小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备条件的研究

为了建立活力稳定的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层,本实验以13．5～14．5d的ICR小鼠胚胎为实验材料,以MTT法测定细胞活力,探讨了不同浓度的丝裂霉素C、丝裂霉素C不同处理时间及不同的成纤维细胞接种密度对MEF活力的影响。结果表明：10μg／ml的丝裂霉素C处理后的MEF活力比其他浓度（1μg／ml、5μg／ml、20μg／ml、30μg／ml）丝裂霉素C处理后的MEF活力稳定;用10μg／ml的丝裂霉素C处理2．5h,MEF活力比处理1．5h、3．5h、4．5h稳定;以2．5～35×10^5／ml密度接种于96孔板上,每孔200μl,MEF活力较接种密度为1．5×10^5／ml、4．5×10^5／ml、7．5×10^5／ml稳定。结论：用10μg／ml丝裂霉素C处理MEF 2．5h,2．5～3．5×10^5／m;密度接种于96孔板上,每孔200μl,以10％的胎牛血清培养液培养能得到活力稳定高效的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层。     

丝裂霉素C对ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备的影响

目的：探索不同浓度的丝裂霉素c（MMC）处理对ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备的影响,用于分离和培养干细胞。方法：取13．5d胎龄ICR鼠胚分离原代成纤维细胞,利用不同浓度MMC处理胚胎成纤维细胞制备饲养层,比较观察MMC对细胞增殖的抑制作用,制作细胞生长曲线;取妊娠3．5d的ICR小鼠胚胎在不同浓度MMC处理的饲养层上培养,观察胚胎贴壁和增殖情况。结果与结论：胎儿成纤维细胞贴壁生长,增殖迅速,6代后细胞逐渐衰老;MMC能有效抑制胎儿成纤维细胞的增殖,最佳处理方法为20μg／ml、2h。妊娠3．5d的ICR小鼠胚胎在10、20μg／mlMMC处理的饲养层上孵出率和贴壁率显著高于5／Lg／mlMMC处理的饲养层,在5、10和20μg／m[MMC处理的饲养层上,内细胞团增殖率无显著差异。因此,ICR小鼠胚胎成纤维细胞最佳处理方法为20μg／mlMMC作用2h。     

小鼠胚胎成纤维细胞的分离和饲养层细胞的制备

通过实验确定分离小鼠胚胎成纤维细胞的最适胚龄,探讨小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的效果及其寿命。结果表明,从１０ 、１１ ｄ 小鼠胚胎所获的胚胎成纤维细胞中混有大量神经母细胞和红细胞;用１４ 、１５ ｄ 的胚胎则基本不能获得胚胎成纤维细胞;消化３ ～４ 个１２ ～１３ ｄ 胚胎所获细胞悬液可接种８～９ 个２５ ｃｍ２ 的培养瓶。从一只孕鼠的所有胚胎所获的成纤维细胞可接种约２０ 个２５ ｃｍ２ 的培养瓶。所获细胞悬液的活细胞百分率可达９０％ ,接种成活率达８５ ％ 。胚胎成纤维细胞贴壁时间为５～６ ｈ ,１２ ｈ 后进入增殖期,４８ ｈ 形成细胞单层。ＥＳ细胞克隆在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上形态典型、增殖迅速、不分化。饲养层寿命可维持２ ～３ 周。     

小鼠胎儿成纤维细胞饲养层制备的研究

研究主要探讨在制备小鼠胎儿成纤雏饲养层中，不同处理条件对小鼠胎儿成纤雏细胞分裂与存活的影响。结果表明：小鼠胎儿成纤雏细胞用适当处理浓度的丝裂霉素-C或适当强度的γ-射线处理一定的时间(10μg／mL 1-4h,20μg／mL 1—2．5h或21Gy和28Gy各处理1h)，能有效地抑制其分裂，且不影响其活力。     

