检测鸡毒支原体抗体的间接ELISA方法和HI试验方法的建立及初步应用

本研究旨在建立一种检测鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)抗体的间接ELISA方法,结合HI试验,为MG感染的监测和净化提供一套有效的组合技术方案。以原核表达的VlhA 3.03重组蛋白(rVlhA)作为包被抗原,使用单一稀释法构建了关于血清抗体滴度与1∶500血清稀释度处S/P值的回归方程lg(抗体滴度)=1.257×lg(1∶500处S/P值)+3.709,R²=0.917 6,S/P临界值为0.32,临界滴度是1 200。经验证,rVlhA-ELISA方法具有良好的特异性、重复性,最低能检出1∶2 000稀释的阳性血清。选择国内MG分离株SH/2020-1作为血凝抑制抗原建立HI试验方法。使用rVlhA-ELISA方法联合HI试验进行血清样品检测,IDEXX-MG方法作为对照,借助RT-qPCR方法监测MG感染情况。结果表明rVlhA-ELISA方法和IDEXX-MG监测的血清抗体趋势与HI复核结果均一致;rVlhA-ELISA与HI联合判定结果与IDEXX-MG符合率可达91.53%。上述结果显示,本研究建立的rVlhA-E...     

鸡毒支原体黏附蛋白PvpA的原核表达与纯化

利用基因重组技术将PvpA基因的PCR扩增产物与原核表达栽体pET-41a(+)连接,转化入DH5a感受态细胞,通过PCR、双酶切及测序鉴定后,将阳性重组质粒转化入大肠杆菌BL21(D3)受体菌,用IPTG诱导蛋白表达.用纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备PvpA蛋白多克隆抗血清,并用Western blotting检验抗体特异性.结果表明,本研究成功获得PvpA纯化蛋白,在免疫印迹试验中,兔抗PvpA高免血清能与目的蛋白发生阳性反应,证实表达产物为特异性蛋白.     

应用PPA—ELISA检测鸡毒支原体血清抗体

应用ＰＰＡ－ＥＬＩＳＡ检测鸡毒支原体血清抗体,其结果与血凝抑制试验和ＥＬＩＳＡ符合率为１００％,是一种特异,敏感,简单,快速的检测方法。     

绵羊支原体HSP70的原核表达及抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立绵羊支原体(Mycoplasma ovis)的血清学检测方法,根据GenBank收录的绵羊支原体HSP70蛋白C端的基因序列(登录号：CP006935.1),构建了重组原核表达质粒。通过原核表达获取重组蛋白,并将纯化的重组蛋白作为包被抗原,建立了绵羊支原体间接ELISA抗体检测方法。结果显示,成功构建了绵羊支原体HSP70蛋白的重组原核表达质粒;重组蛋白在大肠埃希氏菌BL21(DE3)感受态细胞中,同时以可溶性蛋白和包涵体蛋白的形式表达;以重组蛋白作为包被抗原建立的绵羊支原体间接ELISA抗体检测法,抗原包被最佳浓度为4μg/mL,血清最佳稀释度为1∶100,酶标二抗最佳稀释度为1∶2 000。建立的ELISA方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,为绵羊支原体的检测及试剂盒的开发提供了技术支持。     

犬弓形虫抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立犬弓形虫抗体间接ELISA(iELISA)诊断方法,本研究对弓形虫TgCyP基因进行重组表达,纯化获取重组蛋白并进行Western blot检测,方阵滴定法确定纯化好的重组蛋白抗原最佳包被质量浓度和血清稀释度,优化包被条件、酶标二抗稀释度、封闭液和封闭时间等,建立犬弓形虫抗体iELISA诊断方法,并对建立的iEL...     

猪支原体重组MSG1蛋白间接ELISA检测方法的建立

为确定猪支原体在临床的感染情况和进行血清流行病学调查,本研究以原核表达纯化的猪支原体MSG1重组蛋白为包被抗原,建立了检测猪支原体的间接ELISA诊断方法。通过对ELISA反应一系列条件的优化,确定了最佳抗原包被浓度为0.5μg/mL;最佳封闭条件为用1%BSA37℃温箱内封闭2 h;血清最适稀释度为1∶200,作用时间为1.5 h;酶标二抗最适稀释度为1∶15 000,最适作用时间为1 h;最后37℃显色15 m in。判定标准为OD450≥0.239时判为阳性,OD450<0.198时判为阴性,0.198≤OD450<0.239时判为可疑。敏感性、特异性和可重复性试验证明,该检测方法敏感性高、特异性强和可重复性好。该研究表明建立的间接ELISA方法为猪支原体的检测和区域流行病学调查提供了一种快速简便的血清学诊断方法。     

