谷氨酰胺对BCG诱导小鼠传代巨噬细胞凋亡的调控作用

旨在探讨谷氨酰胺在牛分枝杆菌卡介苗(Bacille Calmette-Guerin vaccine, BCG)感染巨噬细胞过程中对凋亡的调控作用。本文采用小鼠单核巨噬细胞RAW264.7,首先建立了BCG感染致细胞凋亡的细胞模型，采用Western blotting检测凋亡关键因子的表达变化，确定最佳感染条件；进而利用无谷氨酰胺培养基构建谷氨酰胺剥夺模型并结合BCG感染，采用ELISA、免疫印迹、免疫荧光和流式细胞术等技术检测了细胞内谷氨酰胺关键代谢指标的差异变化。通过上述研究，阐明谷氨酰胺对BCG诱导的巨噬细胞凋亡的调控作用，并初步探讨其机制。结果表明，BCG感染显著上调了小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞中Caspase 3和PARP的蛋白表达(P<0.001),最佳感染时间为12 h,最佳感染复数为10 MOI,同时BCG感染促进了RAW264.7细胞内谷氨酰胺的分解代谢。剥夺谷氨酰胺后能极显著降低BCG感染后巨噬细胞中谷氨酸(P<0.001)和谷胱甘肽(P<0.01)的含量，极显著增加了细胞内ROS的含量(P<0.001)。同时，抑制谷氨酰胺代谢促进了RA...     

BCG诱导RAW264.7细胞脂肪酸氧化对细胞自噬和促炎因子表达的调控作用

旨在探究脂肪酸氧化（fatty acid oxidation,FAO）对BCG介导的RAW264.7细胞自噬和促炎因子表达的调控作用。用BODIPY染色和游离脂肪酸定量试剂盒检测BCG感染后RAW264.7细胞中脂滴聚集情况以及脂肪酸含量;Western blot检测BCG感染对肉毒碱棕榈酰基转移酶1A （CPT-1A）表达的影响;Etomoxir （100 μmol·L^-1）预处理细胞2 h后,BCG感染细胞6 h,检测RAW264.7细胞中BCG存留量,并用Western blot方法检测自噬相关蛋白（Beclin1、LC3-II）和溶酶体蛋白（Rab7）的表达情况;用免疫荧光方法和mRFP-GFP-LC3荧光双标腺病毒分别检测自噬小体聚集和自噬流;荧光定量PCR和ELISA分别检测促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表达情况以及在细胞培养上清中的含量。结果显示,BCG感染促进RAW264.7细胞中脂滴聚集和CPT-1A的表达,而游离脂肪酸含量降低;Etomoxir预处理抑制了细胞中BCG存活,并上调了Beclin1、LC3-II和Rab7表达,且细胞中出现大量自噬小体聚集,自噬流增强,却抑制了促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表达与分泌。综上表明,抑制FAO可促进BCG感染诱导的RAW264.7细胞自噬,并抑制BCG感染引起的炎症反应。     

脂肪酸结合蛋白4对BCG诱导巨噬细胞自噬的调控作用

旨在探讨脂肪酸结合蛋白4（fatty acid binding protein,FABP4）在牛分枝杆菌卡介苗（BCG）感染的巨噬细胞中对脂肪酸代谢与自噬的调控作用。本研究利用小干扰RNA技术敲减小鼠巨噬细胞系RAW264.7中FABP4的表达,并结合BCG感染,采用免疫印记和免疫荧光等技术,检测了FABP4蛋白表达、脂肪酸累积、脂肪酸β氧化和自噬相关蛋白表达等指标。结果表明,BCG感染极显著上调了小鼠巨噬细胞RAW264.7中FABP4的表达（P<0.001）并促进了脂肪酸的累积。FABP4小干扰RNA（siRNA-FABP4）能显著降低BCG感染后巨噬细胞中脂肪酸含量,伴随着肉毒碱棕榈酰移位酶1A（CPT1A）的表达上调（P<0.05）,与ATP产量的提升（P<0.05）。同时,siRNA-FABP4极显著下调了自噬调控关键因子AMPK及自噬相关蛋白p-ULK1、ATG5、ATG7、ATG12和LC3B的表达（P<0.01）。以上研究结果表明,在BCG感染RAW264.7细胞过程中,下调了FABP4的表达,促进了脂肪酸的氧化,减少了巨噬细胞内脂肪酸的含量,并通过AMPK信号通路抑制了细胞自噬的发生。     

