新型鹅星状病毒ORF2蛋白纳米抗体的筛选及鉴定

【目的】由新型鹅星状病毒(novel goose astrovirus, nGAstV)引起的雏鹅痛风病对我国养鹅业造成了重大经济损失。通过构建nGAstV纳米抗体(nanobody, Nb)噬菌体展示文库,获得识别nGAstV ORF2蛋白的特异性Nb,可为建立nGAstV抗体检测方法及研究nGAstV ORF2蛋白结构和功能奠定基础。【方法】使用蔗糖密度梯度离心方法纯化在LMH细胞中增殖的nGAstV,RT-PCR鉴定nGAstV并通过细胞病变测定nGAstV滴度。用0.06%甲醛溶液灭活纯化的nGAstV作为免疫原,免疫两周岁羊驼。首次免疫时用灭活纯化的nGAstV与等量弗氏完全佐剂乳化后免疫,第2—5次免疫用灭活纯化的nGAstV与等量弗氏不完全佐剂乳化。每间隔两周免疫一次,每次免疫剂量均为50μg。第5次免疫14 d后,通过间接ELISA方法测定羊驼血清中针对nGAstV的IgG抗体效价。待IgG抗体效价达到构建噬菌体抗体展示文库标准时,分离羊驼外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte, PBL),然后提取PBL总RNA将其反转录为cDNA,利用...     

新型鹅星状病毒FJ-NP株的分离鉴定

[目的] 确定福建某鹅场雏鹅以痛风为主要病征导致高死亡率的病原.[方法] 2019年8月福建省南平市某鹅场暴发一种以痛风为主要特征的疾病,该病在5～20日龄的雏鹅中发病率高达40％,死亡率为80％,对该场采集的3份样品进行实验室检测和病原分离鉴定.[结果] PCR检测结果显示3份样品新型鹅星状病毒均为阳性;细菌分离结果...     

鹅星状病毒刺突蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备鹅星状病毒(goose astrovirus, GAstV)刺突(Spike)蛋白的单克隆抗体,并对获得的单克隆抗体的生物学特性进行鉴定,将大肠杆菌表达的截短Spike蛋白免疫BALB/c小鼠,经细胞融合和单克隆抗体的筛选来获得阳性杂交瘤细胞,并进一步利用免疫印迹和间接免疫荧光技术进行单抗的鉴定;采用ELISA技术进行单克隆抗体亚型、抗体效价的测定;同时根据GAstV XX株Spike蛋白序列合成重叠的多肽库进行单抗识别的抗原表位鉴定。共获得3株阳性杂交瘤细胞,分别命名为1A5、2B4、12E6;免疫印迹和间接免疫荧光实验显示3株单克隆抗体均与Spike蛋白具有良好的免疫反应,其中2B4、12E6可与GAstV发生反应;亚型鉴定结果显示单抗12E6、2B4为IgG2b亚类,单抗1A5为IgG2a亚类;轻链均为κ链;敏感性结果显示,抗体效价都在1∶51 200以上;抗原表位的鉴定结果表明单抗1A5识别的抗原表位为(EP16)ELRNRLNIADGDYVI,单抗2B4识别的抗原表位为(EP21)AGDSNPGETFQNFKM。本研究成功制备了针对GAstV Spike蛋白的单克隆抗...     

鹅星状病毒衣壳纤突蛋白VP27多克隆抗体的制备和鉴定

采用RT-PCR扩增获得鹅星状病毒(Goose astrovirus)的衣壳纤突蛋白基因vp27,并将其克隆至pCold-SUMO原核表达载体.重组表达载体pCold-vp27经过测序和双酶切验证正确后,转化到感受态细胞Rosetta.挑取阳性克隆子,利用异丙基硫代半乳糖苷诱导表达鹅星状病毒衣壳纤突重组蛋白,使用镍柱纯...     