水牛胚胎生殖干细胞饲养层体系的建立

本试验对水牛胚胎生殖干细胞饲养层体系建立进行了研究。首先比较了组织块法和酶消化法培养水牛胎儿成纤维细胞的差异;其次探讨丝裂霉素处理水牛胎儿成纤维细胞的有效时间;最后以建立的饲养层体系培养水牛胚胎生殖干细胞。结果表明：（1）组织块法培养的细胞状态优于酶消化法,组织块培养法更适于水牛胎儿成纤维细胞的分离培养;（2）第三代的水牛胎儿成纤维细胞核型正常,状态良好,可用于饲养层的制备;（3）通过MTT和Brdu法检测,确定10mg／L的丝裂霉素C处理水牛胎儿成纤维细胞3．5h能有效抑制成纤维细胞增殖且细胞形态良好;（4）在本试验条件下制备的饲养层能有效维持水牛胚胎生殖千细胞至8代。     

影响小鼠胎儿成纤维细胞饲养层的因素

本研究从丝裂霉素 - C处理时间、消化时间及细胞浓度等方面比较了诸因素对小鼠胎儿成纤维细胞饲养层的影响。结果表明 ,1 0 μg/m L 丝裂霉素 - C处理以 1 .5～ 2 h为宜 ,0 .2 %胰酶 + 0 .0 4% EDTA消化时间以 2～ 3min( 37℃ )为宜 ,接种浓度以 3～ 3.5×1 0 5m L- 1为宜。在成纤维细胞的分离过程中 ,接种后 30 min换液 ,能达到纯化成纤维细胞的效果。     

以两种不同成纤维细胞为饲养层培养牛胚胎干细胞的比较

牛胚胎干细胞的培养一直未能确定最适合的饲养层,寻找一种适合于其生长的饲养层对于成功培养牛胚胎干细胞有重要意义。本研究以胎鼠和牛胎儿为材料,分别以含10%FBS的高糖DMEM和含10%FBS的DMEMF12为培养液,分离并且获得2～5代的胎鼠成纤维细胞和5～6代的牛胎儿成纤维细胞。在上述两种成纤维细胞为饲养层的条件下,采用含10%胎牛血清、0.1 mmol/Lβ-巯基乙醇、0.1 mmol/L非必须氨基酸、100 U/mL青霉素、0.05 mg/mL链霉素、20 ng/mL LIF和10 ng/mL bFGF的DMEMF12培养液培养牛胚胎干细胞,来寻找一种适合于牛胚胎干细胞培养的饲养层。结果表明,在相同的培养体系条件下培养牛胚胎干细胞,以胎鼠成纤维细胞为饲养层的贴壁率显著高于以牛胎儿成纤维细胞为饲养层的贴壁率(P0.05),以牛胎儿成纤维细胞为饲养层更利于胚胎滋养层的去除。     

饲养层细胞的接种密度对分离培养胚胎干细胞的影响

建立有效的昆明白小鼠胎儿成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast,MEF)饲养层培养体系,用于分离和培养小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES细胞)的研究.(1)取怀孕14.5 d昆明白小鼠胎儿分离成纤维细胞,利用体外培养体系分离传代,选取生长旺盛并且已纯化的P3代的MEF,经丝裂霉素处理后.用细胞计数板计算活细胞数,分别按1×104、1×106、1×108/mL密度接种,制备饲养层,观察不同密度饲养层的生长状况.(2)取怀孕4 d的昆明白小鼠囊胚,接种在不同密度饲养层上.观察不同密度饲养层上囊胚、ICM及ES细胞的克隆生长情况.结果显示:囊胚在密度为1 × 106/mL的饲养层上,贴壁率和ICM孵出率分别为(97.0±3.606)%和(96.3±2.887)%,显著高于其他2组;密度为1×104/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率高于密度为1×104/mL(差异极显著,P<0.01)和1×108/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率(差异显著,P<0.05);而1×104/mL饲养层和1×108/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率差异不显著(P>0.05).结果表明:以1×104/mL密度接种的MEF作为饲养层,最适合用于分离培养昆明白小鼠ES细胞,有利于囊胚的发育,ICM的增殖,促进ES细胞的增殖,并起到抑制其分化的作用.     

