无花果ACS1基因RNAi植物表达载体构建

通过构建无花果ACS1基因的RNA干扰植物表达载体,为研究ACS基因的功能及采用生物技术方法培育无花果耐贮新品种奠定基础。本试验根据已克隆的无花果ACS1基因序列及植物表达载体pBI221、pBI121的酶切位点,设计2对带相应酶位点的特异性引物,以测序质粒为模板,进行PCR扩增,获得正、反向扩增片段,分别正、反向插入到pBI221载体中的CaMV35S启动子和gusA基因之间,构建成无花果ACS1基因的RNAi中间表达载体。再将中间载体中的正、反向片段和gusA基因以双酶切方式连接到表达载体pBI121上,构建成pBI121-RNAi-ACS1植物表达载体。通过各种限制性内切酶的酶切鉴定,成功构建了无花果ACS1基因的RNA干扰植物表达载体。     

植物表达载体pGMAR-BADH的构建

将甜菜碱醛脱氢酶基因BADH和植物表达载体pGMAR通过内切酶BamHI和KpnI双酶切,T4连接酶进行连接反应。重组质粒在大肠杆菌菌株DH5α内扩增,提取并纯化质粒。经鉴定,基因BADH已被完整、正确的插入到pGMAR载体中,并成功将BADH插入到载体pGMAR的两个MAR序列之间。     

拟南芥CBF1基因植物表达载体构建及其对野生蕉的遗传转化

从拟南芥中克隆CBF1基因,转入到植物表达载体pBI121的XbaI和SacI位点,得到中间重组质粒pBI121-CBF1,用EcoRI和HindⅢ将35S启动子与CBF1基因从pBI121-CBF1切下,转入到植物表达载体pCAMBIA1301中,构建植物表达载体p1301-CBF1.将构建的植物表达载体转入农杆菌E...     

玉米特异表达启动子驱动下结核esat-6抗原基因植物表达载体的构建及鉴定

以本实验室构建的pEGHLE为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Esat-6基因,连接到含有玉米特异性启动子globulin-1的pCR2.1载体上,将globulin-1-Esat6联合片断切下连到含有抗除草剂基因bar的pCAMBIA1300载体中,构建植物双元表达质粒pCAMBIA1300GEsat-6,电击法将重组质粒转化到农杆菌LBA4404中.通过对pC1300GEsat-6质粒酶切鉴定和测序分析表明克隆的Esat-6与预期相符,酶切从农杆菌中所提的质粒,条带大小与预期结果相符合.     

植物病毒表达载体pClYVV/CP/W的构建及GFP表达的研究

[目的]研究植物病毒表达载体pC1YVV/CP/W的构建及用pC1YVV/CP/W表达绿色荧光蛋白(GFP),为植物反应器生产有用蛋白、开发有效的植物病毒载体提供参考。[方法]用三叶草黄脉病毒侵染性全长cDNA克隆pC1YVV基因组的Mb/CP基因之间的一段多克隆位点和两侧含有病毒蛋白酶NIa切割识别序列的多聚脱氧核糖核苷酸接头,构建pC1YVV/CP/W载体,并将绿色荧光蛋白基因插入pC1YVV/CP/W中构建pC1YVV/CP/W/GFP载体,用反转录PCR对重组病毒克隆转录情况进行检测,并用Western杂交对重组病毒克隆表达的目的基因产物进行测定。[结果]pC1YVV/CP/W/GFP接种的蚕豆幼苗表现出与野生型C1YVV相同的症状,发病率达100%,表明重组病毒克隆pClYVV/CP/W/GFP有侵染性,外源基因的插入没有破坏载体pClYVV/CP/W的开放阅读框;外源基因在F_4子代病毒基因组中稳定存在;重组病毒克隆pC1YVV/CP/W/GFP至少到F_4子代病毒能稳定表达GFP。[结论]该研究结果为用植物表达有用蛋白提供了有用的植物病毒载体。     

丝状真菌转化载体的改进

为了改进农杆菌介导丝状真菌遗传转化用的Ti双元载体,将质粒pUCATPH上真菌trpC基因启动子驱动的潮霉素B抗性基因(hygB)表达盒转移到Ti质粒pPZP111上,构建成用于丝状真菌遗传转化的Ti载体pATZ。将植物表达载体pDL916上的草丁膦抗性bar基因重组到载体pKS-trpC上,构建成含真菌启动子、终止子调控的bar基因表达盒的中间载体pTrpCBar;之后将该表达盒转移到pPZP111载体上,得到以bar基因为筛选标记的真菌转化Ti质粒pTBZ。上述质粒载体经酶切鉴定和DNA测序证实构建正确,为丝状真菌的农杆菌介导遗传转化提供了新的工具。     

