枯草芽孢杆菌发酵猪血蛋白肽工艺初步研究

[目的]为了进行枯草芽孢杆菌发酵猪血蛋白肽工艺参数优化研究。[方法]采用产蛋白酶能力较强的枯草芽孢杆菌发酵猪血粉,制备猪血多肽,考察发酵温度、通气量（摇瓶转速）、pH值、接种量、发酵时间对蛋白质利用率的影响,通过单因素和正交优化试验确定发酵猪血蛋白肽的最佳条件,并对发酵前后血粉的品质和感官进行分析。[结果]结果表明,枯草芽孢杆菌发酵猪血粉制备猪血多肽的最佳工艺参数：温度为30oC、转速为160r／min、pH值为7．5、接种量为6％、发酵时间为50h。[结论]该研究为采用微生物发酵猪血粉制备高营养的动物蛋白饲料和提取功能性多肽提供了试验依据。     

枯草芽孢杆菌离子突变菌株H-74脂肽类抗菌物质对水稻抗性诱导作用

通过离子注入技术对枯草芽孢杆菌生防菌Bs-916突变选育,得到一株拮抗性能比出发菌Bs-916提高15 %以上的突变菌株H-74.通过对其抗菌物质的高效液相色谱(HPLC)分析表明,H-74分泌的脂肽类抗菌物质主要是表面活性素.在PDA平板上的水稻纹枯病菌菌丝抑制试验中,它能有效抑制新生菌丝的生长,并使细胞内含物外泄.盆栽控病试验表明,它对水稻纹枯病菌的相对防效达到73.35 %.将H-74分泌的脂肽类抗菌物质单喷于水稻植株上,测定与植物抗病相关的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)活性的变化,发现其对植物抗病相关酶活性表达有明显的诱导作用.结果还显示同时接种脂肽类抗菌物质和水稻纹枯病菌处理对3个酶活性影响最大.     

枯草芽孢杆菌产脂肽的发酵条件优化

[目的]优化枯草芽孢杆菌产脂肽的发酵条件,提高枯草芽孢杆菌ATCC21332脂肽产量。[方法]利用较低成本的底物对枯草芽孢杆菌ATCC21332进行发酵优化。[结果]枯草芽孢杆菌在葡萄糖浓度9 g/L、豆粕浓度40 g/L、接种量5%、装液量120 mL(500 mL容量瓶)、温度30°C、转速150 r/min、发酵时间120 h时,脂肽产量最高,为4 885.1 mg/L,比添加活性炭载体的最高产量3 600.0 mg/L增加了35.70%。通过测定发酵过程中不同时间段发酵液中氨基酸含量,发现在81 h时谷氨酸含量急剧增大,添加谷氨酸可使脂肽产量达954.0 mg/L,相比不添加谷氨酸的培养基可使脂肽产量增加近6倍。[结论]该研究为工业化生产提供新思路。     

猪δ冠状病毒的分离鉴定及其遗传进化分析

通过RT-PCR对采集自河北省2个猪场的5份腹泻仔猪小肠内容物进行检测,结果均为猪δ冠状病毒（PDCoV）阳性。将病料处理后接种LLC-PK1细胞,从2个猪场的病料中各成功分离到1株PDCoV,分别命名为PDCoV CHN-HeB-A1株和CHN-HeB-B2株。通过间接免疫荧光试验（IFA）、Western blot和电镜观察对分离的病毒进一步鉴定,IFA和Western blot结果证实2株病毒都能与PDCoV M蛋白的单克隆抗体发生特异性反应,电镜下可观察到直径100～150 nm、呈典型皇冠状的病毒粒子,证实所分离的病毒为PDCoV。全基因组测序以及遗传进化分析结果表明,2株PDCoV与中国大陆毒株相似性较高,为98.7％~99.1％,与中国香港毒株处于同一簇。     