影响制备小鼠胎儿成纤维细胞饲养层的因素

为了建立活力稳定高效的小鼠胎儿成纤维细胞饲养层,实验以13.5~14.5 d的ICR小鼠胚胎为实验材料,以MTT法测定细胞活力,探讨了用丝裂霉素C处理MEF后,含有不同浓度胎牛血清的培养基对MEF活力的影响,以及不同传代次数的MEF对其活力的影响。结果表明:用含10%的胎牛血清培养液培养丝裂霉素C处理后的MEF,其活力比含2%、5%、20%的FBS培养液稳定。对不同传代次数的MEF进行处理后,第1、3代的MEF活力比第5、7代的MEF活力稳定。结论:用丝裂霉素C处理第1到第3代的MEF,以10%的胎牛血清培养液培养能得到活力稳定高效的小鼠胎儿成纤维细胞饲养层。     

昆明系小鼠饲养层细胞制备条件的优化

通过分离不同胚龄的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF),对MEF进行连续传代培养,并对MEF不同的消化时间进行探讨,研究影响小鼠胚胎成纤维细胞分离与培养的因素.结果表明,分离小鼠胚胎成纤维细胞的最适胚龄是12.5 d～14.5 d;37℃条件下,用2.5 g/L胰蛋白酶作用PMEF,作用时间不应超过15min;离散贴壁的成纤维细胞,作用时间以2 min～3 min为宜;MEF在第2代～第5代增殖旺盛,7代以后细胞出现急剧下降.所以选择第3代MEF是制做饲养层的最佳时机.MEF分离方法简单,来源方便,增殖迅速,是用于胚胎干细胞分离培养的有效培养体系.     

丝裂霉素C和γ射线对小鼠胎儿成纤维细胞饲养层制备的影响

用丝裂霉素C和γ射线对小鼠胎儿成纤维细胞进行处理，观察它们对小鼠胎儿成纤维细胞分裂与存活的影响。结果表明，小鼠胎儿成纤维细胞用不同浓度的丝裂霉素C或不同强度的)，射线处理一定时间(5μg／mL 4h、10μg／mL 1～4h、20μg／mL 1．0～2．5h或14Gy 1h、21Gy 1h、28Gy 1h)，能有效地抑制其分裂，且不影响其活力。     

小鼠胚胎干细胞成纤维细胞液养层的制备

采用受孕12.5 d、13.5 d、14.5 d的ICR品系小鼠的胚胎制备原代成纤维细胞,在相同条件下观察不同胚龄胚胎成纤维细胞的增殖情况。结果表明受孕13.5 d胚胎为分离小鼠胚胎原代成纤维细胞的最适胚龄。分离出的原代成纤维细胞在37 ℃时,用0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA消化组织的时间为3 min,可在培养3 d后传代。F1代和F2代较F3代成纤维细胞分泌的抑制干细胞分化因子LIF的量要多。小鼠胚胎成纤维细胞冻存于-135 ℃~-150 ℃10 个月,复苏后能正常传代。丝裂霉素C抑制胚胎成纤维细胞增殖的最适浓度为10μg/105细胞,作用时间为2.5 h,丝裂霉素C处理过的胚胎成纤维细胞可以在12 d内即不增殖也不死亡,但在6 d内使用效果最佳。     

