猪A群轮状病毒BJ株的分离与鉴定

轮状病毒是引起幼龄动物和儿童病毒性腹泻的主要病原,轮状病毒的分离鉴定为该病的流行病学调查和分子生物学特性研究奠定了基础。本研究采集北京某猪场腹泻发病仔猪肠内容物,将其接种MA104细胞,分离得到一株能产生明显细胞病变的病毒。对分离毒株进行胶体金、实时荧光定量RT-PCR和免疫荧光等方法鉴定,并对分离毒株的VP4、VP6和VP7基因进行测序及序列分析。结果表明,分离毒株为猪A群轮状病毒。按照A群轮状病毒的最新分类方法,确定该分离株VP4、VP6和VP7基因的基因型分别为P[13]型、I5型和G11型。因此,将该分离株命名为Rotavirus A pig/China/BJ/2015/G11P[13]。     

猪A群轮状病毒的分离与鉴定

目前国内对猪轮状病毒的研究较少,作者旨在对猪A群轮状病毒进行分离与鉴定,为后续猪轮状病毒致病机理和分子生物学特性研究奠定基础.用胰蛋白酶处理RT-PCR检测猪A群轮状病毒病原阳性的临床腹泻粪样,然后接种长成单层的MA-104细胞,进行病毒分离传代.再对分离毒株进行常规RT-PCR鉴定和电镜观察,并对分离毒株的VP6、VP7和VP8基因进行测序及序列分析.结果成功分离猪A群轮状病毒TM-a株,经序列同源性分析发现,与TM-a株VP6、VP7和VP8基因同源性最高的毒株分别为中国北京人源LL3354株、印度人源RMC321株和日本野猪源GUB-71株,其相似性为96.0％、95.1％和97.0％.该TM-a株轮状病毒不同基因表现出与人源轮状病毒和猪源轮状病毒的高度同源性,推测猪A群轮状病毒可能在人畜间传播,发生基因重组现象.     

仔猪感染猪轮状病毒的鉴定及基因分析

为弄清2013年年初上海某猪场发生的仔猪腹泻疫情病因,本研究随机采集发病猪场的仔猪腹泻样品9份,利用RT-PCR方法对采集样品进行病原检测。结果显示,9份临床样品中有4份为猪轮状病毒阳性,而猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒均为阴性。根据GenBank公布的猪轮状病毒参考株序列设计两对引物,对其中阳性样品的VP6和VP7基因进行RT-PCR扩增、基因克隆和序列测定分析。结果显示,4份阳性样品的VP6基因大小为1356 bp,VP7基因大小为1100 bp;序列分析结果显示,VP6基因与A群代表株OSU的氨基酸同源性为64.1%~87.0%,与代表株Gottfriend的氨基酸同源性为26.3%~60.8%;VP7基因与不同G型代表株的氨基酸同源性为71.8%~97.3%。根据上述结果分析,我们推测引起此次仔猪腹泻疫情中的主要病原是由属于A群G9血清型的猪轮状病毒引起,本研究为此次仔猪腹泻疫情的诊断提供了依据。     

G8P[1]型牛轮状病毒的分离鉴定及序列分析

为了对大庆地区患有腹泻疾病的舍饲牛进行病原鉴定,通过RT-PCR方法对病料进行检测,将轮状病毒阳性样品接种MA104细胞进行病毒分离,扩增分离株VP7、VP4片段,将扩增产物纯化后连接在pMD18-T载体上,转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞中进行亚克隆,将鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定,并利用DNA Star与GenBank上的参考序列进行同源性分析。结果表明,从样品中分离到1株BRV毒株,将其命名NX23。核苷酸序列分析表明,分离株NX23属于G8P[1]型轮状病毒,确认了G8P[1]型牛轮状病毒在我国的流行,为我国BRV分子进化及其RV分子流行病学的进一步研究奠定基础。     

