鸡腺胃型传染性支气管炎病毒山东分离株S基因的克隆及序列分析

为研究3株鸡腺胃型传染性支气管炎病毒(IBV)山东分离株(青岛腺胃株QX株、东营腺胃株DY株、肥城腺胃株FC株)病毒纤突蛋白基因(S基因)的核苷酸特征,与呼吸型M41标准株及肾型IBV进行S基因核苷酸进行同源性比较。采用RT-PCR技术方法,对IBV分离株(QX、DY、FC)及标准毒株M41株S基因进行克隆和序列测定,对其中QX和DY株S基因核苷酸分别用3种方法(Clustal V method、Jotun Hein method和Clustal W method)对获得的基因核苷酸序列进行分析。结果显示,QX株和DY株的S基因核苷酸与标准毒株M41株S基因核苷酸的同源性最高为79.3%和79.2%,最小差异性为24.5%和22.3%。QX株和DY株与肾型IB分离株HD同源性最高为78.4%和78.9%,最小差异性均为22.7%。HD株与M41株的同源性最高达到80.8%。通过对S基因进化关系分析,说明腺胃型IBV山东分离株(QX、DY株)与呼吸型和肾型IBV是引起不同组织嗜性的IBV变异株,与呼吸型IBV和肾型IBV有明显的差异,是在IBV遗传变异进化过程中具有重要地位的进化阶段。     

鸡传染性支气管炎病毒广西流行株3种主要结构蛋白基因的遗传变异分析

为了解鸡传染性支气管炎病毒(IBV)广西流行株的遗传变异情况,应用RT-PCR方法对2004-2007年的7株广西IBV分离株的纤突蛋白S1基因、核(N)蛋白和膜(M)蛋白基因进行扩增、克隆、测序和同源性比较及系统进化分析。结果显示广西IBV分离株S1基因存在广泛的基因点突变,部分毒株出现基因插入和缺失,分离株之间氨基酸同源性为74.2%～98.7%;N基因无插入和缺失,但存在基因点突变,分离株之间氨基酸同源性为91.7%～99.3%;M基因存在点突变和插入现象,分离株之间氨基酸同源性为90.7%～98.2%。以疫苗株H120为参照,广西IBV分离株的S1、N和M基因都出现了变异,其中S1基因变异程度最大。7株广西IBV在S1、N和M基因氨基酸序列系统进化树中分别集中在2、3和3个基因群中,其中4株的S1、N和M基因分型结果不一致。结果表明广西IBV分离株的S1、N和M基因已发生变异,广西IBV存在广泛的基因突变、缺失或插入现象。研究的结果提示流行株的遗传变异可能是目前影响疫苗免疫效果的主要原因。     

广西1985年～2008年IBV分离株S1基因高变区Ⅰ和N基因的序列和系统进化分析

为了解广西传染性支气管炎病毒(IBV)的纤突蛋白S1基因高变区Ⅰ(HVR Ⅰ)和核(N)蛋白基因变异情况及S1和N基因变异的相关性,本研究应用RT-PCR方法扩增了广西1985年～2008年的21株IBV的S1基因HVR Ⅰ和N基因,并进行了克隆、序列测定及分析.结果发现:广西存在着多种基因型IBV流行;广西IBV分离株S1基因存在广泛的点突变和插入现象;N基因序列存在氨基酸替代现象.21株IBV中12株在S1基因HVR Ⅰ和N基因遗传进化树中均归属相同群,其余毒株却归属不同的群.2005年分离的GX-NN5存在基因重组现象.以上结果表明了广西IBV毒株存在基因突变和基因重组现象,S1和N基因的变异不完全平行,有些毒株间的S1和N基因差异很大.     