绵羊胚胎成纤维细胞饲养层用于培养人诱导性多能干细胞的效果研究

试验在体外分离培养1月龄绵羊胚胎成纤维细胞（sheep embryonic fibroblast,SEF）,经丝裂霉素C处理后探讨其作为诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSC）体外培养饲养层的可行性。试验以SNL饲养层细胞为对照,人iPSC（hiPSC）为培养对象,通过形态学观察、碱性磷酸酶（AP）染色、以及实时荧光定量PCR和免疫细胞化学对hiPSC标志基因mRNA和蛋白表达的检测,比较了SEF细胞和SNL细胞作为干细胞饲养层的效果。结果表明,在试验期内,与SNL饲养层体外培养的hiPSC相似,SEF饲养层体外培养的hiPSC在形态上呈集落样生长,增殖速度快;AP染色呈蓝紫色,能够维持未分化状态;能正常表达多能性标志基因。两种饲养层细胞培养的hiPSC多能性标志基因c-Myc、Klf4、OCT4和SOX2 mRNA的表达以及OCT4、SOX2、SSEA4和TRA-1-60蛋白的表达并无显著差异（P>0.05）。本研究结果初步表明SEF可作为体外培养iPSC的饲养层细胞,为进一步建立可表达促生长因子的基因修饰SEF细胞系奠定了基础。     

小鼠胚胎干细胞裂解液诱导鸡胚成纤维细胞发生重编程的研究

本研究采用小鼠胚胎干细胞(ESCs)裂解液与鸡胚成纤维细胞共孵育,通过形态学观察和多能性检测,旨在探讨小鼠ESCs裂解液逆转化鸡胚成纤维细胞为多能干细胞的可行性。结果表明:与小鼠ESCs裂解液共孵育的鸡胚成纤维细胞均变为圆形细胞,形成了42.33个细胞集落;经AKP染色以及Oct-4和SSEA-1免疫细胞化学染色,均呈阳性反应,表现出一定的多能干细胞特性;经核型分析表明这些细胞来源于鸡胚成纤维细胞。单独的重编程操作过程和与鸡胚成纤维细胞裂解液共孵育均无法将鸡胚成纤维细胞重编程为具有ESCs特征的细胞,说明参与重编程鸡胚成纤维细胞的物质来源于小鼠ESCs裂解液。因此,ESCs裂解液诱导体细胞重编程逆转化为多能干细胞的作用能够在小鼠和鸡之间发生。     

小鼠胎儿成纤维细胞饲养层的制备

在进行胚胎干细胞、精原干细胞等特殊细胞的研究时,往往需要将这些细胞接种到成纤维细胞的饲养层上,但需要量不大。因此不便于大规模的制备。本实验通过将组织块培养法和酶消化培养法结合起来制备小鼠胎儿成纤维细胞饲养层,在一定程度上解决了这一问题。利用该方法制备成纤维细胞饲养层,既简化了实验操作,又节省了实验费用。将精原干细胞接种到该饲养层后,其可在体外进行生长和增殖。     

昆明小鼠胚胎成纤维细胞体外培养条件初步研究

本研究旨在探索影响小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)分离培养的因素,建立有效的胚胎成纤维细胞培养体系,为构建饲养层细胞与体细胞核移植技术的细胞核供体建立平台。本研究用组织细胞培养液DMEM作为基础培养液,观察了不同胎龄、不同血清浓度及不同胰蛋白酶作用时间等因素对MEF分离培养的影响。结果显示,在所进行的4个胎龄8.5、10.5、12.5、14.5 d的比较试验中,原代成纤维细胞分离培养的最适胎龄为12.5 d,细胞贴壁迅速,12 h已完全贴壁,增殖速度快;在所进行的不同时间5、10、15、30 min的胰蛋白酶消化中,最佳时间为5~10 min;在所进行的5个血清浓度7%、9%、10%、11%、13%的比较试验中,添加11%胎牛血清浓度培养效果最佳,从3~5代增殖倍数稳定在1.35左右,传代时间也相对较长。以上结果表明,采用12.5 d胎鼠,胰蛋白酶消化5~10 min,在含有11%血清的DMEM培养液中培养MEF细胞时,原代和传代效果最好,传代至第3~5代时细胞生长增殖最旺盛,处于对数分裂期,适宜作为饲养层细胞与体细胞核移植细胞核供体。     

