白消安消减鹅胚内源性原始生殖细胞

降低胚胎内源性原始生殖细胞是提高禽类生殖嵌合体效率的最有效途径,本试验首次研究白消安对鹅胚内源性原始生殖细胞的消减作用。将白消安乳化剂直接注射到鹅种蛋的卵黄内,待鹅胚发育到第8 d时分离生殖腺中的PGCs,并统计PGCs数目。结果显示,糖原染色与免疫荧光染色充分证明从鹅胚生殖腺中成功分离到PGCs;较低浓度(每1颗卵注射150μg)的白消安能显著降低鹅胚内源性原始生殖细胞,从对照的单胚约1 200个PGCs降低到处理组的80个左右。鹅相对于鸡而言对白消安更敏感,较低浓度即可显著降低鹅内源性PGCs。     

白消安注射法建立昆明小鼠精原干细胞移植受体模型

【目的】通过对6周龄昆明小鼠腹腔内单次注射不同剂量的白消安来制作精原干细胞移植受体模型。【方法】将104只昆明小鼠随机分成4组,分别注射0(对照组,注射等量的白消安溶解液二甲基亚砜(DMSO)),10,20和30mg/kg白消安,于注射白消安后5,7,9,11和13周记录小鼠的死亡数、小鼠睾丸外观体积、小鼠睾丸质量和小鼠体质量,计算睾丸指数;通过组织学观察注射不同剂量白消安后小鼠曲细精管精子的恢复情况,并检测受体小鼠血液中红细胞和白细胞数量的变化。【结果】注射0(对照组),10,20和30mg/kg白消安13周后,小鼠死亡率分别为0(0/22),11.54%(3/26),17.86%(5/28)和89.29%(25/28)。10mg/kg白消安组小鼠的睾丸指数在注射后5,7和9周显著小于对照组(P0.05),而在注射后11和13周,与对照组差异不显著(P0.05);在注射后不同时间,对照组和10mg/kg白消安组的睾丸指数均显著高于20mg/kg白消安组(P0.05)。在注射白消安5,7,9,11和13周后,对照组曲细精管上皮无变化;10和20mg/kg白消安组有完整精子发生的曲细精管占总曲细精管的百分比分别为(49.56±8.23)%,(66.61±6.13)%,(80.24±10.42)%,(93.87±3.23)%,(92.49±4.58)%;(8.73±9.22)%,(9.89±6.39)%,(29.21±12.31)%,(49.64±3.59)%和(81.99±4.98)%。受体小鼠红细胞和白细胞数量均随着处理时间及白消安处理剂量的变化而变化。【结论】腹腔内注射20mg/kg白消安小鼠的死亡率、睾丸指数均较低,中空的曲细精管数量多,且恢复较慢,适于做精原干细胞移植的受体,合适的移植时间是白消安处理后5~7周。     

白消安处理消融猪内源精原干细胞的效果及外源精原干细胞移植

目的 研究猪睾丸组织注射白消安消融猪内源精原干细胞(Spermatogonial stem cell,SSC)的效果,以及猪SSC同种异体移植后对内源性SSC消融受体生殖能力恢复的影响。方法 采用3 mg/kg剂量的白消安对9头6周龄大白公猪进行睾丸注射,另外3头注射2 mL 二甲基亚砜作为对照。3周后,对试验组公猪以相同剂量进行第2次睾丸注射。第2次注射3周后,采集试验组和对照组公猪睾丸进行相关检测,评估内源性SSC消融情况。第2次白消安注射1个月后,以两步酶消化法处理5~7日龄大白仔猪睾丸分离得到睾丸单细胞悬液,并用明胶差速贴壁法进行纯化,纯化后以免疫荧光和流式细胞术分析SSC的纯度。异体移植SSC 4个月后,用微卫星标记检测受体公猪精液以及睾丸组织中供体来源SSC的存在。结果 以3 mg/kg剂量的白消安处理大白公猪2次后,睾丸组织苏木精−伊红染色以及免疫组织化学染色结果显示,试验组睾丸曲细精管中各级生精细胞消融但其支持细胞结构完好,可以支持外源性SSC的定植及发育。免疫荧光以及流式细胞术结果表明,分离得到的睾丸单细胞悬液经纯化后UCHL-1阳性细胞占比由差速贴壁前的16.3%提高到了50.8%。苏木精−伊红染色以及免疫组织化学染色结果显示,猪SSC移植4个月后,移植组睾丸组织生精细胞恢复,在受体睾丸曲细精管基底膜上可检测到UCHL-1阳性SSC。受体睾丸组织的微卫星标记分析显示了供体SSC的存在,表明移植进入受体睾丸中的供体SSC可以在受体睾丸中定植存活超过4个月;精液微卫星标记未检测到供体来源的精子。结论 以3 mg/kg剂量的白消安注射公猪睾丸能有效消融内源性SSC,可以用来制备SSC移植的受体猪。两步酶消化及明胶差速贴壁法可成功分离纯化猪SSC。猪SSC经同种异体移植后可以在受体睾丸中定植存活超过4个月。     

