羽衣甘蓝小孢子胚植株再生的影响因素分析

【目的】建立羽衣甘蓝小孢子胚植株再生体系,完善羽衣甘蓝小孢子培养技术,为高效稳定地获得羽衣甘蓝双单倍体植株奠定基础。【方法】以名古屋-红、白珊瑚、红鸥、白舞、桃舞、帝王-桃红、P3、X18和X35等9个基因型羽衣甘蓝为试验材料,研究基因型、培养基、琼脂质量分数、低温处理、胚龄和激素对羽衣甘蓝小孢子胚状体植株再生的影响。【结果】9个基因型羽衣甘蓝的小孢子胚植株成苗率差异很大,其中‘红鸥’的胚状体成苗率最高,达到88.6%;附加质量分数1.0%琼脂的MS培养基最适合植株再生;低温处理对胚状体的再生有一定促进作用,但影响不明显;25～30d胚龄胚状体的再生能力较强。附加1.5mg/L 6-BA和0.2mg/L NAA激素的MS培养基有利于胚状体的再生成苗,95%以上的植株能够很好地生根,移栽成活率达75%以上。【结论】对羽衣甘蓝而言,基因型不是其小孢子胚再生能力的惟一决定因素,培养基中有一定量的盐分是小孢子胚再生所必需的条件,小孢子胚萌发成苗时需要相对干燥的环境;在小孢子发育过程中增加脱分化阶段,可使畸形胚、鱼雷型胚或心型胚先形成愈伤组织,再分化形成植株。     

羽衣甘蓝小孢子胚胎细胞结构变化及其植株再生

[目的]研究组织培养过程中羽衣甘蓝小孢子胚胎细胞结构变化及其植株再生,为小孢子培养技术在羽衣甘蓝中的应用提供理论依据.[方法]以12个羽衣甘蓝品种为材料,采用LEICA倒置荧光显微镜研究小孢子热激后的胚胎细胞结构变化、胚胎发育过程及出胚率差异,运用透射显微镜观察胚性小孢子细胞核的融合过程,并分析不同培养基(B5分化培养基和MS分化培养基)及其琼脂浓度(0.8%、1.0%和1.2%)对胚状体成苗率的影响.采用遮盖方式驯化组培苗后移栽大田,统计其成活率.[结果]在12个羽衣甘蓝品种中,除Y4花蕾的小孢子未发育成胚状体外,其他品种花蕾的小孢子均发育成不同数目的胚状体.其中,Y1和Y2平均每个花蕾的出胚数较高,分别为11.84和10.36个;Y3、Y7和Y8平均每个花蕾的出胚数较少,分别为1.55、1.45和0.94个.对于出胚数多的品种,对称分裂是其小孢子细胞分裂的主要方式,小孢子发育形成子叶形胚状体的比例也较高;而出胚数少的品种易发生小孢子不对称分裂,最终形成较多的畸形胚,子叶形胚数量较少.32.5℃热激1 d即可启动小孢子细胞胚胎发育进程,经原胚、球形胚、心形胚、鱼雷形胚,最终形成子叶形胚.热激处理后培养2d小孢子进行第一次对称分裂形成两个大小、形状相似的细胞;培养5~7d后两个细胞(胚性小孢子)逐渐靠近并融合在一起,细胞核核膜紧靠在一起,随后聚结融合,核酸物质混合,融合早期形成类似花生形的细胞核结构.含不同浓度琼脂的B5分化培养基和MS分化培养基中胚状体成苗率排序均表现为0.8%琼脂<1.0%琼脂<1.2%琼脂,且同一琼脂浓度下,B5分化培养基的胚状体成苗率均较MS分化培养基的高.组培苗驯化后移栽大田,成活率可达100%.[结论]通过小孢子培养可快速有效获得羽衣甘蓝小孢子单、双倍体再生植株.在培养过程中,胚性小孢子细胞核融合可能是导致单倍体小孢子自发加倍成为多倍体的重要方式,且含1.2%琼脂的B5分化培养基更适合用于羽衣甘蓝胚状体增殖分化成苗.     