不同饲养层对牛胚胎干细胞培养的影响

本研究建立牛胚胎干细胞(Bovine Embryonic Stem Cells ESCs)的分离培养体系,摸索牛ESCs的培养条件。对牛运用FSH减量注射法进行超数排卵获取胚胎。从获得的胚胎中分离ESCs,在不同的饲养层(牛骨髓间充质干细胞、牛成纤维细胞、牛乳腺干细胞)上培养,对牛ESCs进行形态学观察及鉴定。牛MSCs做饲养层与牛SFCs、牛MaSCs相比差异显著,牛MSCs的效果最佳(P0.05)。牛ESCs在牛MSCs做饲养层的条件下更易生长。分析了不同饲养层对牛ESCs分离培养的影响,建立了一种分离培养牛ESCs的饲养层体系,为进一步深入研究ESCs的诱导分化和应用打下基础。     

昆明小鼠胚胎干细胞培养体系的优化

为了更高效地分离昆明小鼠胚胎干细胞,本研究从饲养层、胚胎发育阶段和培养液方面进行优化。将3代以内的小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)用丝裂霉素C处理后,分别按1×104、1×105、1×106·mL-1密度接种,以H-DMEM+15%KSR+LIF为培养液,观察不同密度饲养层对昆明小鼠胚胎干细胞(ES细胞)生长的影响,并研究胚胎发育阶段和培养液中分别添加干细胞生长因子(SCF)、SCF+胰岛素对昆明小鼠ES细胞分离克隆的影响。结果显示,胚胎在密度为1×105·mL-1的饲养层上,F1代和F2代ES细胞克隆形成率均显著高于其他2组(P<0.05)。囊胚的F2代ES细胞克隆形成率显著高于桑椹胚(P<0.05),培养液中添加SCF显著提高昆明小鼠胚胎贴壁率(P<0.05),同时添加SCF和胰岛素得到昆明小鼠最高胚胎贴壁率及F1、F2代ES细胞克隆形成率。所分离的ES细胞显示AKP染色强阳性,Oct-4、SSEA-1的免疫荧光检测阳性,具有ES细胞的特点。由此认为,发育至囊胚的胚胎在MEF密度为1×105·mL-1上,培养液中同时添加SCF和胰岛素更适合昆明小鼠ES细胞的分离培养。     

绒山羊原始生殖细胞用于胚胎干细胞培养的研究

该研究将20-45d的绒山羊胚胎生殖嵴及其邻近组织用机械剪和胰蛋白酶 EDTA消化处理，未加任何细胞生长因子。仅添加DMEM 10％犊牛血清，在38℃、5％CO2，饱和湿度条件下，将原始生殖细胞(PGCs)与其胎儿成纤维细胞共培养，在原代培养至1周左右时观察到了鸟巢状类胚胎干细胞(ES细胞)和集落团，贴壁生长于成纤维细胞层上面。经电镜观察，类胚胎干细胞体积小、核大，有多个核仁。细胞形态不规则，无明显界限等特点。     

饲养层和生长因子对山羊类胚胎干细胞的影响

实验以6~8 d的山羊囊胚为实验材料,采用机械法分离山羊囊胚ICM,分别以小鼠和山羊胚胎成纤维细胞作饲养层,并采用含不同生长因子的培养液进行培养,比较了饲养层和生长因子对分离培养山羊类ES细胞的影响。结果表明:采用MEF饲养层其ICM增殖率优于GEF饲养层;与对照组相比,培养液中添加LIF及SCF或胰岛素对山羊ICM的贴壁增殖及传代都有积极影响;以MEF为饲养层,培养液中同时添加LIF和SCF时,培养山羊类ES细胞的效果最佳,传至3代。