鱼类精原干细胞的研究进展

鱼类精原干细胞是鱼类精子发生的起始细胞,是一群具有自我更新和分化潜能的细胞.其独具的生物学特性,使其在干细胞生物学、遗传资源保存和转基因动物等研究领域具有重要价值.就鱼类精原干细胞的生物学特性、培养鉴定、分化潜能、移植和冷冻保存方面做一简要综述,以期为精原干细胞的研究提供借鉴.     

电刺激器法在西藏色瓦绵羊人工采精中的应用试验

西藏色瓦绵羊是藏北特有草地型绵羊,由于自然交配情况下种公羊利用率低,需要利用人工授精方式来提高种公羊利用率以加快遗传改良进程,本研究旨在西藏色瓦绵羊上运用电刺激采精法寻求最佳采精刺激电压并结合按摩法以获得较好的色瓦绵羊种公羊人工采精效果。试验采用电刺激方法采集西藏色瓦绵羊种公羊精液,对采精时不同电压、按摩结合电刺激采精以及两次连续采精条件下所获得的精液进行品质检测。结果表明：电压在1～3 V和9～15 V时西藏色瓦绵羊种公羊无法采集到精液,在电压为5 V和7 V时公羊阴茎勃起并射精但其射精量、精子密度、精子活力无显著性差异（P>0.05）;并且发现单纯使用电刺激和结合按摩所采集出的精液在精液量、精子密度、活力无显著性差异（P>0.05）,但是射精时间有显著差异（P<0.05）;在间隔30 min进行两次连续采精时第1次采精的采精量、精子密度均显著优于第2次的（P<0.05）,活力无显著性差异（P>0.05）。说明西藏色瓦绵羊公羊电刺激采精时适宜电压为5～7 V,电刺激结合按摩可以有效缩短射精时间,但不宜短时间内连续采精,因此电刺激法可以在西藏色瓦绵羊人工授...     

雄性多能性生殖干细胞及其应用于制作转基因动物的潜能

精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是雄性动物体内唯一可以将遗传信息遗传给后代的成体干细胞,具有自我更新和分化为精子的能力.对于小鼠而言,随着精原干细胞体外培养体系的逐渐建立和完善,人们不仅对精原干细胞自身的增殖和分化调节机制有了较深入的了解,同时也发现了精原干细胞在再生医学和转基因动物领域具有其独有的优越性,目前的研究结果已经可以通过安全的途径将小鼠精原干细胞诱导转变为和胚胎干细胞功能相似的多能性干细胞,同时也实现了通过异体移植精原干细胞的方式来制作转基因小鼠和大鼠.这些研究结果让人们看到了精原干细胞对人类再生医学和制作大型转基因动物具有巨大的应用潜力.本文将对通过诱导精原干细胞获得的多能性干细胞的研究现状及其用于制作大型转基因动物所面临的问题和可能的解决途径加以概述和总结.     