4株IBV中国地方分离株部分结构基因变异的研究

本研究通过RT-PCR分别获得了4个国内IBV分离株的S1、M和N基因，并进行了克隆及测序。序列分析结果表明：HaN2-95株的S1、M和N基因核苷酸序列均与IBV H120疫苗株的同源性最高；尽管HaN1-95株的S1基因与IBV H52疫苗株的亲缘关系最近，但是该毒株的M基因和N基因却与IBV Gray株的同源性最高；GX1-98株的S1和M基因均与IBV H52疫苗株的亲缘关系最近，但其N基因却与IBV Gray株和Ark99株有高度的同源性；GX2-98株的S1基因却与IBV Holte株的亲缘关系最近。上述结果提示国内有些IBV分离株的出现可能与疫苗株的使用有关。     

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)H120疫苗株S1基因的克隆与序列测定

根据国外已发表的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因序列设计了一对引物,通过RT-PCR特异性扩增出IBV H120疫苗株的S1基因,产物大小为1.62 kb,与设计相符.同源性比较结果显示,H120株与H52、M41和BEAU株的S1基因核苷酸序列的同源性分别为97.1 %、96.9 %和96.8 %,表明IBV H120疫苗株与标准毒株的S1基因具有高度的同源性.     

鸡传染性支气管炎病毒S1和N基因遗传变异的相关性

对国内1992—2005年分离的IBV毒株的纤突蛋白(S1)和核衣壳蛋白(N)基因分别进行克隆测序,结合在GenBank中发表的IBV S1和N基因的序列,对其不同毒株的S1或N基因片段和全长、S1和N基因全长分别进行遗传变异的研究,利用统计学软件SPSS11.5进行同源性相关分析。结果表明:不同IBV毒株N或S1基因片段与其全长之间遗传变异高度相关,核苷酸r≥0.892,氨基酸0.854≤r≤0.968;但S1与N基因全长之间核苷酸的遗传变异相关性相对较低一些,而且有些毒株间S1基因同源性很低(r=0.645),但N基因同源性仍很高,显示每个基因变异的独立性。国内IBV疫苗株之间S1和N基因核苷酸高度同源(S1≥97.3%;N≥90.7%),而野毒株与疫苗株相比S1和N基因同源性均较低(S1≤84.3%;N≤87.1%),这也可能与常规疫苗对IBV野毒株不能有效保护有关。     

传染性支气管炎DN-1分离株S1基因的克隆与序列分析

根据已发表的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因序列设计了1对引物,通过RT-PCR特异性扩增出DN-1株的S1基因,产物为1.7 kb,与设计相符.同源性比较结果显示,DN-1株与H52、H120株的S1基因核苷酸序列的同源性分别为99.7%、99.2%,表明IBV DN-1分离株与疫苗株的S1基因具有高度的同源性.     

免疫鸡群IBV的分离鉴定及其S1基因序列研究

为了解鸡传染性支气管炎病毒(IBV)变异情况,对2018—2019年多次发生疑似鸡传染性支气管炎(IB)的广西某公司发病鸡群进行IBV的分离鉴定,并对分离株进行S1基因序列测定、同源性、系统进化树和重组分析。结果显示:共分离到5株IBV,其S1基因核苷酸相似性为85.2%～99.9%;5株IBV中3株S蛋白裂解位点为HRRRR,2株为RRFRR;2018年分离的2株IBV属于LX4型中的QXⅡ亚型,与疫苗株QXL87处于同一个分支;2019年分离的3株IBV为LDT3-A型,且均为重组毒株,来源于分离株GX-YL161022(QXⅡ亚型,主亲本)与参考株CK/CH/LSC/99I(次亲本)的重组。研究表明这5株IBV主要为LX4型毒株及其参与的重组株,未及时免疫与流行株基因型相同的疫苗以及重组导致的变异可能是造成该养殖场免疫失败的主要原因。     

