牛结节性皮肤病病毒荧光定量PCR方法的建立与应用

为了建立牛结节性皮肤病病毒(LSDV)的快速诊断方法,本试验依据LSDV GCPR基因的保守序列区域设计了荧光定量PCR的引物和探针,并建立了快速诊断LSDV的荧光定量PCR方法。结果表明,建立的LSDV荧光定量PCR方法在3.67×10¹ ～3.67×10⁷ copies/μL拷贝标准品间具有良好的线性关系,线性相关系数达0.9905;该方法具有良好的敏感性,其检测病毒系列含量下限为3.67×10 copies/μL;该方法特异性良好,与山羊痘病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒等病毒不存在交叉反应;该方法重复性较好,批内和批间的变异系数均介于0.133%～1.81%。该方法,临床样品的检测符合率达90%。本试验所建立的LSDV荧光定量PCR方法为临床诊断牛结节性皮肤病提供了一种快速、灵敏的检测方法,为LSDV流行病学调查和监测提供了技术支持。     

基于牛结节性皮肤病病毒ORF61基因荧光定量检测方法的建立

基于国内流行的牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus, LSDV)的基因组序列,建立了靶向ORF61基因的MGB探针荧光定量PCR检测方法。本研究基于LSDV基因序列设计出带有MGB探针的特异性荧光定量PCR引物,并进行特异性和灵敏性筛选验证。最终,筛选得到靶向于LSDV ORF61基因的一对qPCR引物;利用pCAGGS-ORF61真核表达质粒,获得标准曲线y=-3.287 5x+47.87,线性相关系数R²=0.998 6,扩增效率达101%;荧光定量PCR特异性、重复性和灵敏性试验结果表明,该引物的特异性高、重复性良好和灵敏度高等优点;该引物的最低检测限为6.71拷贝·μL^-1,各批次内与批次间重复性结果的变异系数均小于2%。以上结果表明,作者建立特异性LSDV的荧光定量PCR检测方法,为LSD预防和控制提供有效的检测手段。     

鉴别牛结节性皮肤病病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为实现牛结节性皮肤病病毒（LSDV）和羊痘病毒属（CaPV）其他成员的鉴别诊断,针对LSDV 010基因保守区域设计特异性引物及Taq Man探针,与文献报道的CaPV 068基因的通用引物及探针组合,通过优化反应体系和条件,建立了一种可同时鉴别检测LSDV和CaPV其他成员的双重荧光定量PCR检测方法。结果显示：本方法可以特异性扩增LSDV和CaPV其他成员,并且与其他牛、羊病毒无交叉反应,特异性好;对pLSDV-010和pCaPV-068质粒标准品的最低检测限均为15 copies/μL,具有较高的灵敏性;组内和组间变异系数均小于1.75%,重复性良好。应用本试验建立的方法与荧光定量PCR方法同时检测542份临床样品,发现CaPV的样品符合率为98.52%,LSDV为99.63%。本试验建立的方法为CaPV鉴别筛查、LSDV精准防控及流行病学调查提供了快捷有效的技术手段。     

牛支原体TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

以牛支原体p80基因为靶基因,设计特异性引物与探针,优化反应体系,建立了牛支原体TaqMan探针实时荧光定量PCR(TaqMan real-time PCR)检测方法,并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性评估以及临床样本检测。结果显示,特异性试验中,牛支原体2个菌株Cq值均小于18,其余13个非牛支原体菌株Cq值均大于36;敏感性试验中,最低可检3.89拷贝/μL靶DNA,是普通PCR的10~4倍(普通PCR 3.89×10~4拷贝/μL);重复性试验中,组内、组间重复的变异系数均小于1%;44份牛的临床样品利用TaqMan real time PCR检出6份阳性(阳性率为13.64%),分离培养鉴定检出7份阳性,普通PCR检测全部阴性。本研究建立了一种敏感、特异、稳定的牛支原体TaqMan real time PCR检测方法,可用于牛支原体的快速诊断和核酸定量检测。     