一株猪轮状病毒的分离与鉴定

将1份经RT-PCR检测猪轮状病毒阳性的临床腹泻粪样感染Vero细胞,连续盲传8代,出现病变,成功分离到1株病毒,经RT-PCR检验和电镜观察,鉴定该病毒为轮状病毒,命名为GD-01-2015。扩增该病毒的VP4和VP7基因进行分型和系统进化分析,结果发现,其VP4基因为P[7]型,与来自韩国的猪源毒株K71同源性达到99.8%;其VP7基因为G5型,与来自韩国的猪源毒株06-6-1同源性达到99.7%。由此可以推测GD-01-2015株与韩国猪源毒株有相似的进化来源。根据轮状病毒分类委员会(RCWG)提出的A群轮状病毒的最新分类方法,GD-01-2015株基因型为G5P[7]。本研究为监测轮状病毒的流行状况及其疫苗的研制提供了理论依据。     

猪轮状病毒分离与鉴定

采用MA104细胞从广东省某猪场患有明显腹泻症状的仔猪粪便中分离了1株产生明显细胞病变(CPE)的病毒。电镜观察显示,病毒粒子呈现较为典型的轮状病毒的形态特征;对其VP6基因进行序列分析,结果表明该分离株与A群猪轮状病毒代表株OSU和Gottfried的核苷酸同源分别为86.3%和80.8%,氨基酸序列同源性分别为97.7%和93.2%。综合所见,所分离的毒株为A群猪轮状病毒。     

猪A群轮状病毒Hu B2020株的分离与基因型分析

本研究采集湖北省某猪场腹泻发病仔猪的肠道内容物,并对其进行分离与遗传进化分析。将病样接种MA-104细胞,分离获得1株能产生明显细胞病变的病毒,命名为HuB2020。对分离毒株进行多重RT-PCR方法检测,并对分离毒株的VP6和VP7基因进行扩增测序及遗传进化分析。结果表明,HuB2020分离株为猪A群轮状病毒,VP6基因（I5型）与山东分离株DZ-1的同源性最高（97.82%）;VP7基因（G9型）与四川分离株SWU-1C的同源性最高（95.51%）。近几年,猪轮状病毒的G9基因型增多,该病有再次流行暴发的潜在威胁。     

猪A群轮状病毒GZAS2020株与NX疫苗株的差异性分析

为比较实验室分离保存的猪轮状病毒田间株(GZAS2020株)与猪三联腹泻活疫苗NX株的差异，参照已发表的A群猪轮状病毒VP4、VP6、VP7序列设计合成3对扩增全基因的通用引物，分别克隆测序GZAS2020株和NX株的VP4、VP6、VP7全基因。采用DNAStar对GZAS2020株和NX株VP4、VP6、VP7这3个主要基因进行核苷酸、氨基酸同源性分析以及遗传进化树构建，结果显示，GZAS2020株与NX株VP4、VP6、VP7基因核苷酸同源性分别为75.2%、90.0%和79.4%,氨基酸同源性分别为78.5%、74.1%和82.4%,根据G/P分类命名法，GZAS2020株属于G5P[13]。与NX疫苗毒株相比，GZAS2020株的VP4基因在359、360、750 bp处存在C、A、C碱基的缺失，在347、348、570、571、572、579、580、581、757 bp处分别插入了C、C、C、A、A、G、G、G、C碱基；VP6基因不存在插入和缺失；VP7基因在258、1 029 bp处分别存在T、A碱基的插入，266 bp处存在1个C碱基的缺失。结果表明，GZAS2020...     