江苏地区鸡传染性支气管炎核酸检测及其病毒分离株鉴定和基因序列分析

为了解江苏省蛋鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus, IBV)的主要流行情况,采集江苏省13个地级市20家蛋鸡养殖场鸡群的咽拭子及泄殖腔拭子样品共计625份。除去核酸浓度低于检出下限的120份样品后,通过RT-PCR的方法对余下的505份合格样品进行流行病学检测,并通过病料接种SPF鸡胚分离到1株IBV病毒,对该分离株进行全基因测序及S1基因序列分析。结果显示:505份合格样品中,IBV阳性检出率为14.46%(73/505)。IBV分离株全基因组大小为27 689 bp,其中S1基因1 620 bp,编码540个氨基酸,裂解位点为HRRRR,属于GⅠ-19谱系(QX型),分离株S1基因的核苷酸和氨基酸序列与GⅠ-19谱系(QX型)参考毒株同源性最高,分别为94%和95.4%。研究结果初步明确了江苏分离株遗传演化特点,为下一步防控工作提供了参考。     

传染性支气管炎病毒S1和N基因遗传变异频率的分析

旨在探讨中国北方地区传染性支气管炎病毒(IBV)的流行和分子变异,进而探讨IBV的遗传演变规律。利用生物信息学方法对IBV纤突蛋白(S1)和核蛋白(N)编码基因进行分析比较。结果显示:2012—2013年发生在山东、天津等北方地区的IBV流行株高度同源,其S1基因核苷酸(氨基酸)相似性为94.0%~100%(93.1%~100%),N基因为98.4%~99.1%(98.1%~99.8%),而与经典疫苗株H120相似性均较低,且至少在S1基因的3个高变区产生了较多的点突变、缺失和插入,且变异集中在第53—150和250—290位,以高变区HVR I居多,GM/13在62—65位缺失4个氨基酸。进一步的分析表明:IBV流行株S1基因与1998年在我国北方流行的A2株核苷酸相似性最高,为94.9%~97.2%,年核苷酸(nt)变异频率平均为2.4nt×10-3;而N基因则与LX4株相似性最高,为93.0%~93.5%,年变异频率平均为5.1nt×10-3。IBV流行株可能是A2-like和LX4-like毒株的重组,且N基因的变异频率明显高于S1基因。     

Genetic diversity of avian infectious bronchitis coronavirus in recent years in China

Fifty-six isolates of avian infectious bronchitis virus (IBV) were obtained from different field outbreaks in China in 2010, and they were genotyped by comparison with 19 reference strains in the present study. The results showed that LX4-type isolates are still the predominant IBVs circulating in chicken flocks in China, and these isolates could be grouped further into two clusters. Viruses in each cluster had favored amino acid residues at different positions in the S1 subunit of the spike protein. In addition, a recombination event was observed to have occurred between LX4- and tl/CH/LDT3/03I-type strains, which contributed to the emergence of a new strain. The most important finding of the study is the isolation and identification of Taiwan II-type (TW II-type) strains of IBV in mainland China in recent years. The genome of TW II-type IBV strains isolated in mainland China has experienced mutations and deletions, as demonstrated by comparison of the entire genome sequence with those of IBV strains isolated in Taiwan. Pathogenicity testing and sequence analysis of the 3' terminal untranslated region revealed that TW II-type IBV strains isolated in mainland China have a close relationship with the embryo-passaged, attenuated TW2296/95.     

IBV AH1-99分离株N基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术成功扩增出IBV AH1-99分离株的N基因全长cNDA,将其克隆到pMD18-T载体上。经酶切分析、PCR鉴定及核苷酸序列测定,成功获得该分离株N基因的重组质粒。序列分析结果表明,分离株N基因全长1 230个核苷酸,编码409个氨基酸。同部分IBV参考毒株相比,核苷酸同源性为85.8%~89.9%,氨基酸同源性为86.6%~91.0%,在进化关系树中,AH1-99与国内分离株X、LX4亲缘关系较近。     

Cloning and Sequence Analysis of N and M Genes of Avian Infectious Bronchitis Virus Guangxi Strain