春性甘蓝型油菜胚状体成苗影响因素的研究

【目的】通过对春性甘蓝型油菜胚状体成苗影响因素的研究,以提高胚状体成苗效率,缩短DH群体构建的时间。【方法】以小孢子培养获得的5964个子叶形胚状体为材料,研究了胚状体长度、培养基分装方式、琼脂质量浓度、低温处理时间与胚状体成苗的关系。【结果】胚状体在固体培养基上的放置方式影响其形态发育;长度为3～4mm的胚状体成苗率最高,达到60.1%;分装方式Ⅲ,即分装20min后封口,培养基凝固后表面没有积水的培养基出苗最好,成苗率达到65.2%;随琼脂质量浓度的增加,胚状体成苗率呈先上升后下降的趋势,琼脂质量浓度为12g/L时的成苗率最高,达到61.3%;4℃低温处理14d可使胚状体一次成苗率提高到65.5%。【结论】缺氧和低温处理影响胚状体的形态发育;胚状体发育程度影响成苗率;相对干燥的环境有利于成苗;琼脂质量浓度通过影响培养基中可利用水的分配、培养瓶内湿度以及乙烯浓度影响小孢子胚成苗率;低温可能通过影响胚状体内源激素水平起到提高成苗率的作用。     

小白菜花药培养胚诱导和植株再生

以10个小白菜杂交种为试材,采用花药培养方法,研究胚状体发生及其再生植株的诱导方法.结果表明,不同基因型的小孢子胚状体发生频率有明显差异.有10个基因型诱导得到胚状体.最高的出胚率达到18.31%;适宜浓度的活性炭可以促进胚状体的诱导,培养基中添加谷胺酰氨可以提高胚状体的诱导率;1.0%的琼脂浓度为胚状体继代培养最适宜的浓度,MS 1.0%琼脂为小白菜小孢子植株再生最适宜的培养基.不同透性的封口膜对小白菜生根有很大的影响.     

大白菜小孢子胚诱导和植株再生

研究大白菜游离小孢子胚诱导主要影响因素,旨在优化培养体系,创制优异DH群体,获得纯合育种材料。以15个大白菜杂交种为试材,采用游离小孢子培养方法,研究了基因型、培养基成分、低温预处理、取材时期对小孢子胚发生的影响。结果表明:不同试材的小孢子胚发生频率有明显差异,有13个品种诱导得到了胚状体,最高出胚率达每蕾10.16胚;NLN培养基中添加0.05～0.20mg.L-1的6-BA和0.10mg.L-1NAA对胚状体的发生和发育有促进作用;花蕾低温预处理对胚状体发生有明显促进作用;盛花期取样的小孢子产胚率高于始花期和末花期;改良MS培养基中添加0.10g.L-1的活性炭,有利于胚状体的发育及成苗;MS 0.10mg.L-1NAA为小孢子植株生根最适宜的培养基;建立了高效的大白菜游离小孢子培养与植株再生体系。     

大白菜游离小孢子培养和植株再生

以4个福山包头系列大白菜品种为试材,对游离小孢子培养和植株再生过程中的一些重要因素进行了研究。结果表明,不同基因型对小孢子胚诱导率和成苗率影响较大,平均每个花蕾产胚在1.28~38.25个之间;且胚胎发生能力高的品种,成苗率较高,胚胎发生能力低的品种,成苗率也较低;培养基中添加0.1~0.3 g/L活性炭能明显提高小孢子胚诱导率;及时将成熟的子叶形胚转移至再生培养基上,对提高成苗率至关重要;琼脂浓度为1.0%~2.0%时,成苗率大大提高。     

连州菜心小孢子培养体系的建立

游离小孢子培养技术是快速创制连州菜心双单倍体纯系的一条有效途径,为建立高效的连州菜心小孢子培养体系,应用于优势杂交育种实践,以引进的3个广东省连州市地方菜心品种迟熟连州菜心(17AY007)、连州尺寸心(17AY008)和连州尖叶迟菜心(17AY009)为试材进行小孢子培养,研究不同基因型和植物生长调节剂(芸薹素内酯,BR及噻苯隆,TDZ)对小孢子胚胎发生及植株再生的影响,并对获得的连州菜心小孢子再生植株进行倍性鉴定。结果表明:3个不同基因型连州菜心的小孢子胚胎发生率无显著差异;在NLN-13培养基中添加适宜浓度的BR或TDZ可显著提高连州菜心小孢子胚胎发生率和直接成苗率,其中,当BR浓度为0.04mg·L-1时,17AY007和17AY009的胚诱导率和直接成苗率均达到最高(2.38胚·蕾-1,72.82%;2.83胚·蕾-1,54.62%);当TDZ浓度为0.1mg·L-1和0.2mg·L-1时,17AY007的胚诱导率和直接成苗率分别达到最高(2.67胚·蕾-1,57.76%);TDZ浓度为0.3mg·L-1时,17AY009的胚诱导率和直接成苗率均达到最高(2.42胚·蕾-1,57.36%);3种连州菜心再生植株的双单倍体率均在56%以上,其中,17AY007双单倍体率最高,为64.29%。综上,创制了双单倍体植株42株,为连州菜心优势杂交育种奠定了材料基础。     