猪轮状病毒中国分离株JL94 VP7基因的克隆与序列分析

用MA104细胞培养增殖了轮状病毒地方分离株JL94,利用一对根据Genebank中已发表的轮状病毒VP7基因cDNA序列而设计并合成的引物，通过反转录-聚合酶链反应(RT—PCR)从JL94毒株扩增出VP7基因全长cDNA。将其插人pMD18-T载体中，构建了重组质粒pMD18-T—JL94／VP7，并对其进行了Hind Ⅲ，HindⅡ和BamH I的单、双酶切初步鉴定及其核苷酸序列测定，证明克隆的pMD18-T—JL94／VP7为轮状病毒的VP7基因。通过核苷酸序列比较，JL94／VP7与A群猪轮状病毒C134／VP7、OSU／VP7、ICB2185／VP7、YM／VP7核苷酸序列同源性分别为87％、99％、74％和83％。     

猪轮状病毒江西株AY01的分离鉴定

【目的】确定江西省某猪场哺乳仔猪发生腹泻的病因。【方法】对送检的仔猪小肠样品进行猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)的RT-PCR检测,将阳性样品接种MA104细胞传代进行PoRV的分离;对分离毒株进行电镜观察、间接免疫荧光试验、PoRV VP4和VP7基因序列测序和动物回归等试验。【结果】猪小肠病料样品经终浓度15 μg/mL的胰酶处理37 ℃孵育2 h,接种MA104细胞,能在细胞上增殖传代,第6代开始表现稳定的细胞病变;电镜观察可见病毒粒子直径大小为61~70 nm,平均大小为65 nm,呈带有短纤突且外缘光滑的形似车轮状的粒子,具有轮状病毒粒子典型的形态特征;间接免疫荧光试验和RT-PCR检测均为PoRV阳性,确定该分离株为PoRV。分离株VP4和VP7基因序列分析显示,VP4基因型与P[23]基因型相似性最高,VP7基因型与G5基因型相似性最高,根据A群轮状病毒最新分类方法,分离株属于G5P[23]型。动物回归试验结果显示,经口感染该分离株的1日龄初生仔猪于感染后24 h左右陆续出现水样腹泻、呕吐等临床症状,并能在粪便中检测到PoRV。【结论】通过MA104细胞连续传代,从江西某猪场的腹泻仔猪小肠样品成功分离到1株PoRV,该分离株属于G5P[23]型PoRV,为哺乳仔猪发生腹泻的病原。     

猪流行性腹泻病毒CH/GX/2015/750A株的分离鉴定及全基因组序列分析

本研究旨在获得可在细胞培养中稳定、有效生长增殖的猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）分离毒株,并对其全基因组序列进行测定分析。应用Vero细胞从广西腹泻仔猪肠道内容物中进行病毒分离,通过细胞病变和RT-PCR对细胞培养物进行鉴定,应用下一代测序技术对分离毒株全基因组序列进行测定。结果显示,成功分离到1株PEDV,命名为CH/GX/2015/750A。该毒株可稳定有效地在Vero细胞生长增殖,并引起典型的细胞病变;已在Vero细胞连续传代25代,病毒滴度随着传代次数的增加逐渐提高并稳定在10^7.50TCID₅₀/mL。该毒株全基因组序列长28 038 bp;与22个参考毒株的全基因序列比对显示,核苷酸同源性为96.8%~99.8%,其中与YC2014株同源性最高,为99.8%。全基因组和S基因系统进化分析显示,PEDV CH/GX/2015/750A分离毒株属于Ⅱa亚群,与YC2014、PEDV-WS等变异毒株亲缘关系密切。结果表明,本研究分离获得的CH/GX/2015/750A毒株是PEDV地方流行变异毒株。     

仔猪高死亡率腹泻病因探讨

2010年4月以来,全国各地先后出现高死亡率吮乳仔猪腹泻,以冬春寒冷季节多发、持续时间长、高死亡率为特征,日龄越小死亡率越高,用药物及生物制剂均无法有效控制,给养殖业带来巨大的经济损失。按照流行性腹泻病毒感染、霉菌毒素及中毒等采取相应的防治措施,效果均不明显。按中兽医整体观念、辨证论治,将两方面病因有机结合起来,分析该疾病的病理机制,采用中药复方进行临床验证,取得较好的防治效果,为该病的预防和治疗提供了新的思路与方法。     