一种植物RNAi双元载体的构建

[目的]为利用RNAi技术研究植物基因组功能奠定基础。[方法]通过PCR技术克隆一系列RNAi双元载体所需要的元件：绿色荧光蛋白基因（gfp）、花椰菜花叶病毒启动子（CamV35S）、氨基糖苷3＇-腺苷酰基转移酶基因（aada）、胭脂碱合成酶基因终止信号（nos）,并进行组装,在双元载体质粒pCAMBIAl301的基础上构建目的载体。[结果]通过7种中间载体的构建,最后成功得到双元载体质粒pHBMT14。[结论]该载体的成功构建为以后的植物基因组功能研究提供了技术平台。     

一段烟草核基质结合区的分离及对转基因表达的效果

 采用PCR方法，从烟草基因组中分离了一段核基质结合区（matrix attachment region，MAR），将其构建到β-葡糖醛酸酶（β-glucuronidase，GUS）基因（uidA）的两侧翼，形成MARs调控的植物表达载体，将此表达载体与不含MARs序列的植物表达载体通过农杆菌转化烟草。对转基因植株进行GUS活性定量测定，结果表明，MAR可以提高外源uidA基因的表达水平，与不含MAR的转化植株相比，外源基因的平均表达水平提高了1.5倍，最高达6倍，但MAR的引入不能降低转基因植株个体间表达水平的差异。     

DHAR基因植物表达双元载体的构建及转化百合研究

将质粒pSB166中包含ED35s肩动子,Omega元件及TNOS终止子的一段核苷酸序列定向克隆到质粒pCAMBIA1303,构建了中间表达载体,将DHAR基因与pCSB定向连接,构建了DHAR基因植物表达载体pCSB-DHAR.进而以百合叶片为受体,通过根癌农杆菌介导的方法将DHAR基因转入百合,对转基因百合进行PCR检测,初步表明DHAR基因已整合到百合基因组中.     

茶树ATP硫化酶和硒半胱氨酸甲基转移酶基因植物表达载体的构建

采用能有效转化双子叶植物的表达载体pBI121构建植物硒营养代谢关键酶基因的表达载体,将原载体中GUS基因用茶树ATP硫化酶基因(APS1和APS2)替换,将硒半胱氨酸甲基转移酶基因(CsSMT)连接到pBI121载体上直接与GUS基因相连,分别构建了目的基因植物表达载体pBI-APS1、pBI-APS2和pBI-CsSMT.通过三亲杂交法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,获得转化工程菌,为通过植物基因工程获得富硒农产品打下基础.     

甘蓝短散布元件对转基因表达效果的研究*

 为检验甘蓝短散布元件（SINE）对植物转基因表达的影响,采用PCR方法,从甘蓝基因组中克隆了一段短散布元件序列（Short Interspersed Nuclear Element,SINE）,该SINE具有核基质结合区（matrix attachment region,MAR）的结构特征,将其构建到β-葡糖醛酸酶（β-glucuronidase,GUS）基因（uidA）的两侧翼,形成SINE调控的植物表达载体,采用农杆菌介导法,将含SINE序列和不含SINE序列的植物表达载体导入烟草中。对转基因植株进行GUS活性定量测定,结果表明,SINE表现出类似MAR的功能,可以提高外源uidA基因的表达水平,与不含SINE的转化植株相比,外源基因的平均表达水平提高了2倍,但转基因植株个体间表达水平存在较大的差异。     

转基因下游MAR在稳定转化的CHO细胞中对基因表达的调控作用

[目的]探讨转基因下游MAR在稳定转化的CHO细胞中对基因表达的调控作用。[方法]将PCR扩增得到的人β-珠蛋白MAR插入到真核表达载体pCATG的下游,构建转基因表达盒3’端含MAR的表达载体。酶切鉴定正确后,转染CHO细胞,G418筛选出稳定转化的细胞株,ELISA分析转基因的表达水平,半定量PCR分析转基因相对拷贝数。[结果]结果表明,表达盒3’端含MAR序列能使转基因表达水平降低,其基因拷贝数则有一定程度的增加。转基因下游β-珠蛋白MAR在一定程度上能抑制外源基因的表达水平;外源基因表达量与基因拷贝数不成正比,未呈现出“拷贝数依赖性”。[结论]该研究结果为进一步研究MAR的调控机制奠定基础。     

豌豆MAR的分离及其功能分析

从3个不同品种豌豆中分离获得3个具有MARs序列特征的DNA片段MMAR、DMAR、HMAR。根据GenBank同源性搜索结果,发现这些片段均为未注册的DNA序列。经转化烟草并测定其GUS活性,结果发现两侧顺式重复连接MAR对外源基因的表达具有明显的增强作用,MMAR、HMAR和DMAR均不同程度提高了GUS的表达,分别为载体对照植株的4.16、3.66和2.08倍,但不同转化体间表达水平差异仍比较明显。     