犬瘟热病毒重组H蛋白间接ELISA检测方法的建立

为建立一种检测水貂犬瘟热病毒(CDV)血清抗体的间接ELISA方法,将CDV的血凝素蛋白(H)基因的主要抗原表位片段克隆至p ET-30a-c(+)载体中,转化至感受态细胞Rosetta(DE3)中进行诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定。以纯化的重组H蛋白作为包被抗原,建立了检测CDV抗体的间接ELISA方法,并证实该方法具有良好的特异性、重复性和敏感性。采用建立的方法与国外商品化的犬瘟热抗体检测试剂盒对80份血清进行检测,两者符合率为92.5%。本研究建立的间接ELISA方法为水貂抗体水平检测和评价犬瘟热疫苗免疫效力提供了简便快速的方法。     

应用间接ELISA检测鸡痘病毒抗体方法的建立

建立了检测鸡痘病毒抗体的间接ELISA方法。应用该方法检测鸡痘阳性血清，其灵敏度为琼脂扩散试验的400～800倍，而且还具有特异性强、操作简便、快速等特点。     

基于绵羊肺炎支原体EF-Tu蛋白间接ELISA方法的建立

为解决绵羊肺炎支原体感染的预防问题,建立一种简单、快速、成本低的诊断方法,构建绵羊肺炎支原体EF-Tu基因原核表达载体,诱导纯化重组蛋白并用Western blot分析其反应原性,以重组蛋白为诊断抗原,建立绵羊肺炎支原体间接ELISA检测方法,评估其特异性和灵敏性。结果表明,构建的重组蛋白纯化后,经Western blot证实具有良好的反应原性;间接ELISA反应条件优化显示,抗原稀释度为0.25μg/mL,一抗最佳稀释浓度为1∶50,最佳孵育时间为90 min,封闭液为50 g/L脱脂奶粉,二抗最佳稀释倍数为1∶8 000,最佳孵育时间为60 min,特异性与灵敏性良好;该方法与间接血凝法对100份血清进行检测,两者符合率为88.7%。说明试验建立的绵羊肺炎支原体间接ELISA检测方法可以推广使用。     

应用间接ELISA检测鸡痘病毒抗体方法的建立

应用鸡胚成纤维细胞(CEF)扩增鸡痘病毒(Fowlpox virus,FPV)并提纯后作为抗原建立了具有较高特异性和灵敏性的间接ELISA方法.通过方阵滴定法来确定抗原最佳包被浓度为2.7μg/孔,待检血清最佳稀释倍数为1:100,其阳性临界值为OD≥0.113.将400份FPV免疫实验鸡血清用本方法进行检测,其阳性检出率为81.25%(325/400).此外,将该方法与琼脂扩散试验进行比较检测血清样品,结果显示本方法的灵敏度比琼脂扩散试验灵敏400～800倍,而且还有特异性强,操作简便、快速等优点.     

检测鸭呼肠孤病毒抗体间接ELISA方法的建立

RT—PCR扩增鸭呼肠孤病毒（Duckreovirus,DRV）的dB基因,克隆到pET-32a（＋）表达载体,再转化大肠杆菌Transetta（DE3）;含有重组质粒pET—σB的大肠杆菌经IPTG诱导,获得大小为55000的以包涵体形式表达的σB重组蛋白。Westernblotting显示,σB重组蛋白能够与兔抗DRV多抗血清特异性结合。以高亲和NI—NTA树脂在变性条件下纯化、梯度尿素复性的σB重组蛋白为包被抗原,建立了检测DRV抗体的间接ELSIA方法。分别以间接ELSIA方法和血清中和试验对DRV感染鸭血清和SPF鸭血清进行检测,两者的符合率为100％。该间接ELSIA方法对鸭瘟病毒、鸭病毒性肝炎病毒和禽流感病毒阳性血清均无交叉反应。     

犬瘟热病毒重组核蛋白间接ELISA方法的建立

将已构建成功的重组质粒pGEX-4T-1-N转化大肠杆菌BL21株,在最佳诱导条件下获得犬瘟热病毒(CDV)重组N蛋白。将表达产物纯化后进行SDS-PAGE和W estern-b lot分析,与CDV标准阳性血清呈阳性反应。本研究初步建立了以纯化的N蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法,经初步试验证实,该方法敏感、特异。试验结果表明,大肠杆菌中表达的CDV N蛋白在免疫原性上与天然核衣壳蛋白具有较高相似性,可作为诊断用抗原。     

丝状霉形体山羊亚种血清抗体间接ELISA检测方法的建立

利用丝状霉形体山羊亚种标准株PG3制备抗原,经纯化后作为包被抗原建立了间接ELISA方法,用于检测丝状霉形体山羊亚种血清抗体。经方阵滴定确定最佳抗原包被浓度为1.09μg/mL,血清样品最佳稀释度为1∶64,兔抗羊IgG辣根过氧化物酶结合物的最佳稀释度为1∶40 000,抗原抗体最佳结合时间为1 h。判定标准为样品D490 nm值与标准阴性血清D490 nm值之比（P/N）≥3为阳性,≤2.5为阴性,介于二者之间的为可疑。重复性和稳定性试验证明,建立的间接ELISA的稳定性和重复性良好,与间接血凝试验相比,其敏感性较高。     