猪δ冠状病毒NS7蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

猪δ冠状病毒(PDCoV)是1种新型猪冠状病毒,该病毒对各年龄段的猪均易感,尤其是对新生仔猪具有较高的致病性,可引起严重腹泻和高病死率。为获得抗PDCoV NS7和NS7a蛋白的单克隆抗体,先以PDCoV-GX2021-1毒株为模板扩增目的基因并构建原核表达载体,经IPTG诱导表达和SDS-PAGE切胶洗脱方法纯化目的蛋白。再按照免疫程序免疫小鼠并运用间接免疫荧光试验检测小鼠血清中特异性抗体;将血清阳性的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合后进行亚克隆筛选,获得1株可持续传代并产生抗NS7和NS7a蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞(命名为1-A08)。运用间接免疫荧光试验鉴定该单抗可特异性标记PDCoV感染细胞,Western blot和IP试验发现该单抗可特异性结合NS7和NS7a蛋白。此外,通过Western blot试验鉴定出该单抗的B细胞线性表位为₁₁₁PSTLEED₁₁₇。将该单抗的抗原表位序列与NCBI中发布的168株PDCoV NS7蛋白这一区域的氨基酸序列进行比对分析,发现该单抗的抗原表位较为保守,与其中160株的氨基酸序列一致。     

枯草芽孢杆菌Bs916中脂肽抗生素Bacillomycin L的操纵子结构及生物活性

【目的】明确枯草芽孢杆菌Bs916(Bacillus subtilis 916)分泌的脂肽化合物Bacillomycin L操纵子、结构和生物活性,阐明枯草芽孢杆菌Bs916防治病害的分子生化机制。【方法】采用LA-PCR和基因步行的方法克隆bacillomycin L的操纵子Bac;通过生物信息学的方法分析Bac操纵子的遗传特征;运用基质辅助解离质谱法测定Bac操纵子合成的脂肽类化合物bacillomycin L的分子量;利用碰撞诱导解离(CID)技术获得化合物的典型结构特征离子碎片测定bacillomycin L肽端的一级结构;通过平板对峙实验和溶血活性试验测定bacillomycin L的生物活性。【结果】克隆到全长约39.0kb的Bac操纵子,该操纵子由BacD、BacA、BacB和BacC4个多功能复合酶及1个启动子组成;生物信息学分析表明Bac操纵子与脂肽类化合物iturinA、mycosubtilin、bacillomycin D操纵子具有很高的同源性,然而也发现一段低同源性区域,该区域是一个新型Ser激活结构域。根据Bac操纵子特征推测Bac操纵子编码的脂肽类化合物可能是Bacillomycin L;Bac合成的脂肽类化合物的分子量分别为:1008,1022,1036和1050Da;推测属于相差一个(-CH2)亚甲基的同系物;脂肽化合物的一级结构为[cyclo-(Asn-Tyr-Asn-Ser-Glu-Ser-Thr-β-amino fattyacid)],该一级结构与以前报道的bacillomycin L的肽序列一致。生物活性测定结果表明其是一种生物表面活性剂,具有广谱抗真菌活性。【结论】本研究克隆了bacillomycin L的完整操纵子,并通过对操纵子生物信息学分析和生化试验鉴定了枯草芽胞杆菌Bs916分泌的脂肽bacillomycin L的化学结构,并阐明了生防菌Bs-916分泌的脂肽bacillomycin L是其抗真菌活性的关键因子。     

化学诱变枯草芽孢杆菌对大白菜根肿病的防治效果

[目的]研究化学诱变枯草芽孢杆菌对大白菜根肿病的防治效果.[方法]采用3株来自枯草芽孢杆菌XF-1的化学诱变菌株XF-1A、XF-1C和XF-1E进行大白菜根肿病的盆栽防病试验,并以MALDI-TOF-MS分析了3种抗生素的相对含量.[结果]菌株XF-1A和XF-1C防效较好,分别为68.80％和65.06％,XF-1E防效较差为42.21％.3菌株均能分泌表面活性素、伊枯草菌素和丰源素,但表面活性素和伊枯草菌素相对含量为XF-1A＞ XF-1C＞ XF-1E,XF-1A的表面活性素和伊枯草菌素分别达29.26％和35.31％,XF-1E的丰源素含量最高,达41.09％.[结论]表面活性素和伊枯草菌素含量与对根肿病防治效果存在一定的关联性     