To investigate genetic variation of avian infectious bronchitis virus (IBV) in Guangxi province,one strain of IBV was isolated from chicken.Two pairs of primers for amplifying the N and M genes of IBV were designed according to the sequences in GenBank.The N and M genes of the strain were amplified by RT-PCR,and they were proved to be the N and M genes of IBV by cloning,sequencing and compared with reference IBV strains published in GenBank.The results showed that the N gene from the IBV isolate consisted of 1 230 bp,coding 409 amino acids.The M gene from the IBV isolate consisted of 678 bp,coding 225 amino acids.The sequence analysis of N gene showed that it shared 87.2% to 93.3% nucleotide homologies and 90.0% to 94.4% deduced amino acid sequence homologies with IBV strains from GenBank.The M gene sequence analysis showed that it shared 83.6% to 91.0% nucleotide homologies and 82.7% to 92.9% deduced amino acid sequence homologies.The phylogenetic tree analysis showed that it was closely related to BJ and LX4 strains,and were clustered into one group;But with the distant relatives from other strains of IBV.These results suggested that the isolate was a new variant of IBV.     

鸡传染性支气管炎病毒广西株N、M基因的克隆与序列分析

为研究鸡传染性支气管炎病毒(IBV)广西流行株的遗传变异情况,本研究从广西发病鸡中分离鉴定了1株IBV。参照GenBank中IBV的核苷酸序列设计2对引物,利用RT-PCR技术对分离毒株的N、M基因进行了克隆、序列测定,并与GenBank中发表的国内外参考毒株进行比对分析。结果显示,N基因序列全长为1 230 bp,编码409个氨基酸,M基因序列全长为678 bp,编码225个氨基酸。与参考毒株相比,分离株的N基因核苷酸序列同源性为87.2%~93.3%,推导的氨基酸序列同源性为90.0%~94.4%;M基因的核苷酸序列同源性为83.6%~91.0%,推导的氨基酸序列同源性为82.7%~92.9%。在遗传进化树中,本试验分离株Guangxi156株与BJ株和LX4株两个参考株位于同一个分支上,亲缘关系较近,而与其他参考株属于不同的分支,亲缘关系较远。结果表明,本试验分离株是一株新的IBV变异株。     

Cloning and Sequence Analysis of M Gene of Avian Infectious Bronchitis Virus Guangxi Strain

According to the M gene nucleotide sequence of avian infectious bronchitis virus (IBV) published in GenBank,one pair of primers were designed,the M gene fragments of IBV isolated from Guangxi province were amplified by PCR.Then the amplified fragments were cloned into pMD18-T vector and the positive recombinant plasmids were sequenced.The results showed that M gene from all of the IBV isolates consisted of 678 bp,coding for 225 amino acids.Two glycosylated sites were located nearby the N-terminal,three transmembrane domains were located in the 23 to 98 peptide region.Variations within the hydrophilicity region were easier than that in the hydrophobicity region.Compared with that of other published IBV strains,the homologies of nucleotide and amino acid sequences of the isolates were 83.6% to 92.5% and 82.7% to 95.1%,respectively.The phylogenetic tree analysis showed that it was closely related to SAIB20 and LX4,and clustered into one group;But it belonged to different branches with other reference strains,and had a distant relationship.These results suggested that the isolate was a new variant of IBV.     

鸡传染性支气管炎病毒广西株M基因的克隆与序列分析

参照GenBank中鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的核苷酸序列设计1对引物,利用 PCR 扩增IBV广西株的M基因片段,将其克隆到pMD18-T载体中.序列分析结果表明,M基因全长为678 bp,编码225个氨基酸,近N端含有2个潜在的N-糖基化位点,3个跨膜区位于23—98肽段区,亲水区较疏水区更易变异.IBV广西株与国内外IBV参考毒株相比,核苷酸序列同源性为83.6%~92.5%,氨基酸序列同源性为82.7%~95.1%.系统进化分析结果显示IBV广西株与SAIB20和LX4两参考株位于同一个分支上,它们的亲缘关系较近,而与其他参考株属于不同的分支,亲缘关系较远.结果表明IBV广西株是1株新的IBV变异株.     