流行性乙型脑炎病毒E蛋白的截短表达与间接ELISA诊断方法的建立

为建立一种快速检测流行性乙型脑炎病毒抗体的方法,本研究参照已发表的JEV基因组序列,应用RT-PCR扩增了长约1000bp的E基因片段,连接pET30a表达载体中,经诱导后获得了以包涵体形式表达的重组E蛋白。重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测证明其具有良好的抗原性和特异性。以该蛋白作为诊断抗原,建立了检测流行性乙型脑炎病毒抗体的E-ELISA诊断方法。该诊断方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,为JEV的快速诊断、免疫猪群抗体监测和JEV流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。     

猪脑心肌炎病毒重组抗原间接ELISA诊断方法的建立与应用

以猪脑心肌炎病毒VP1重组蛋白为抗原,建立了检测猪脑心肌炎病毒(EMCV)血清抗体的间接ELISA诊断方法。经优化后抗原最适包被浓度为2μg/mL,血清最适稀释度为1∶50,其作用时间为90 min,酶标抗体最适稀释度为1∶20 000,最适作用时间为30 min。判定标准为OD450≥0.427为阳性,OD450≤0.35为阴性,介于二者之间为可疑。该重组蛋白与PRRSV、猪瘟、PCV2、FMDV抗体反应呈阴性,证明具有良好的特异性。应用该方法检测了来自我国不同地区的26家猪场的156份临床血清,结果证明我国部分规模化猪场已有猪脑心肌炎疾病存在。     

山羊痘病毒p32基因原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为了建立山羊痘病毒(GPV)抗体快速检测方法,本研究通过人工合成密码子优化的GPV p32基因,并在大肠杆菌中进行截短表达(p32-opti).表达的重组p32-opti蛋白主要以包涵体形式存在,Western blot分析表明,p32-opti与GPV标准阳性血清具有良好的抗原性.以纯化的重组p32-opti蛋白作为ELISA包被抗原,建立间接ELISA抗体检测方法.该方法检测小反刍兽疫、蓝舌病和口蹄疫阳性血清均无交叉反应;与中和试验(VNT)比较,两者的符合率为95.7%;ELISA批内和批间重复性试验显示,OD值的变异系数小于10%.上述结果表明.该ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性.对来自黑龙江、内蒙古和新疆自治区的390份山羊和绵羊血清进行检测,抗体阳性率为80.2%,表明这些地区的山羊和绵羊群普遍存在羊痘病毒抗体.本研究建立的间接ELISA方法可用于GPV感染的流行病学调查以及疫苗接种动物的抗体水平监测.     

基于重组蛋白SP41的布鲁氏菌间接ELISA检测方法的建立及初步应用

对布鲁氏菌黏附素SP41蛋白进行表达、纯化,以表达重组蛋白为包被抗原,建立了检测布鲁氏菌病绵羊血清抗体的间接ELISA方法。克隆布鲁氏菌SP41基因,PRC、酶切、测序鉴定正确后,构建pET-32a(+)-SP41原核表达载体,转化表达菌E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达重组SP41蛋白,纯化表达产物后包被酶标反应板,方阵滴定法进行最佳血清稀释度和最侍抗原浓度的筛选,结果显示重组蛋白SP41最佳抗原包被浓度为0.6mg/L,最佳血清稀释度为1:50。交叉试验、阻断试验、重复性试验表明,该方法重复性好、特异性强。利用此方法检测217份绵羊血清样本,结果表明该方法的阳性检出率要高于虎红平板试验和试管凝集试验。     

茨城病毒VP7蛋白基因的克隆表达及间接ELISA方法的建立

采用RT-PCR方法扩增出了茨城病毒（IBAV）No．2株编码VP7蛋白的S7全长基因，并克隆入原核表达载体pET-28a（＋）中，在E．coli BI.21中表达。经Western-blot检测，表达的重组VP7蛋白具有良好的反应原性。以纯化的重组蛋白作为包被抗原，初步建立了检测IBAV血清抗体的间接ELISA方法。     

鸡毒霉形体H3株TM-1基因与鸡白细胞介素2基因串联子在大肠杆菌中的共表达

运用DNA重组技术将鸡白细胞介素2基因和鸡毒霉形体H3株TM-1基因进行串联,插入到pET-30a（＋）质粒的EcoRⅠ和HindⅢ多克隆位点间,经PCR鉴定、双酶切鉴定和序列测定,表明已成功构建了含鸡毒霉形体H3株TM-1基因和鸡白细胞介素2基因的融合基因,将含有此融合基因的重组质粒命名为pET-30a（＋）-TM-1-IL-2.将此重组质粒转化E.coli BL21（DE3）菌株.经IPTG 37℃诱导表达4 h后,SDS-PAGE电泳结果显示,此融合基因得到了表达,所表达出的融合蛋白的分子质量约为43 ku,主要以包涵体形式存在.表达产物在尿素存在下经超声波处理,获得了纯化的融合蛋白.这为进一步研究鸡白细胞介素2及鸡毒霉形体的生物学活性奠定了基础.