脂肪分化相关蛋白2对BCG诱导小鼠传代巨噬细胞自噬的调控作用

本研究旨在探讨脂肪分化相关蛋白2(perilipin 2,PLIN2)在卡介苗(bacillus calmette-guérin, BCG)感染的小鼠巨噬细胞RAW264.7中对自噬的调控作用。利用小干扰RNA敲减小鼠巨噬细胞RAW264.7中PLIN2的表达，结合BCG感染，通过免疫印迹、流式细胞术和免疫荧光等技术，检测胞内PLIN2、自噬、内质网应激及脂肪酸代谢相关因子指标的表达变化。结果显示：BCG感染显著上调巨噬细胞RAW264.7中PLIN2的表达(P<0.05),极显著上调自噬相关蛋白ATG5(P<0.01)、ATG12(P<0.001)及LC3(P<0.001)的表达，并伴随着细胞内中性脂质的蓄积。敲减PLIN2能使BCG感染的巨噬细胞RAW264.7中自噬相关蛋白ATG5(P<0.05)和ATG12(P<0.05)显著下调以及LC3(P<0.001)极显著下调，细胞自噬率极显著降低(P<0.001),并极显著降低细胞内中性脂质的含量(P<0.001)。同时，敲减PLIN2显著下调CHOP(P<0.05),并极显...     

受体相互作用蛋白1(RIP1)对BCG诱导小鼠巨噬细胞凋亡的调控作用

旨在通过构建受体相互作用蛋白1(RIP1)腺病毒干扰载体,研究其对BCG诱导的RAW264.7细胞凋亡相关指标的影响,以探讨其在BCG诱导RAW264.7凋亡过程中的调控作用。笔者构建RIP1腺病毒干扰载体,并转染感染BCG的小鼠RAW264.7细胞系,利用流式细胞仪检测各处理细胞凋亡率、细胞线粒体膜电位、细胞活性氧水平及细胞周期等指标,并用Western blot检测凋亡相关蛋白的表达水平。结果显示:BCG感染显著上调了RIP1的蛋白表达水平并提高了小鼠巨噬细胞RAW264.7的凋亡率,当RIP1被干扰后,BCG感染后的RAW264.7细胞凋亡率和活性氧水平显著降低,而促凋亡蛋白Bax表达量显著下调,线粒体膜电位和抑凋亡蛋白表达量上调。同时,BCG感染后细胞周期滞留于G_1期。BCG感染可有效上调RIP1表达量并诱导RAW264.7细胞凋亡。RIP1通过下调BCG感染后RAW264.7细胞的线粒体膜电位,上调活性氧含量并提高凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2比值,使细胞周期阻滞于G_1期从而参与诱导细胞凋亡。     

VDAC1参与调控BCG感染RAW264.7细胞凋亡

旨在研究电压依赖性阴离子通道(voltage dependent anion channel1,VDAC1)对卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin, BCG)诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7凋亡的调控作用及其机制。设计并合成VDAC1的小干扰RNA(si-VDAC1)转染小鼠巨噬细胞RAW264.7后,再用BCG感染。后续采用MTT法检测RAW264.7细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率、线粒体膜电位及细胞内ROS水平,进而通过实时荧光定量PCR和Western blot检测凋亡相关因子Cyt C、Caspase-3、PARP1、Caspase-9基因(mRNA)及其蛋白的表达。随后,通过使用VDAC1寡聚抑制剂VBIT-4对RAW264.7进行孵育2 h后感染BCG,并采用免疫荧光染色技术观察Caspase-3和Western blot检测凋亡相关因子Cyt C、Cleaved-Caspase 3、Cleaved-PARP1、Cleaved-Caspase 9的含量变化。BCG感染巨噬细胞12 h后,与对照相比,BCG感染后小鼠巨噬细胞存活率约下降至50%,而...     