RT-PCR检测禽传染性支气管炎病毒

用２对已发表的引物和１对自行设计的引物对同一禽传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）Ｈ１２０株进行ＲＴ－ＰＣＲ,分别获得了Ｓ１基因上与引物设计相一致的１７２０、２２８、６０２ｂｐ的扩增片段。用自行设计的引物对７个毒株（Ｈ１２０、Ｈ５２、Ｍ４１、Ｃｏｎｎ、Ｇｒａｙ、Ｔ、Ｈｏｌｔｅ）和５个分离株（宜毒、上毒、云毒、ＨＫ、１１８）的含毒尿囊液或纯化病毒进行ＲＴ－ＰＣＲ,结果除Ｈｏｌｔｅ株和２个分离株（宜毒、云毒）外,其余均成功地扩增出６００ｂｐ的片段。用１．７、０．２、０．６ｋｂ３对引物对６个ＩＢＶ毒株和６个分离株的含毒尿囊液在相同和不同条件下进行ＲＴ－ＰＣＲ,结果３对引物分别扩增出３、５、９株ＩＢＶ,同时可将不同血清型的１２个ＩＢＶ株分成６种基因型。将ＩＢＶ分离株ＨＫ与标准株Ｍ４１经ＰＣＲ扩增、ＨａｅⅢ和Ｈｉｎｄ酶切、ＲＦＬＰ分析,表明属同一马萨诸塞血清型。３株ＩＢＶ（Ｈ１２０,ＨＫ,Ｍ４１）在鸡胚中繁殖,ＰＣＲ最早检出的时间为２０～２４ｈ。ＲＴ－ＰＣＲ提供了直接从尿囊液和感染鸡组织中快速检测病毒的新方法。     

中国肾型IBV毒株的基因型及其S1基因的巢式PCR

用本研究建立的ＩＢＶＳ１基因的巢式ＰＣＲ方法鉴定了国内５个肾型传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）分离株。以此５个分离株及３个标准毒株的ＲＴ－ＰＣＲ产物（１７４９ｂｐ，含Ｓ１基因）为模板，１对内部引物经巢式ＰＣＲ都获得１７２９ｂｐ的产物，另１对内部引物的巢式ＰＣＲ有大小不同的产物（１６７８ｂｐ或０．５、０．６ｋｂ）。参照以前的ＲＦＬＰ分析结果，探讨了中国肾型ＩＢＶ毒株的基因型状况。     

Molecular characterization of avian infectious bronchitis virus strains isolated in Colombia during 2003

Sixteen infectious bronchitis virus (IBV) isolates were recovered from broilers and layers from five geographic poultry regions in Colombia. The viruses were isolated from tracheas, lungs, and cecal tonsils of birds, previously vaccinated with the Massachusetts strain, that were showing respiratory signs. Further analysis of the IBV isolates was achieved by phylogenetic analysis comparing their deduced amino acid sequences in the hypervariable region 1 of the S1 gene with reference strains. Four unique genotype clusters containing isolates with indigenous genotypes were observed. One isolate was found to be the Connecticut genotype and three isolates were found to be the Massachusetts genotype.     

2株鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1基因的序列分析

采用RT-PCR方法对2株传染性支气管炎病毒分离株的S1基因进行序列扩增、测定及分析,应用DNAStar软件将这些分离毒株与中国常用疫苗毒株、其他血清型的代表参考毒株分别进行核苷酸和氨基酸系统发生进化关系分析。核苷酸与氨基酸序列分析结果均表明：2株分离毒株与J2、Q1、T3毒株的亲缘关系较近,与疫苗株H120和4/91的亲缘关系较远。