组蛋白乙酰化对灵芝生长、灵芝多糖和灵芝酸生物合成的影响

【目的】组蛋白乙酰化修饰对真菌生长发育和次级代谢合成具有重要的调控作用。研究组蛋白乙酰化对静置培养的灵芝生长发育和主要代谢物合成的影响,为表观遗传手段提高灵芝多糖和灵芝酸生物合成提供理论依据。【方法】采用液体振荡-静置两阶段法培养灵芝。在静置培养阶段添加不同浓度(0、0.6、60、120和180μmol·L~(-1))辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA),采用常规方法测定或观察灵芝生物量、糖消耗、上层菌丝膜形成、菌丝体形态、灵芝孢子生成以及灵芝酸和灵芝多糖生物合成,利用蛋白免疫印迹技术测定灵芝组蛋白乙酰化水平;利用qRT-PCR技术对灵芝多糖(ugp、gls和pgm)、灵芝酸(hmgr、sqs、se和ls)生物合成关键基因以及灵芝全局调控因子相关基因(vet和LaeA)进行表达分析。【结果】SAHA处理使灵芝组蛋白H_4乙酰化水平提高,最高为对照组的1.6倍;抑制了灵芝菌丝体生长和色素产生,改变了菌丝体的形态。灵芝孢子的形成也受到抑制,且SAHA浓度越大,抑制程度越明显。SAHA处理显著增加了灵芝多糖的产量,最高增加50%;灵芝酸生物合成受到抑制,与对照相比降低13%—27%;qRT-PCR分析结果表明SAHA处理下灵芝多糖与灵芝酸合成关键酶基因表达均有不同程度上调,其中灵芝多糖合成关键酶基因提升1.5—3.5倍,灵芝酸合成关键酶基因提升1.8—12.1倍;灵芝全局性调控因子vet和LaeA的表达被抑制,仅为对照组的11.30%—62.4%。【结论】组蛋白乙酰化可通过灵芝全局调控因子调控灵芝生长发育进而影响灵芝酸生物合成,同时组蛋白乙酰化对灵芝多糖生物合也有影响。     

甘蓝游离小孢子培养中影响胚状体形成的主要因素

以甘蓝的19个基因型为试材,对影响甘蓝游离小孢子培养诱导胚状体形成的3个主要因素进行了研究。结果表明:供体植株基因型是影响小孢子发生胚状体的关键因素,不同材料之间的诱导频率差异显著;两种激素以不添加6-BA和NAA或只添加6-BA 0.05 mg/L为甘蓝游离小孢子培养的最适激素浓度;高温处理能显著提高小孢子培养的出胚率,供试材料经33℃热激处理后出胚率最高,出胚率高达6.10胚/蕾。     

影响青花菜游离小孢子培养胚胎发生的因子

以13个青花菜品种为材料进行游离小孢子培养,探讨影响青花菜小孢子胚胎发生的因子。结果表明:基因型是影响青花菜小孢子培养胚状体发生的关键因子,13种基因型中有8种基因型能诱导产生胚状体,诱导率为61.5%;处于单核晚期至双核期的小孢子是诱导小孢子胚状体发生的最佳时期;在1/2 NLN培养基中添加适量的活性炭、6-BA、AgNO3和2,4-D有利于胚胎发生。4℃预处理24 h和32.5℃热激24 h有利于小孢子产生胚状体。     