家畜精原干细胞移植研究进展

论述了精原干细胞的生物学特征、分离纯化与冷冻保存,探讨了家畜精原干细胞移植的国内外研究成果,展望了其在畜牧上的应用前景。     

精原干细胞体外培养体系的建立

精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是雄性哺乳动物精子发生及具有生育能力的保障。精原干细胞的体外培养不仅为精子发生的研究提供材料,还有助于开发新的家畜保种方法和动物遗传修饰。为了探索猪精原干细胞体外培养体系的建立方法,本研究采用胶原酶Ⅳ-胰酶两步酶法对3~7日龄大白仔猪睾丸进行消化得到单细胞悬液,利用不同时间程序的差速贴壁对精原干细胞进行纯化,选择大白仔猪睾丸支持细胞作为饲养层,添加不同细胞因子研究精原干细胞的增殖情况以期得到最佳的培养体系。结果显示,通过差速贴壁得到的UCHL-1阳性生殖细胞比例最高为18.59%±0.94%;不同细胞因子组合添加试验发现精原干细胞添加20 ng·mL^-1 GDNF、10 ng·mL^-1 IGF和20 ng·mL^-1 bFGF的增殖效果最佳;以支持细胞作为饲养层、在DMEM/F12中添加1%FBS以及上述细胞因子组合对精原干细胞进行培养15 d后可见大量的精原干细胞集落,通过免疫荧光、AKP染色、荧光定量PCR等试验证明精原干细胞进行了大量增殖。本研究初步建立了猪精原干细胞的体外培养体系,可通过体外培养大量增殖精原干细胞,为后续精原干细胞的研究奠定基础。     

精原干细胞体外分离培养的研究进展

为探索提高精原干细胞分离和体外培养效率的技术方法,以建立长期稳定的动物精原干细胞培养体系,对动物精原干细胞的分离纯化和体外培养的研究进展进行综述。以"Spermatogonial stem cell,Isolation,Culture,Enrichment,in vitro"和"精原干细胞、分离、培养和体外扩增"为检索词,查阅精原干细胞相关文献,并进行归纳整理。精原干细胞分离主要有机械分离法和酶消化法,纯化精原干细胞的方法有差速贴壁法、密度梯度离心法、免疫磁珠法、流式细胞法等,目前大动物精原干细胞的富集常使用酶消化法、差速贴壁法和Percoll梯度离心法相结合。精原干细胞体外培养需模拟体内生境,通常在基础培养基中添加血清、饲养层细胞和各类生长因子等,培养条件会影响精原干细胞培养的效果。小鼠精原干细胞已建立较完善的培养体系,而人和多数大动物还缺乏完善的精原干细胞体外培养体系。     

绵羊精液冷冻技术的研究与应用

<正> 为提高优良种公羊的利用率,减少疾病传播,降低饲养成本,提高羊毛的质量和产量,我们从1987年开展了绵羊精液冷冻技术研究以及输精试验。现将结果总结如下: 材料与方法 (一)种公羊的选择试验选用2岁健康的中国美利奴公羊,采用常规方法采精,每周采精两次。     

一种有效分离及在体外扩增成年小鼠精原干细胞的方法

尝试建立一种简便有效的成年小鼠精原干细胞分离培养及扩增的方法。从单只成年小鼠的睾丸中经过两步酶消化法分离精原干细胞,并在去除间质细胞、纯化后的支持细胞饲养层上培养与扩增,获得稳定增殖的精原干细胞系。此方法可显著提高建系成功率,保证细胞系的单一基因型,显著降低体外培养精原干细胞的成本。为成体基因来源的转基因动物的制作和疾病模型的建立提供技术支持。     

牛精原干细胞研究进展

精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是雄性生殖系干细胞,位于睾丸曲细精管基膜上,既具有自我更新潜能,又具有定向分化潜能,是自然状态下出生后动物体内在整个生命过程中进行自我更新并能将基因传递至子代的惟一成体干细胞。根据国内外最新相关进展,系统评述了牛SSCs的生物学特性、分离纯化、冷冻保存、体外培养、永生细胞系的建立及移植等方面的现状及问题。     