猪流行性腹泻病毒LJB/03株的分离及膜蛋白基因的原核表达

猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（Swine transmissible gastroenteritis virus，TGEV）同属于冠状病毒属的成员，主要引起2周龄仔猪以呕吐、腹泻、脱水为特征的一种急性病毒性传染病，死亡率达100％，已成为世界范围内猪的重要疫病之一。从病毒粒子形态、临床症状、病理变化和流行病学等方面无法区分两种病毒。国内外对两病的防制开展了大量的工作，但对于分子生物学诊断方面研究的较少。传统方法如电镜观察、病毒分离培养等不能有效地将TGEV与PEDV区分开，现代分子免疫学和分子生物学等的进展为新一代生物工程诊断试剂的研制开辟了新途径。     

Single and mixed infections of neonatal pigs with rotaviruses and enteroviruses: clinical signs and microscopic lesions.

Neonatal colostrum-deprived pigs were inoculated with cell-culture preparations of three rotaviruses and three enteroviruses, singly or in combination. The three enteroviruses established intestinal and systemic infection but did not induce diarrhea or intestinal lesions. The three rotaviruses produced severe enteric disease characterized by profuse watery diarrhea, dehydration and death. Villi were severely stunted. All three isolates were equally virulent. Inoculation with three different rotavirus-enterovirus combinations resulted in disease less severe than that produced by the rotaviruses alone. Intestinal lesions were less extensive and fewer pigs became moribund or died.     

Single and mixed infections of neonatal pigs with rotaviruses and enteroviruses: virological studies.

Three rotaviruses and three enteroviruses were isolated from pigs with diarrhea. The three enteroviruses and one of the rotaviruses were recovered from pigs infected with both viruses. Separation of rotaviruses and enteroviruses from tissues containing both viruses was effected by pancreatin treatment, terminal dilution, and inoculation onto different cell lines. The three rotaviruses were group A serotype 1, and the enteroviruses were serotypes 2, 3 and 7. Cell culture preparations of these six viruses were inoculated into colostrum-deprived neonatal pigs. All of the rotavirus and enterovirus isolates established intestinal and systemic infection and were shed in the feces after oral inoculation. Concurrent infection with both viruses resulted in only minor alteration of systemic distribution and did not alter fecal shedding of either virus.     

新生仔猪大批死亡疫情诊断及HP-PRRSV的分离鉴定

本试验通过对高发病率、高死亡率的新生仔猪腹泻病例进行诊断与控制,以期为该病的防控提供参考和借鉴.2013年1月初广西玉林某规模猪场发生以2~3日龄仔猪腹泻、呕吐、精神不振为主的疫情,发病率80%,死亡率80%~100%.为确定此次疫病的病因,本研究从发病猪群中采集10 份病死猪小肠、脾脏、肺脏、淋巴结等组织进行细菌分离、PCR检测、病毒分离、病毒效价(TCID₅₀)测定、基因测序与分析.检测结果显示猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)均为阳性,猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PRoV)均为阴性,未分离到致病菌.克隆测序分离株的ORF7和Nsp2全基因序列,结果显示分离株为美洲型PRRSV,ORF7基因全长为372 bp,编码123个氨基酸;Nsp2基因全长为2 850 bp,编码950个氨基酸,其中Nsp2基因在第481、532—560位发生了共30个氨基酸的不连续缺失,与高致病性PRRSV(HP-PRRSV) JXA1株Nsp2基因缺失特征一致,属于HP-PRRSV分离株.匀浆病料接种Marc-145 细胞,48 h开始出现 PRRSV 特征性病变,TCID₅₀为10^-5.75/0.1 mL.推测此次新生仔猪大批死亡主要是PEDV感染后继发高致病性猪繁殖与呼吸综合征所致.     