金黄色葡萄球菌对巨噬细胞自噬相关蛋白表达的影响

巨噬细胞是机体重要的免疫防御细胞,本试验探讨金黄色葡萄球菌感染对巨噬细胞自噬相关蛋白表达的影响,为进一步研究自噬在金黄色葡萄球菌侵袭过程中的作用提供理论依据。采用金黄色葡萄球菌侵袭RAW264.7细胞,运用Western blot分别于侵袭0,15,30,45,60,90,120 min检测细胞内自噬相关蛋白Beclin1、Atg5、LC3、p62的表达水平,激光共聚焦技术检测细胞内LC3聚点,并用透射电镜观察细胞超微结构。结果显示,与侵袭0 min相比,Beclin1、Atg5、LC3、p62表达水平在各时间点均升高(P0.01),且呈一定的时间-效应关系。侵袭45 min时,细胞内LC3蛋白聚点增多,且单个细胞的荧光强度增强。透射电镜观察显示金黄色葡萄球菌侵入细胞内,并形成明显的吞噬泡。故金黄色葡萄球菌侵袭巨噬细胞,促进了细胞自噬的发生和发展,自噬参与了金黄色葡萄球菌的侵袭过程。     

结核分枝杆菌Rv2626c蛋白对RAW264.7细胞凋亡的影响

试验旨在研究结核分枝杆菌Rv2626c蛋白对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞凋亡的影响。根据GenBank数据库中结核分枝杆菌Rv2626c基因序列设计引物,并以结核分枝杆菌国际标准株H37Rv cDNA为模板,PCR扩增Rv2626c基因并克隆至慢病毒表达载体pLEX-EGFP中,包装慢病毒并感染RAW264.7细胞,使用Western blotting和流式细胞仪技术检测Rv2626c蛋白表达水平和RAW264.7细胞凋亡率变化。结果显示,成功构建慢病毒表达载体pLEX-EGFP-Rv2626c;成功包装慢病毒并感染RAW264.7细胞;Rv2626c蛋白在RAW264.7细胞中高水平表达显著促进了细胞凋亡。本试验结果表明,在RAW264.7细胞中过表达结核分枝杆菌Rv2626c蛋白能显著性增加其凋亡水平。     

结核分枝杆菌Rv2626c蛋白对RAW264.7细胞凋亡的影响

试验旨在研究结核分枝杆菌Rv2626c蛋白对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞凋亡的影响。根据GenBank数据库中结核分枝杆菌Rv2626c基因序列设计引物,并以结核分枝杆菌国际标准株H37Rv cDNA为模板,PCR扩增Rv2626c基因并克隆至慢病毒表达载体pLEX-EGFP中,包装慢病毒并感染RAW264.7细胞,使用Western blotting和流式细胞仪技术检测Rv2626c蛋白表达水平和RAW264.7细胞凋亡率变化。结果显示,成功构建慢病毒表达载体pLEX-EGFP-Rv2626c;成功包装慢病毒并感染RAW264.7细胞;Rv2626c蛋白在RAW264.7细胞中高水平表达显著促进了细胞凋亡。本试验结果表明,在RAW264.7细胞中过表达结核分枝杆菌Rv2626c蛋白能显著性增加其凋亡水平。     

黑枸杞花青素通过Ⅲ-PI3K通路调控小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬

为探讨青海柴达木黑枸杞花青素对小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬的影响,用CCK-8法检测不同浓度不同时间黑枸杞花青素诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7的增殖情况;用Western Blot检测不同浓度黑枸杞花青素浓度诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7后自噬因子LC3-Ⅱ和Beclin-1的蛋白表达情况;用Western B...     