小鼠睾丸支持细胞的分离培养与生物学研究

[目的]分离得到高纯度的小鼠睾丸支持细胞(Sertoli cell),用以研究它对精原干细胞(SSCs)生长的影响。[方法]取鼠龄3~7 d的雄性ICR小鼠睾丸,采用胶原酶、透明质酸酶、胰蛋白酶和DNA酶消化分离Sertoli细胞及SSCs,经多次差异离心贴壁及低渗处理法进行纯化,用Sertoli细胞作饲养层观察SSCs的生长情况。[结果]Sertoli细胞纯度达90%,且以Sertoli细胞作饲养层培养SSCs,与对照相比,能明显促进SSCs的增殖。[结论]四酶消化低渗处理法可获得高纯度的Sertoli细胞,且Sertoli细胞能明显促进SSCs的增殖。     

温度及BRL饲细胞对体外小鼠精原干细胞的影响

 将6 日龄小鼠生精上皮单细胞分别接种于BRL和STO饲养层上,于32 ℃或37 ℃培养,研究其对精原干细胞的影响。结果:在培养的第1周内,2个及4个相连的精原细胞合胞体明显增多。培养１周后,多数精原细胞经短暂的存活及分裂活动后退化消失,培养体系中仅保留下少量单个及由细胞间桥相连的双个及4个成串或成团的A型精原细胞。这些细胞在随后的培养过程中,不表现明显的分裂活动,呈碱性磷酸酶阳性反应。根据精原干细胞生物学特性,它们极有可能就是精原干细胞及其子代细胞。不同条件培养体系中的精原干细胞的生物学行为无明显不同,培养60 d时均仅有少量精原干细胞存活。结论: BRL细胞能用作饲养层促进精原干细胞存活,但对其更新性增殖没有明显作用;32～37 ℃对精原干细胞的生物学行为无明显影响,均可用于培养精原干细胞。     

Isolation, Purification and Cryopreservation of Cells from Neonatal Bovine Testis

The development and application of spermatogonial stem cell technology have an important significance in animal cloning, preservation of endangered species and spermatogenesis research. In this study, the seminiferous epithlium cells were isolated and purified, the cells were cryopreserved after identification, and the effects of different purification and cyopreservation methods on bovine testicular cells were studied. The results showed that there were spermatogonial stem cells and sertoli cells in the neonatal bovine seminiferous tubules, differential adherent selection methods could effectively separate these two cell types. Spermatogonial stem cells were positive after AKP, C-kit, and OCT-4 identification; sertoli cells were positive after oil red O and vimentin identification. Frozen stock solution supplemented with 10% DMSO had the best effect in spermatogonial stem cell cryopreservation, while frozen stock solution supplemented with 10% of ethylene glycol and 0.1 mmol·L-1 trehalose had the best effect in sertoli cells cryopreservation.     

小鼠精原干细胞分离培养条件的优化

采用两步酶消化法获得5～7日龄昆明小鼠睾丸组织的单细胞悬液,比较差速贴壁法和Percoll不连续密度梯度法对精原干细胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)的纯化效果,并利用MTT法检测不同生长因子及添加浓度对SSCs体外增殖的影响.结果表明5日龄小鼠和7日龄小鼠的睾丸细胞总数存在较大差异(P<0.05),但SSCs数目无显著差异(P>0.05);与Percoll不连续密度梯度法相比,差速贴壁法获得了较高的SSCs数量和纯化率,其纯化率平均85.06%;MTT法检测结果表明LIF因子的添加对SSCs的增殖具有促进作用,20 ng/mL GDNF+20 ng/mLbFGF+103 U/mL LIF的组合添加是昆明小鼠SSCs的体外培养增殖的最佳组合.     

Production of Transgenic Animals Using Spermatogonial Stem Cells

Spermatogonial stem cells (SSCs) are a type of adult stem cell found in male mammals. These cells have the capacity for self renewal and are capable of differentiating in the niche of testis. They are also the only adult stem cells in a normal postnatal body that undergo self-renewal throughout life, transferring genetic information to the offspring. Since a technique for transplanting SSCs was first described by Brinster and his colleagues in 1994, more and more researchers have become interested in exploring the possibility of utilizing adult SSCs to generate transgenic animals. In this minireview, we attempt to summarize the current research progress in the area of spermatogonial stem cells including the source, types and differentiation of the SSCs, and the application on transgenic animals, with a particular focus on the strategy of SSCs delivery including seminiferous tubule injection and spermatogonial stem cell transplantation.