Diagnosis of a Large Number of Death Cases of Newborn Piglets and Isolation and Identification of HP-PRRSV

The assay was aimed to provide theoretical references for the prevention and control of newborn piglet epidemic diarrhea which was characteristic of high morbidity and mortality.An outbreak of newborn piglet epidemic featuring diarrhea,emesis and lassitude was reported in January 2013 in a large-scale pig farm in Yulin,Guangxi province.The morbidity and mortality in the epidemic were 80% and 80% to 100%,respectively.To identify the causes,ten samples of small intestines,spleens,lungs and lymph glands were collected for the bacterial isolation,PCR,virus isolation,determination of TCID₅₀,gene sequencing and analysis.The detection results showed that PEDV and PRRSV were positive while those of CSFV,PRV,TGEV and PRoV were negative.No pathogenic bacteria were isolated.Clone and sequence results of ORF7 and Nsp2 genes of the isolate indicated that the isolate was an American PRRSV,with ORF7 of 372 bp (123 amino acids) and Nsp2 of 2 850 bp (950 amino acids).There was a discontinuous deletion of 30 amino acids of Nsp2 gene at sites 481 and 532 to 560,which was consistent with Nsp2 of highly pathogenic PRRSV JXA1,so the isolate could be determined as a HP-PRRSV strain.48 h after Marc-145 cells being inoculated by pathological sample,the typical CPE of PRRSV appeared,and TCID₅₀ of PRRSV isolate was 10^-5.75/0.1 mL.The newborn piglet epidemic diarrhea was caused by PEDV infection and HP-PRRSV subsequent infection.     

猪传染性胃肠炎临床诊断及防治

猪传染性胃肠炎是由猪传染性胃肠炎病毒引起的急性高度接触性肠道传染病,临床上以腹泻、呕吐和脱水为特征,各种年龄的猪都可发病,对哺乳仔猪的危害最严重.然而以腹泻为主症的还有猪痢疾、仔猪黄痢、仔猪白痢、仔猪红痢(梭菌性肠炎)、流行性腹泻、轮状病毒感染、仔猪副伤寒等7种疫病,为了更有效地防控猪传染性胃肠炎,做到早诊断、早治疗.论文阐述了猪传染性胃肠炎与猪其他7种腹泻疫病的临床症状的区别及猪传染性胃肠炎的防治要点.     

优化教槽料脂肪源对断乳仔猪生长性能及生产效益的影响

在断乳仔猪日粮中添加脂肪酸优化的脂肪源,同时以椰子油粉作为对照,研究优化的脂肪源对断乳仔猪生长性能、腹泻情况及生产效益的影响。试验选取120头断乳仔猪,随机分为2个处理组:A组添加4%结构脂脂肪粉(商品名:乳脂能Ⅱ型),B组添加4%椰子油粉(商品名:椰香50),每组6个重复,每个重复10头猪,试验为期12 d。结果表明:A组仔猪的采食量、日增重及成活率均高于B组,且A组仔猪的腹泻率显著低于B组。经济效益分析表明:试验期间,A组每头猪增重回报比B组增加15.52元/头,净盈利增加13.54元/头。由此可见,脂肪酸优化的结构脂可促进仔猪采食,提高仔猪增重,减少仔猪腹泻,且其经济效益优于B组。     

Primary isolation of cytopathic bovine rotaviruses on fetal rhesus monkey kidney cells

Primary isolation of bovine rotaviruses was successfully performed on rolling cultures of MA104 cells following trypsin treatment of fecal samples and cells. Fifty-one fecal samples were obtained from 22 herds affected with naturally-occurring acute diarrhea in calves during a period of over two years. Rotavirus particles were demonstrated in only 10 fecal samples by electron microscopy. Fourteen cytopathic bovine rotaviruses were isolated from positive samples and could be serially cultivated on MA104 cells. The presence of virus was identified by specific immunofluorescence in infected cells. These data indicated that approximately 30% of the herds affected with acute diarrhea in their calves were associated with rotavirus infection.