光照和激素对耐热型大白菜游离小孢子培养的影响

将分离纯化的小孢子悬浮培养在添加0,0.1,0.2,0.3,0.5,1.0 mg/L的NAA和0,0.05,0.1,0.2,0.3,0.5,1.0mg/L 6-BA的NLN培养基中,在A(3 000 lx光培养)、B(10 d暗培养再3 000 lx光培养)、C(15 d暗培养再3 000 lx光培养)、D(ck,暗培养)条件下进行培养,研究光照和激素对耐热型大白菜"夏将军"游离小孢子成胚及胚状体发育的影响。结果表明:0.1 mg/L 6-BA能显著促进胚状体的发生,使胚产量达到最高,为206个。同时附加0.2mg/LNAA不但保证有较高的胚产量(205个),还可促进胚状体发育,子叶胚及萌发胚可达33.7%,畸形胚比例下降到14.1%;暗培养能促进成胚,D处理成胚量高,达149个,光培养则明显抑制成胚,但可促进胚状体发育,提高成苗率,其中以B处理成胚成苗效果较好,成胚108个,成苗率145%。     

油菜小孢子培养技术体系研究

小孢子培养在油菜的基础研究和应用研究中均具有十分重要的意义。自1982年Lichter首 在甘蓝型油菜中进行小孢子培养获得成功以来,国内外在油菜小孢子培养技术方面已取得大量研 成果,包括油菜小孢子胚状体发生的影响因素,小孢子植株的再生、成苗、大田移栽、染色体加倍等 近年来又对一些关键技术环节加以了改进,笔者在对这些研究成果进行总结的基础上针对中国国 建立了大田条件下油菜高效小孢子培养技术体系。用该体系对甘蓝型油菜和新疆野生油菜的体细 杂种后代进行小孢子培养的出胚率达到300枚/皿以上,采用小孢子苗直接移栽大田技术,成活率 到89．0％。此外还成功构建了含127个DH系的黄籽油菜DH群体及含115个DH系的粒重分 离 体。     

甘蓝型油菜小孢子培养技术优化

为了优化甘蓝型油菜小孢子培养技术,提高胚诱导率及成苗率,以油菜N14009为试验材料进行小孢子培养,研究变温预处理、活性炭浓度、培养基类型和琼脂浓度及秋水仙碱浓度对小孢子培养的影响。结果表明：4℃、32.5℃变温预处理各1 d的处理效果较好,胚诱导率为4.23胚/蕾;活性炭质量浓度为0.5 g/L时,胚诱导率达到4.23胚/蕾,效果最好; MS、B5培养基中琼脂质量浓度为12 g/L时,成苗率均最高,分别达51.16%、46.67%;把再生植株转到含有不同质量浓度秋水碱的MS培养基上培养,质量浓度为80 mg/L时,N14009的加倍率最高,为43.47%,并且成苗率达到76.67%。     

影响甘蓝小孢子胚状体发生的因素研究

以6个甘蓝杂交种为试材,采用游离小孢子培养方法,研究影响胚状体发生的因素。结果表明:花蕾长度为3.00~4.00 mm时,有利于获得胚状体;1 500 r/min离心、32.5℃热激24 h,最有利于胚状体的诱导;花蕾经低温4℃预处理24 h,可提高胚诱导率;低速振荡培养能够促进胚状体发生;基因型在小孢子胚状体诱导中起着主导作用。     

大白菜游离小孢子培养成胚影响因素的研究

选取大白菜雄性不育系转育中间材料进行游离小孢子培养，探讨了基因型、株龄、激素浓度、低温处理时间对大白菜成胚率的影响。结果表明，基因型对成胚有一定影响，从最高322个胚／30个花蕾到没有胚状体产生；株龄对胚诱导率有一定影响，在盛花期和末花期采集花蕾进行游离小孢子培养产胚率最高；在培养基中加入6-BA能明显促进胚状体的发生，0．05mg／L的培养基上胚产量最高；低温预处理也能提高小孢子胚产率，最适宜的时间为24h。     

