Western-blot、IFA等方法检测IBDVVP2蛋白的体外表达情况,结果证明VP2基因在腺病毒中获得了表达。     

IBDV H1株VP2基因的原核表达及其产物的复性

应用RT-PCR技术从传染性腔上囊病病鸡总RNA中克隆出1461bp的VP2基因，将其克隆于pET-28a载体，筛选并构建了pVP2表达载体。经IPTG诱导，在其宿主菌BL21（DE3）中成功表达了53．7ku的蛋白，SDS-PAGE和Western-blotting分析结果显示，VP2表达产物以包涵体形式存在，可与鸡IBDV抗血清及1株IBDV单抗发生特异性反应。将VP2表达产物进行纯化和复性，用复性前后的蛋白分别与特异性多抗进行Dot-ELISA检测，结果，复性后蛋白的反应活性比复性前增强了10倍；用复性后的蛋白与IBDV单抗进行Dot-ELISA，结果显示，VP2蛋白与单抗1H4、1E12、583、EA6、3c7反应强（＋＋＋）；与4E4、1H11反应中度（＋＋）；与4E5、3C4、1E11、3H9反应较弱；而与EC6、3D12、1A1无反应。