鹅星状病毒的流行病学及研究进展

鹅星状病毒（Goose astrovirus, GAstV）是小型无包膜病毒,其基因组由单股正链 RNA 分子组成,基因组长度为 7.1~7.3 kb。GAstV 是星状病毒科禽星状病毒属的新成员,根据基因同源性及遗传距离可将其分为2 个基因群（GAstV-1、GAstV-2）,目前尚未参与官方分类系统。GAstV 感染可导致鹅腹泻、生长抑制,出现以关节尿酸盐沉积和内脏尿酸盐沉积为主的临床症状,被认为是导致鹅痛风的主要病原。目前缺少针对 GAstV的商品化疫苗或治疗药物,主要依靠生物安全措施进行防控。2017 年,我国研究人员于首次在山东省的痛风鹅群中检测并分离到 GAstV 毒株。GAstV 传播速度快,辐射地区广,同年在广东、福建、安徽等地均有相关病例报道,造成高达 12 亿 ~15 亿元的经济损失。GAstV 发病率可达 80%,死亡率可达 50%,GAstV 可导致鹅免疫抑制,在饲养过程中易感染其他病原,造成更严重的临床症状,加大了病原防控难度。GAstV 不仅感染天然宿主鹅,还具有跨越物种屏障的能力,能引起鸡和鸭腹泻、生长抑制,并引发内脏或关节尿酸盐沉积。这提示我们 GAstV 或具有人畜传播的潜力,后续应加强对 GAstV 的流行病学监测,密切关注其传播特性的变化。目前GAstV 的病原检测已取得一定研究进展,且建立了多种能够高效准确地检测 GAstV 的技术方法。但对 GAstV 致病机制的研究尚未深入,疫苗制备方面的研究较为薄弱,且 GAstV 尚无统一有效的体外培养方法,严重阻碍了病原的基础研究。为更好地了解 GAstV 对我国鹅养殖业的影响,本文从 GAstV 的病原学、流行病学、宿主免疫应答和 GAstV 与痛风的关联 4 个方面进行综述,为 GAstV 的后续研究及科学防治提供参考。     

浙江地区鹅星状病毒分离鉴定及其衣壳蛋白多克隆抗体的制备

鹅星状病毒(GAstV)是当前鹅养殖业的重要病原,易引起雏鹅内脏痛风症状和死亡,造成巨大经济损失。于浙江省内采集30份病料,进行核酸检测、病原分离和测序,并克隆其ORF2序列至pET-28a原核表达载体,转化BL21菌株后经诱导获得衣壳蛋白,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。结果显示,临床死亡雏鹅剖检均发现典型内脏痛风症状,核酸检测鉴定为鹅星状病毒阳性,且出现不同基因型鹅星状病毒混合感染情况。共分离得到ZJC14和ZJLD20两个毒株,其中,ZJLD20在鹅胚和LMH细胞中均稳定增殖,但ZJC14并不能适应LMH细胞。病毒基因组测序显示,ZJC14与ZJLD20亲缘关系较远,ZJC14属于GAstV-Ⅰ基因型,而ZJLD20为GAstV-Ⅱ基因型。重组表达载体pET28a-ORF2诱导后获得纯化目的蛋白,经免疫成功制备兔源多克隆抗体,该抗体可与目的蛋白结合。此外,间接免疫荧光和Western-blot试验结果显示,ZJLD20衣壳蛋白制备的多克隆抗体可与病毒结合反应。研究成果有利于后续对该病原致病能力的研究,同时,试验制备的ORF2衣壳蛋白与多克隆抗体为鹅源星状病毒感染的诊断试剂开发奠定了基础。     

新型鹅星状病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

[目的]建立一种新型鹅星状病毒(New goose astrovirus,NGAstV)的RT-PCR检测方法.[方法]根据ORF2基因序列,利用Oligo 7软件设计并筛选出特异性扩增引物,通过优化扩增条件,建立检测新型鹅星状病毒的RT-PCR方法,对其进行特异性及敏感性检验,并在临床上进行初步应用.[结果]RT-P...     

鹅细小病毒蛋白研究进展

鹅细小病毒有5种蛋白,包括2种非结构蛋白和3种结构蛋白,该文简述了这5种蛋白的性质、特点、功能,并综述了鹅细小病毒蛋白体外表达研究进展。     

不同基因型鹅星状病毒鉴别诊断RT-PCR方法的建立

鹅星状病毒(GAstV)是近年临床新发病原,也是导致当前雏鹅痛风致死的主要病因,研究显示该病毒存在两种不同基因型。为建立快速准确的核酸鉴别诊断方法,本研究针对不同基因型GAstV保守域RNA依赖性RNA聚合酶序列各设计1对特异性引物,建立以RNA为模板的双重一步法RT-PCR检测方法。条件优化试验结果显示,双重RT-PCR方法彼此无干扰;引物特异性强,对坦布苏病毒、鹅细小病毒、呼肠孤病毒、鸭瘟病毒的检测均为阴性;体系中引物适宜浓度为1 μmol,退火温度范围广,50~54 ℃皆可;敏感性高,最低检测限分别为10³拷贝数和10²拷贝数。对采集自江浙地区的73份样品进行检测,结果显示,鹅星状病毒阳性率为93.2%,主要为Ⅱ型星状病毒的单一感染(阳性率86.3%),部分样品呈现两种类型星状病毒混合感染现象(阳性率6.8%)。上述结果表明本研究建立的双重RT-PCR方法可用于GAstV的鉴别诊断和分子流行病学调查。     