枯草芽孢杆菌对猪育肥期促长减排试验

为了评估枯草芽孢杆菌对猪为在育肥期促长减排的作用。试验设计日龄相近,体重平均17~18kg的长大二元仔猪40头,随机分成试验和对照组,在低蛋白饲料条件下饲养120d。两组同时测定圈舍氨气、粪便粗蛋白质、苍蝇数量、生长速度进行对比分析。结果试验组圈舍氨气比对照组少11.14mg/m3;粪便中粗蛋白质含量比对照组少0.98个百分点。苍蝇数少7761只,日增重比对照组高12.39%,肉料比提高12.98%,平均每千克增重用料金额试验组7.91元,对照组9.08元,试验组比对照组少1.17元,减少14.79%。     

基因工程菌枯草芽孢杆菌GEB3产生的脂肽类抗生素及其生物活性研究

 利用MALDI TOF MS技术 ,鉴定了将lpaB3基因转入枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis 168菌株所构建的工程菌GEB3产生的脂肽类抗生素种类。结果表明 ,GEB3仅产生表面活性素 (surfactin) 1种脂肽类抗生素。经LC MS分析 ,GEB3产生由 13、14和 15个碳原子的脂肪酸链构成的标准表面活性素变异体 (standardsurfactinisoforms)。生物活性检测表明 ,该工程菌产生的脂肽类抗生素表面活性素具有抑制小麦纹枯病菌和稻瘟病菌菌丝生长的作用     

枯草芽孢杆菌用于育肥猪排污减量技术与推广

在枯草芽孢杆菌用于育肥猪排污减量研究成果基础上,在商洛市内的157个猪场推广50万头育肥猪,保持所有猪场原饲料配方不变,每吨饲料添加230g枯草芽孢杆菌,推广6～8个月,推算生长速度、饲料报酬带来的经济效益,以及环境污染和苍蝇减少带来的生态效益.推广结果表明,枯草芽孢杆菌用于育肥猪饲养可净增经济效益28240万元,氨气...     

生防菌Bs916合成脂肽抗生素泛革素的 操纵子结构功能及生物活性

【目的】明确枯草芽胞杆菌Bs916（Bacillus subtilis 916）分泌的脂肽化合物Fengycin操纵子的结构、功能和生物活性,阐明枯草芽孢杆菌Bs916防治真菌病害的分子作用机制。【方法】在Bs916全基因组测序基础上,采用LA-PCR方法克隆Fengycin的操纵子Fen;通过生物信息学方法分析Fen操纵子的遗传特征;运用基质辅助解离质谱法测定Fen操纵子合成的脂肽类化合物中同系物的分子量;采用同源重组方法构建Fengycin突变株BSFG;通过抑菌活性和溶血活性试验测定突变株BSFG的生物活性。【结果】克隆到Bs916基因组DNA中全长约37.67 kb的Fen操纵子,含有5个开放阅读框架分别编码FenA、FenB、FenC、FenD和FenE多功能复合酶;与Bs168对应Fen操纵子的同源性为65%。根据该操纵子特征推测其编码的脂肽类化合物为Fengycin;Fen操纵子负责合成的Fengycin包含5个变异体,分属于两类不同同系物。同系物1的质子化峰分子量分别为1 449.8、1 463.9、1 477.9;属于相差1个（-CH2）亚甲基的同系物,一级结构为[cyclo-（[cyclo-（Glu-Orn-Tyr-Thr-Glu-Ala-Pro-Gln- Tyr-β-amino fatty acid）];同系物2的质子化峰分子量分别为1 491.9和1 505.9,也属于相差1个（-CH2）亚甲基的同系物,相对于同系物1其第6位的Ala氨酸残基变为Val氨酸残基。生物活性测定结果表明突变株BSFG抗菌活性相对于野生型菌株Bs916得到显著下降,但溶血活性的变化不明显。【结论】本研究克隆了生防菌Bs916中合成Fengycin的完整操纵子,通过对操纵子生物信息学分析和生化试验鉴定了Fengycin的5种变异体的化学结构,并阐明了脂肽Fengycin是Bs916抗真菌活性的重要因子之一。     