以DsRed2基因为可视标记的双T-DNA共转化载体的构建

本研究构建了以红色荧光蛋白基因DsRed2作为可视标记的双T-DNA共转化载体PCDMAR-DsRed2-hpt.该载体含有2个独立的T-DNA结构区,其中一个T-DNA区同时含有选择标记基因hpt和红色荧光蛋白基因DsRed2;另一个T-DNA区含有一个通用的多克隆位点,可任意插入目的基因,在多克隆位点两端含有两段顺式重复的烟草Rb7MARs,用来增强目的基因的稳定表达.此载体可用于高效培育无选择标记的转基因植物.     

pEGFP-N1-hTERT真核表达载体的构建与表达鉴定

[目的]构建pEGFP-N1-hTERT真核表达载体,观察其在真核细胞中的表达。[方法]利用pC1-neo-hTERT和pEGFP-N1质粒构建重组质粒,通过双酶切鉴定、DNA测序分析验证人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)片段的准确性。将pEGFP-N1-hTERT真核表达载体转染到大鼠胎儿神经干细胞(NSCs)中,通过绿色荧光蛋白间接观察人端粒酶逆转录酶蛋白在细胞中的表达定位,通过RT-PCR、WesternBlot验证所构建的真核表达质粒pEGFP-N1-hTERT的正确性。[结果]所构建的pEGFP-N1-hTERT真核表达载体结构正确并能够在真核细胞中表达。[结论]该研究为建立大鼠永生化NSCs系奠定了基础。     

Matrix attachment regions included in a bicistronic vector enhances and stabilizes follistatin gene expressions in both transgenic cells and transgenic mice

In the present study, follistatin (FST) gene expression vectors with either a bicistronic gene transfer cassette alone, or a bicistron gene cassette carrying a matrix attachment region (MAR) were constructed and transfected to bovine fetal fibroblasts. Evaluations of both the integration and expression of exogenous FST indicated that the pMAR-CAG-FST-IRES-AcGFP1-polyA-MAR (pMAR-FST) vector had higher capacity to form monoclonal transgenic cells than the vector without MAR, though transient transfection and integration efficiency were similar with either construct. Remarkably, protein expression in transgenic cells with the pMAR-FST vector was significantly higher than that from the bicistronic vector. Exogenous FST was expressed in all of the pMAR-FST transgenic mice at F₀, F₁ and F₂. Total muscle growth in F₀ mice was significantly greater than in wild-type mice, with larger muscles in fore and hind limbs of transgenic mice. pMAR-FST transgenic mice were also found with more evenly distributed muscle bundles and thinner spaces between sarcolemma, which suggests a correlation between transgene expression-associated muscle development and the trend of muscle growth. In conclusion, a pMAR-FST vector, which excluded the resistant genes and frame structure, enhances and stabilizes FST gene expressions in both transfected cells and transgenic mice.     

香蕉束顶病毒中国漳州分离物DNA4非编码区启动子活性的研究

应用PCR方法亚克隆了香蕉束顶病毒中国漳州分离物 (BananabunchytopvirusChineseZhangzhouisolate ,BBTV ZZ)DNA 4非编码区 (Po1)、主要共同区缺失片段 (Po2 )和主要共同区及茎环共同区都缺失片段 (Po3) ,分别插入到植物表达载体pCAMBIA 130 4的gfp::gus基因上游 ,替代椰菜花叶病毒启动子 (CaMV 35S) ,得到重组质粒pTA2、pC2 6和pC45 .通过Agroinfiltration法 ,将含pTA2、pC2 6、pC45和pCAMBIA 130 4的根癌土壤杆菌 (Agrobacteriumtu mefaciens)注射进烟草 (NicotianatabacumL .cv .XanthiNC)叶片 ,进行 β 葡糖苷酸酶 (GUS)和绿荧光蛋白 (GFP)含量的瞬间表达分析 .含有pTA2、pC2 6、pC45、pCAMBIA 130 4和未注射的烟草叶片其GUS活性分别为 1 0 0 7、0 85 2、0 939、2 0 6 9和 0 0 2 1pmol·MU (μg·min) ;间接酶连免疫试验 (ELISA)结果表明每毫克总蛋白中的GFP于 490处的吸收值 (A490 )分别为 89 5 77、6 5 184、72 0 96、10 0 4 40和 3 2 87.以上表明Po1、Po2和Po3具有较强的启动子活性 .此外 ,转基因烟草的GUS组织化学定位检测试验进一步表明Po1、Po2和Po3具有维管组织特异性 .