鹅星状病毒SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法的建立

为建立快速检测鹅星状病毒(GAstV)的方法,本研究根据GenBank中GAstV ORF2基因序列设计1对特异性引物,构建重组质粒pMD19-T-GAstV,以其作为标准品建立了GAstV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。优化其反应条件及体系,进行特异性、敏感性和重复性试验以及临床样本检测。试验结果显示,除GAstV外,禽白血病病毒(ALV)、血清4型禽腺病毒(FAdV-4)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)和鸡传染性贫血病病毒(CIAV)等常见禽病病原利用该方法检测均呈阴性,表明其特异性良好;建立的荧光定量RT-PCR检出的最低模板含量为1μl 3.75×10~1拷贝,敏感性较高;组内和组间重复性试验变异系数均小于1%。利用该方法对来自安徽地区的32份临床样品进行检测,阳性检出率为43.75%,常规PCR方法阳性检出率为18.75%,阳性检出符合率100%,表明该方法可用于临床样品检测。该方法的建立为临床样品中GAstV的快速高效检测提供了技术支持。     

新型鹅星状病毒一步法RT-PCR检测方法的建立与应用

新型鹅星状病毒(goose astrovirus,GoAstV)感染引起的鹅痛风病,是近年严重危害我国养鹅业的传染病之一,给我国养鹅产业造成严重经济损失,快速准确诊断有助于更好地防控该病.为了建立一种鉴定新型GoAstV的一步法RT-PCR方法,根据新型GoAstV ORF2基因序列设计特异性引物,构建质粒标准品,并对...     

鹅星状病毒卵黄抗体的制备及安全性、免疫效力研究

为了防控鹅星状病毒(GAstV)感染引起的鹅痛风病,研究制备了GAstV灭活疫苗并按不同免疫程序免疫了产蛋鸡,通过酸化水-辛酸法制备了卵黄抗体,经中和试验和SDS-PAGE试验比较了其与氯仿法、聚乙二醇法和硫酸法制备的卵黄抗体的中和效价和纯度差异,同时对卵黄抗体的安全性与免疫效力进行了评价.结果表明:三次免疫均为灭活疫...     

鹅星状病毒XX株的分离鉴定及遗传特征分析

为研究引起雏鹅痛风疫情的鹅星状病毒(Goose astrovirus,GAstV)河南流行株的基因组特征,从患有痛风的雏鹅样品中分离了1株GAstV,命名为XX株,并对分离毒株进行了全基因组测序和遗传特征分析.结果显示,GAstV XX株可在LMH细胞上稳定传代,但无明显的细胞病变;该毒株基因组全长7252 bp,与代...     

安徽省5株新型鹅星状病毒的分离鉴定与遗传进化分析

为研究近年来引起雏鹅痛风病的新型鹅星状病毒流行毒株的病原学和遗传学特征,于2018—2021年从安徽省疑似感染新型鹅星状病毒的雏鹅中采集病料,使用健康鹅胚进行病毒分离,并对分离到的毒株进行全基因组测序和序列分析。结果表明,共分离鉴定到5例新型鹅星状病毒感染样品,利用鹅胚盲传3代成功分离到5株新型鹅星状病毒,均可在鹅胚上稳定传代,分别将其命名为AHAU2018、DY-19、ZY02、HR2105/2和HR2110/1株。全基因组测序结果表明,5株分离毒株的基因组全长均为7 175 nt。系统进化树分析结果表明,5株分离毒株均属于致雏鹅痛风的新型鹅星状病毒,但2019年前的毒株与2019年后的毒株处于不同的进化亚分支上。新型鹅星状病毒在我国已发生变异,出现了新的进化亚分支,但优势基因型是否发生变化还有待进一步研究。     