钙结合蛋白S100A4对BCG感染THP-1细胞自噬的调控作用

本研究旨在探究牛结核分枝杆菌减毒株卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)感染人单核巨噬细胞THP-1后,钙结合蛋白S100A4对细胞自噬的调控作用。以感染复数为10∶1的BCG感染THP-1细胞不同时间,用Western blot检测S100A4和LC3Ⅱ的表达,以确定最佳感染时间,并采用透射电镜观察自噬体数量变化。在BCG单独感染或与S100A4小干扰RNA共处理THP-1细胞12 h后,采用qRT-PCR检测S100A4及自噬相关因子——微管相关蛋白轻链3II (microtubule-associated protein light chain 3Ⅱ, LC3Ⅱ)、自噬相关蛋白7(autophagy-related gene 7, Atg7)、Beclin-1在mRNA水平上的表达,采用Western blot检测S100A4、LC3Ⅱ、Atg7、Beclin-1在蛋白水平的表达。利用mRFP-GFP-LC3检测自噬流,激光共聚焦显微镜观察细胞中mRFP-LC3和mRFP-GFP-LC3点状聚集。结果显示：在BCG感染THP-1细胞不同时间后,S100...     

牛坏死杆菌对小鼠巨噬细胞的增殖和自噬影响的初步探究

为探究牛坏死杆菌对小鼠巨噬细胞系(RAW264.7细胞)增殖和自噬的影响，本研究将牛坏死杆菌A25株以MOI 10感染RAW264.7细胞作为实验组，以未感染的RAW264.7细胞作为对照组。分别于感染后1 h、2 h、4 h收集细胞，采用Ed U和MDC染色法观察细胞荧光，并计算各组细胞增殖率及细胞自噬小体的数量。Ed U染色法观察可见，各实验组随着感染时间的延长，绿色荧光的量逐渐减少，对照细胞绿色荧光的量基本无变化，且与对照组相比，随着感染时间的延长，感染组细胞增殖率均极显著降低(P<0.05);MDC染色法观察结果可见，与对照组相比，随着感染时间的延长，感染组细胞中的绿色荧光逐渐增强，且随着感染时间的延长，细胞中自噬小体的数量与对照组相比均极显著增多(P<0.01)。上述结果表明，牛坏死杆菌感染RAW264.7细胞后抑制细胞的增殖，并且诱导该细胞发生自噬。分别采用荧光定量PCR (RT-qPCR)和western blot检测上述各组细胞中自噬基因Beclin-1和P62 mRNA的相对转录水平及自噬蛋白LC3和P62的相对表达水平。RT-q PCR结果显示，与对照组...     

胞内分枝杆菌及偶发分枝杆菌对小鼠巨噬细胞凋亡的影响

为了研究非结核分枝杆菌对巨噬细胞凋亡的影响,采用胞内分枝杆菌和偶发分枝杆菌分别感染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,流式细胞术检测细胞凋亡率,ELISA法检测TNF-α及IL-10的表达,检测这2株菌在小鼠巨噬细胞中的增殖。结果显示:胞内分枝杆菌引起的细胞凋亡水平低于偶发分枝杆菌组(P0.05),这2株菌所引起的TNF-α的表达量在4 h、12 h较高,与空白对照组相比差异显著(P0.05),在24 h、48 h下降明显,而IL-10的表达整个感染过程都比较高。并且还观察到胞内分枝杆菌的吞噬率较高(P0.05);增殖能力较强(P0.01)。表明菌体毒力与凋亡率、细胞因子的表达、增殖率有着直接关系。     