枯草芽孢杆菌SYL-6脂肽类化合物的分离与稳定性分析

通过盐酸沉淀、甲醇萃取的方法,从枯草芽孢杆菌SYL-6菌株的发酵上清液中提取出一种脂肽类化合物进行抑菌试验,结果表明该物质对多种植物病原真菌具有明显的抑制作用。此外,该物质对热稳定,能耐受较广的p H值范围,对紫外线有较好的稳定性。     

枯草芽孢杆菌BAB-1脂肽类化合物的分离及稳定性分析

枯草芽孢杆菌菌株BAB-1是一株高效防治番茄灰霉病的生防细菌。通过盐酸沉淀、甲醇萃取的方法,从该菌株的发酵上清液中提取出一种脂肽类化合物。该物质能够显著抑制番茄灰霉菌菌丝生长及分生孢子的萌发,孢子萌发抑制率为83.02%。抑菌谱试验表明该物质对多种植物病原真菌具有明显的抑制作用。此外,该抑菌物质对热稳定,能耐受较广的pH范围,对多种蛋白酶不敏感,在几种常用有机溶剂中保持抑菌活性基本不变。结果表明枯草芽孢杆菌菌株BAB-1产生的脂肽类物质性质稳定,具有较强的抑菌作用。     

猪δ冠状病毒N蛋白的原核表达和间接ELISA检测方法的建立

【目的】制备猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白及其多克隆抗体,建立检测PDCoV N蛋白抗体的间接ELISA方法。【方法】从PDCoV CH-01毒株中扩增N全基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-PDCoV-N,转入BL21(DE3),用IPTG诱导表达重组N蛋白,并对该蛋白的反应原性进行鉴定。诱导表达的N蛋白经镍柱纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。同时用镍柱纯化后的N蛋白作为包被抗原,建立PDCoV的间接ELISA检测方法,对该方法的特异性、重复性和稳定性进行检测,并利用该方法对河南部分地区猪场送检的165份临床猪血清样本进行PDCoV抗体检测。【结果】成功克隆了1 026 bp的N基因,构建了重组表达载体pET-28a-PDCoV-N,经诱导表达后获得了重组N蛋白,其相对分子质量约42.9 ku,Western blot分析表明所表达的蛋白可与抗PDCoV全病毒猪阳性血清发生反应。制备的PDCoV N蛋白多克隆抗体经Western blot检测表明,该抗体具有特异性;间接免疫荧光试验测定该多克隆抗体在ST细胞上的最佳使用稀释度为1∶200。以N蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法,确定最佳的反应条件如下:抗原2μg/mL在4℃过夜包被,10 g/L BSA在37℃下封闭2 h,血清(1∶80稀释)37℃孵育1 h,酶标二抗(1∶6 000稀释)37℃孵育1 h,TMB在37℃下显色15 min;待检血清OD_(450)值≥0.272判定为阳性。特异性试验结果显示,该包被抗原与其他猪常见病毒的阳性血清均无交叉反应,批内和批间重复试验变异系数均小于5%。用间接ELISA法对来自河南不同地区的165份血清样本进行检测,结果表明各地样本PDCoV抗体阳性率平均为53.94%。【结论】成功表达了PDCoV N蛋白,制备了其多克隆抗体,建立了PDCoV间接ELISA检测方法,该方法具有良好的特异性、重复性和稳定性,可用于临床猪血清中PDCoV抗体的检测。     