一例鹅痛风的诊断与防控

鹅痛风主要的临床症状是精神沉郁、食欲减退甚至废绝、其关节发生肿大、行走缓慢、 大量的尿酸盐在关节腔及脏器表面沉积。危害性较高,给全国养鹅业带来了严重的的经济损失。本文介绍了2020年7月安徽省芜湖市繁昌区某养鹅场出现鹅痛风病例,根据临床症状以及实验室PCR检测,最终确诊为是鹅痛风病。如何预防以及治疗鹅痛风,大部分的养殖户缺乏这一方面的知识,即使发现该疾病以及提供一个很好的治疗方案是所有养殖户所需要的。本文对该病发生的原因进行了分析以及提出了如何防控的一些建议,希望对相关人员有一定的帮助。     

鹅源星状病毒ORF2基因原核表达及遗传进化分析

应用RT-PCR方法扩增鹅源星状病毒(goose astrovirus,GoAstV)HLJ01株的ORF2基因,将扩增产物克隆至pET32a原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21进行表达。通过SDS-PAGE分析表明,重组菌诱导后得到大小约为106 ku的ORF2蛋白,与理论值相符。将诱导表达的蛋白经镍亲和层析柱纯化后免疫小鼠制备多克隆抗体,并测定其抗体效价。Western-blotting结果显示,ORF2蛋白可被鼠抗GoAstV阳性血清识别。序列分析表明,该毒株与其他鹅源星状病毒参考毒株的核苷酸相似性介于37.8%～99.3%之间,HLJ-1801分离株与已发表的8株鹅源星状病毒毒株位于同一分支,表明其属于一种新型星状病毒成员。利用原核表达系统成功高效地表达了GoAstV ORF2蛋白,融合蛋白以包涵体形式存在。本试验成功获得了纯化的ORF2重组蛋白和小鼠抗GoAstV多克隆抗体,为进一步研究ORF2蛋白对星状病毒感染的诊断试剂的研发奠定了基础。     

鹅细小病毒辽宁株主要结构蛋白基因的克隆及遗传进化分析

根据GenBank登陆的鹅细小病毒B株全基因组的核苷酸序列.设计合成一对引物.用PCR方法对GPV LN-1/06株的主要结构蛋白基因进行克隆,并对克隆的片段进行序列测定,用生物信息学软件进行序列分析.结果表明:所扩增的GPV LN-1/06株的基因长度为1605bp,包括VP3完整的开放阅读框,共编码534个氨基酸.与登录的20株国内和国外的GPV的VP3基因序列进行同源性分析表明,GPV LN-1/06株与其他20株VP3基因的核苷酸同源性较高,从93%至99%,说明GPV的VP3基因较为保守.系统进化树分析表明GPV-LN01/06病毒株与HG5/82为一组,具有较近的亲缘关系.本试验首次获得辽宁地区鹅细小病毒流行株的主要结构蛋白基因(VP3)的核苷酸序列,为研究国内外GPV的遗传演化规律提供参考资料.     

鹅坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅲ的原核表达及抗原性分析

[目的]获得鹅坦布苏病毒(GTMUV)E蛋白结构域Ⅲ的原核表达重组蛋白并明确其免疫原性,为进一步研究其生物学功能及研制亚单位疫苗奠定基础.[方法]根据GenBank中GTMUVJS804株E蛋白结构域Ⅲ的同源基因序列设计1对引物,在其两端加入Flag标签序列和酶切位点,采用PCR扩增GTMUV的E蛋白结构域Ⅲ基因(EⅢ),然后与pET32a原核表达载体连接构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21 (DE3)后用IPTG诱导融合蛋白表达,并以Westernblotting鉴定其免疫原性.[结果]PCR扩增获得携带Flag标签序列的EⅢ基因片段约430 bp,将其插入pET32a载体可成功构建重组质粒pET32a-EⅢ.阳性重组菌经IPTG诱导表达5h即可得到融合蛋白,分子质量约33.0 kDa,主要以包涵体形式存在.Westem blotting鉴定结果显示,融合蛋白与抗Flag标签单克隆抗体、小鼠抗坦布苏病毒多克隆抗体均可发生特异性反应,检测到预期的目的条带.[结论]GTMUV E蛋白结构域Ⅲ能在大肠杆菌中成功诱导表达,且获得的融合蛋白具有良好的免疫原性,可用于研制GTMUV诊断抗原和亚单位疫苗.