布鲁氏菌BPE159基因缺失株的构建及BPE159蛋白对细胞自噬因子表达的影响

【目的】构建布鲁氏菌BPE159基因缺失株,研究缺失株体外生长变化特征及其在宿主细胞中的存活能力,探究布鲁氏菌感染期间分泌蛋白BPE159对自噬因子表达的影响。【方法】同源重组方法构建布鲁氏菌BPE159基因重组质粒,电转化布鲁氏菌S2308感受态细胞构建BPE159基因缺失株S2308ΔBPE159。PCR扩增BPE159基因,连接转化构建pBBR1MCS-4-BPE159载体,提取质粒进行电转化,构建BPE159基因回补株S2308ΔBPE159-C。琼脂糖凝胶电泳检测缺失株和回补株遗传稳定性。构建布鲁氏菌感染小鼠巨噬细胞RAW264.7模型,实时荧光定量PCR检测布鲁氏菌侵染后自噬细胞因子ATG5、Beclin1、LC3a和LC3b基因表达水平。以S2308、S2308ΔBPE159和S2308ΔBPE159-C株侵染小鼠巨噬细胞,收集细胞总RNA,实时荧光定量PCR检测BPE159基因缺失对布鲁氏菌侵染后自噬细胞因子表达水平的影响。在相同起始浓度下培养S2308、S2308ΔBPE159及S2308ΔBPE159-C株,观察细菌生长变化趋势;评价S2308ΔBPE159株在不同...     

牛磺鹅去氧胆酸对小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞凋亡的影响

为了探讨牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA）对小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7的抗凋亡作用,试验采用二苯胺法及实时荧光定量PCR技术分别检测了针对RAW264.7细胞凋亡百分率及凋亡抑制蛋白CIAP-1、CIAP-2和XIAP的mRNA表达影响。结果显示,剂量为0.05、0.10和10 μg/mL TCDCA可以极显著地对抗地塞米松（DEX）诱导的RAW264.7细胞系凋亡（P < 0.01）。1 μg/mL TCDCA对正常RAW264.7细胞系CIAP-1和XIAP表达有显著的促进作用（P < 0.05）;10 μg/mL TCDCA对正常RAW264.7细胞系CIAP-1、CIAP-2和 XIAP表达均具有显著的促进作用（P < 0.05）。TCDCA给药后对DEX诱导的RAW264.7细胞系CIAP-1、CIAP-2和 XIAP表达均具有极显著的促进作用（P < 0.01）,但不同给药剂量的TCDCA作用有所差异。以上研究结果表明,TCDCA具有对抗DEX诱导的小鼠巨噬细胞系RAW264.7凋亡作用,且与上调凋亡抑制蛋白mRNA表达有关。     

牛磺鹅去氧胆酸对小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞凋亡的影响

为了探讨牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)对小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7的抗凋亡作用,试验采用二苯胺法及实时荧光定量PCR技术分别检测了针对RAW264.7细胞凋亡百分率及凋亡抑制蛋白CIAP-1、CIAP-2和XIAP的mRNA表达影响。结果显示,剂量为0.05、0.10和10μg/mL TCDCA可以极显著地对抗地塞米松(DEX)诱导的RAW264.7细胞系凋亡(P0.01)。1μg/mL TCDCA对正常RAW264.7细胞系CIAP-1和XIAP表达有显著的促进作用(P0.05);10μg/mL TCDCA对正常RAW264.7细胞系CIAP-1、CIAP-2和XIAP表达均具有显著的促进作用(P0.05)。TCDCA给药后对DEX诱导的RAW264.7细胞系CIAP-1、CIAP-2和XIAP表达均具有极显著的促进作用(P0.01),但不同给药剂量的TCDCA作用有所差异。以上研究结果表明,TCDCA具有对抗DEX诱导的小鼠巨噬细胞系RAW264.7凋亡作用,且与上调凋亡抑制蛋白mRNA表达有关。     