稳定表达猪δ冠状病毒S1蛋白CHO细胞系的构建与鉴定

为构建稳定表达猪δ冠状病毒（PDCoV）S1蛋白的CHO细胞系,利用电转染技术将重组质粒pCGS3-S1转染至CHO细胞,通过有限稀释法筛选稳定表达重组S1蛋白的单克隆细胞系。利用阴离子交换层析和凝胶过滤层析方法对重组S1蛋白进行纯化,采用间接ELISA方法检测重组S1蛋白活性。将纯化的重组S1蛋白免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA、间接免疫荧光试验（IFA）及病毒中和试验对重组S1蛋白免疫原性进行检测。结果显示,稳定表达PDCoV S1蛋白的CHO细胞系成功建立,并获得了纯度高于90%、产量为28.5 mg/L的重组S1蛋白;且重组S1蛋白与PDCoV阳性血清反应性良好,具有良好的免疫原性,中和效价为1∶128。综上,成功建立了稳定表达PDCoV S1蛋白的CHO细胞系,且纯化获得的重组S1蛋白具有良好的生物学活性。     

猪源枯草芽孢杆菌的分离鉴定及其特性研究

为筛选高生物活性的益生菌菌株,通过热处理从健康猪肠道内容物、粪便、土壤等来源筛选具有较高抗逆性的菌株,综合形态特征、生理生化特性及16S r DNA序列分析进行鉴定;通过耐人工胃液、耐人工肠液、耐胆盐、耐高温、产酶试验、药敏试验、抑菌试验来研究菌株的特性。综合鉴定菌株ZZS16-3为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),其在p H为2.0的人工胃液中,存活率可达到65.8%,在胆盐浓度为0.3%时存活率为51.2%,在100℃处理3 min后其存活率达到11.2%,可产生蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等,对于绝大多数的药物是敏感的,对金黄色葡萄球菌则有明显的抑菌效果。枯草芽孢杆菌ZZS16-3具有较强的抗逆性和潜在的益生性能,为研制微生态制剂提供了优良的菌种参考。     

枯草芽孢杆菌JAASB4的安全性评价

安全是对益生菌最基本的要求。新挖掘的益生菌菌株在商业化生产利用前,必须对菌株的安全性做出充分的评价。本文对新分离鉴定的枯草芽孢杆菌JAASB4菌株进行了经口急性毒性和菌株易位两项安全性评价,实验结果表明,菌株对各组实验小鼠的体重、行为、活动、饮食、粪便等体征各项指标均未产生明显异常影响,实验组与对照组的肝脏、脾脏的脏体比也无显著性差异,并且没有发生菌株易位现象,初步证明了枯草芽孢杆菌JAASB4的安全性。     

4种抗生素对枯草芽孢杆菌的体外联合抑菌试验

为研究4种抗生素类药物两两混合使用对枯草芽孢杆菌的体外抑菌作用,以4种抗生素类药物单独使用作为对照,通过测量牛肉膏蛋白胨琼脂平皿上药敏片的抑菌圈直径来确定药物的抑菌作用。结果表明,青霉素钠与盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液联用对枯草芽孢杆菌的抑菌圈平均直径为12.8mm,枯草芽孢杆菌对其表现出中度敏感,注射用头孢曲松钠分别与注射用青霉素钠、盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液联用的抑菌圈平均直径在18～19mm,枯草芽孢杆菌对它们表现出高度敏感,而其他组合对枯草芽孢杆菌的抑菌圈平均直径均大于20mm,枯草芽孢杆菌对它们表现为极度敏感,但并不是所有的联合抑菌圈平均直径都大于单独使用的抑菌圈平均直径。     

枯草芽孢杆菌培养生产农用抗真菌素初步研究

对枯草芽孢杆菌BS-06产生抗真菌素的条件进行优化,确定最佳发酵条件为:培养时间为48 h,装液量为50 mL,初始pH值为8.0,培养基中添加2%麦芽糖、0.2%硝酸钾和1%吐温-80.指出枯草芽孢杆菌BS-06产生的抗真菌素具有较广的抗菌谱,对水稻纹枯病菌、稻瘟病菌、节瓜和冬瓜枯萎病菌、苦瓜枯萎病菌均有较好的抗菌效果,有望开发成生物农药来防治农作物病原真菌.