组蛋白乙酰化对灵芝生长、灵芝多糖和灵芝酸生物合成的影响

【目的】组蛋白乙酰化修饰对真菌生长发育和次级代谢合成具有重要的调控作用。研究组蛋白乙酰化对静置培养的灵芝生长发育和主要代谢物合成的影响,为表观遗传手段提高灵芝多糖和灵芝酸生物合成提供理论依据。【方法】采用液体振荡-静置两阶段法培养灵芝。在静置培养阶段添加不同浓度（0、0.6、60、120和180 μmol·L ^-1）辛二酰苯胺异羟肟酸（SAHA）,采用常规方法测定或观察灵芝生物量、糖消耗、上层菌丝膜形成、菌丝体形态、灵芝孢子生成以及灵芝酸和灵芝多糖生物合成,利用蛋白免疫印迹技术测定灵芝组蛋白乙酰化水平;利用qRT-PCR技术对灵芝多糖（ugp、gls和pgm）、灵芝酸（hmgr、sqs、se和ls）生物合成关键基因以及灵芝全局调控因子相关基因（vet和LaeA）进行表达分析。【结果】SAHA处理使灵芝组蛋白H4乙酰化水平提高,最高为对照组的1.6倍;抑制了灵芝菌丝体生长和色素产生,改变了菌丝体的形态。灵芝孢子的形成也受到抑制,且SAHA浓度越大,抑制程度越明显。SAHA处理显著增加了灵芝多糖的产量,最高增加50%;灵芝酸生物合成受到抑制,与对照相比降低13%—27%;qRT-PCR分析结果表明SAHA处理下灵芝多糖与灵芝酸合成关键酶基因表达均有不同程度上调,其中灵芝多糖合成关键酶基因提升1.5—3.5倍,灵芝酸合成关键酶基因提升1.8—12.1倍;灵芝全局性调控因子vet和LaeA的表达被抑制,仅为对照组的11.30%—62.4%。【结论】组蛋白乙酰化可通过灵芝全局调控因子调控灵芝生长发育进而影响灵芝酸生物合成,同时组蛋白乙酰化对灵芝多糖生物合也有影响。     

大白菜游离小孢子培养中胚胎发生及发育途径

[目的]观察大白菜离体小孢子培养中的胚胎发生及发育途径.[方法]以大白菜F1代杂交种为试材,采用光学显微镜观察游离小孢子胚胎发生和发育途径.[结果]细胞热激后膨大是胚状体诱导的关键因素.大白菜小孢子诱导成胚有3种途径,小孢子均等分裂途径、小孢子不均等分裂途径和小孢子直接萌发出胚途径.均等分裂途径是在连续的均等分裂以后形成原胚,原胚继续分裂形成球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶形胚.不均等分裂途径形成的两个细胞中较大的细胞继续分裂最终形成有极性的胚状体.[结论]该研究结果为大白菜小孢子的高频率诱导提供细胞学依据.     

油菜小孢子培养技术及其在遗传育种中的应用研究概况

小孢子培养作为一种辅助育种手段越来越受到育种家的重视,并应用于各个领域。由于影响小孢子成胚和成苗的因素较多,低诱导频率及成苗率严重限制了该技术在育种中的应用。为了全面了解小孢子胚状体发生能力及影响再生体系的各项因素,掌握该技术的研究动态和发展方向,本文总结了近年来国内外影响小孢子培养的主要因素：供体植株基因型、供体植株生长条件及生理状态、小孢子发育时期、培养基组成、培养条件,以及在双单倍体育种、诱变育种、转基因育种等领域中的应用。     

叶用芥菜小孢子离体培养条件

以5个叶用芥菜Brassica juncea var. foliosa品种为试材, 研究了游离小孢子培养过程中基因型、低温预处理、高温热激、更新及加液和秋水仙碱等对小孢子胚状体发生的影响。结果表明:有4个品种获得胚状体, 各品种间胚状体产量存在显著差异, ‘特选九心芥’胚产量最高;4℃低温预处理24~48 h及33~34℃高温热激处理24~48 h对诱导胚状体发生和发育有促进作用;更新和添加培养基处理也可促进胚状体发生, 以质量浓度为170.0 g·L-1的蔗糖起始培养48 h后添加等质量浓度90.0 g·L-1蔗糖培养基处理效果最佳;1~10 mg·L-1秋水仙碱24~48 h处理可提高小孢子培养反应, 增加供试材料胚产量。     

甘蓝型油菜及其种间和属间杂种小孢子胚状体的诱导

１９９２年和１９９３年对田间的１７个甘蓝型油菜品种（系），６个属种间杂种的小孢子进行了培养，并对基本培养基，蔗糖浓度和激素对小孢子胚状诱导的影响进行了研究，以建立田间植株的小孢子培养体系。试验结果表明，ＮＬＮ，ＫＲ和Ｋ三种培养基均可使小孢子形成胚状体，但从产胚率和胚状体的质量看，以ＮＬＮ最佳。在所有的处理中，１０％蔗糖没有诱导出胚状体，１３％蔗糖是有效的。在两年的试验中，０．０１－０．１ｍｇ·Ｌ＾