猪Beclin1基因调控伪狂犬病病毒诱导细胞自噬和凋亡的机制分析

旨在研究伪狂犬病病毒(PRV)感染后细胞自噬和凋亡情况,进一步分析鉴定PRV感染条件下与Beclin1互作的猪宿主凋亡家族蛋白。利用免疫印迹(WB)方法检测PRV感染细胞的自噬水平;利用流式细胞术探讨凋亡水平;最后利用免疫共沉淀试验分析PRV感染PK-15细胞中Beclin1与Bcl-2和Bcl-xL的结合水平。结果显示,PRV感染导致LC3-Ⅱ的表达明显增多,而P62显著下降,且AKT(S473)磷酸化水平显著减少;其次,PRV感染诱导细胞凋亡且显著上调剪切型Caspase-9/8的表达水平;最后,免疫共沉淀结果显示PRV感染条件下Beclin1能与Bcl-2和Bcl-xL结合,但结合的水平明显降低。PRV感染诱导的细胞自噬可能依赖于PI3K-Ⅰ/AKT信号通路,PRV感染可能同时激活了线粒体凋亡途经和死亡受体途经从而诱导细胞凋亡,而PRV感染诱导的细胞自噬和细胞凋亡可能通过抑制Beclin1和Bcl-2、Bcl-xL结合而相互关联。     

不同毒力马耳他种布鲁氏菌体内外诱导细胞凋亡的研究

为探究不同毒力马耳他种布鲁氏菌能否在体内外诱导凋亡以及诱导凋亡程度的差异,本研究将M28(强毒株)和M5-90(疫苗株)以MOI=100感染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,利用激光共聚焦显微镜观察和流式细胞术检测凋亡产物caspase3/7。结果显示:M5-90和M28在体外细胞水平均能够诱导RAW264.7细胞凋亡,且M5-90促进细胞凋亡能力高于M28。然后将M28和M5-90以1×10~6 cfu的剂量接种BALB/c小鼠,分别在接种后3 d、7 d和42 d迫杀小鼠,取小鼠脾脏组织制备切片,经HE染色后进行形态学观察,利用透射电镜观察并通过Tunel法检测细胞凋亡。结果显示M5-90和M28感染后均可诱导小鼠脾脏细胞凋亡,凋亡细胞主要为T淋巴细胞。本研究为布鲁氏菌诱导宿主细胞凋亡和布鲁氏菌致病机理研究奠定了基础。     

不同毒力结核分支杆菌感染RAW264.7巨噬细胞不同时间细胞因子转录水平标准曲线的建立及应用

为检测不同毒力结核分枝杆菌感染巨噬细胞后细胞因子转录水平的变化,构建IL-6、IL-10、TNF-α重组标准质粒,建立了实时荧光定量PCR标准曲线。应用该方法对不同毒力结核分枝杆菌感染RAW264.7巨噬细胞6个时间点细胞因子的转录水平进行分析,结果显示H37Rv组、BCG组相比于对照组刺激后均使三种细胞因子的转录水平发生变化,其中IL-6和TNF-α发生明显变化。本试验通过对不同时间点细胞因子转录水平研究的分析为结核分枝杆菌对巨噬细胞凋亡机制的研究提供新思路。     

羊口疮病毒感染对巨噬细胞RAW264.7凋亡的影响

羊口疮(Orf)是由羊口疮病毒(ORFV) 引起的一种急性、接触性和高度嗜上皮性人畜共患的动物传染病,主要感染绵羊和山羊,有时威胁人类。本研究将ORFV(OV/HLJ/04株)纯化后作为试验材料,采用巨噬细胞系RAW264.7作为病毒细胞宿主,RAW264.7在LPS体外激活的情况下,接种ORFV,研究ORFV感染对巨噬细胞凋亡的影响。结果表明,用LPS处理的试验组巨噬细胞形态学改变较大,凋亡量也较大;而没用LPS处理过的试验组巨噬细胞变化则相对较少。Western blotting研究结果显示,细胞凋亡信号Caspase-3与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)在24 h时对比,凋亡信号明显减弱,表明在24 h的巨噬细胞凋亡水平有所下降。