猪瘟病毒TaqMan实时荧光定量PCR的建立与应用

为了建立一种既能检测野毒,又能检测疫苗毒的猪瘟病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法,经过对GenBank中所有瘟病毒属成员高度保守的5’端非翻译区序列比对分析后,设计出1对TaqMan Real-time RT-PCR引物、1条TaqMan探针和3条RNA标准品制备引物。猪瘟病毒石门毒株经RNA标准品制备引物RT-PCR扩增后,再经T7 RNA聚合酶体外转录制备包含检测目的片断序列的猪瘟病毒RNA标准品。通过最佳引物、探针浓度的筛选及反应条件的优化,建立了猪瘟病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。该方法批内及批间重复试验变异系数均低于2%,特异性试验仅能检测出猪瘟强毒及疫苗毒株,最低浓度检测极限为1 X 102 copies/μL,上机检测时间少于60 min,建立的标准曲线斜率(Slope)为:-3.97,截距(Intercept)为:47.41,相关系数(R2)为:0.999779。运用该方法对3份猪瘟临床组织样品及6家企业生产的5种细胞苗及2种脾淋苗进行定量检测,结果提示:临床病料含有的病毒拷贝数差异不大,而疫苗产品每头份含有的病毒拷贝数差异较大。所建立的方法具有特异、快速、灵敏、可重复性和线性关系好的特点,不仅适合于猪瘟临床样品的早期检测,也适用于疫苗生产过程中的质控及疫苗制品的效价评估。     

口蹄疫病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立检测口蹄疫病毒(FMDV)的方法,本研究根据GenBank中FMDV的2B基因序列,设计合成一对引物和一条TaqMan探针,将2B基因克隆到pBlueScriptSK(-)载体中,利用T7体外转录试剂盒制备标准品,通过优化反应条件,建立了TaqMan荧光定量PCR检测方法.结果表明,该检测方法的敏感性达到102拷贝/μL;与其它主要相关病毒均不发生交叉反应,批内和批间试验重复性的变异系数(CV)均小于3％.本研究建立的FMDV TaqMan荧光定量PCR方法对FMDV的快速检测具有重要意义.     

牛腺病毒5型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

建立针对牛腺病毒5型六邻体(Hexon)基因的实时荧光定量TaqMan PCR检测方法。根据牛腺病毒5型Hexon基因高度保守区设计引物和TaqMan探针,绘制标准曲线,对其灵敏度、特异性、重复性进行验证,建立牛腺病毒5型实时荧光定量TaqMan PCR快速检测方法。结果显示,构建的重组质粒pUC57-BAV5,标准曲线在10~2～10~7拷贝数之间有较好的线性关系,相关系数为0.975 2,建立检测方法的最低检测限为32拷贝/μL;应用建立的方法检测牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒、牛呼吸道合胞体病毒无交叉反应;重复性试验表明,同一浓度的20个平行样品的变异系数为1.4%。牛腺病毒5型TaqMan探针荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,可以用于牛腺病毒5型的快速、准确的检测。     

鸡传染性贫血病病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据鸡传染性贫血病病毒(chicken infectious anemia virus,CAV)基因组保守区域设计1对特异性引物和探针,通过优化反应条件,建立了一种快速检测CAV的TaqMan实时荧光定量PCR方法,同时验证其特异性、灵敏性和重复性.本试验建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度可达1.8×10¹拷贝/μL,远高于常规PCR方法;并与禽类其他病毒性疾病无交叉反应,具有高特异性.用分离的病毒人工感染1日龄SPF雏鸡,14日龄剖检,对感染鸡体内各器官的病毒分布及载量进行检测,结果表明,在脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、法氏囊和血清中均可检测到病毒,肝脏、胸腺病毒载量明显高于其他组织.本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可同时检测大量临床样品,适用于CAV的诊断与流行病学分析.     

.基于TaqMan探针的牛布氏杆菌实时荧光定量PCR的特异性鉴定

根据牛布氏杆菌BM28保守序列设计引物和探针,建立了一种快速鉴定牛布氏杆菌的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释的含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示:5.0×105~5.0×101拷贝范围内定量PCR均有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为50拷贝每微升。本研究建立的实时荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性和重复性好、方便经济的特性,在牛布氏杆菌的检测与鉴定中具有良好的应用前景。     

鸡毒支原体TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为快速检测鸡毒支原体,根据鸡毒支原体的保守基因设计特异性引物和TaqMan探针,建立鸡毒支原体TaqMan实时荧光定量PCR方法并分析鸡毒支原体培养过程中颜色单位改变法(color change unit, CCU)和荧光定量PCR检测的相关性。结果显示,标准曲线y=-3.646x+44.208,相关系数R²=0.998,最低检测限度为1 copy/μL;与其他菌株等均无交叉反应;组内和组间变异系数均小于3%,表明该方法具有良好的稳定性和可重复性。用建立的实时荧光定量PCR检测方法对26份临床样品进行检测,该方法较普通PCR方法检出率更高。建立的荧光定量PCR与CCU显示鸡毒支原体在对数生长期时,两者具有一定的对应关系。表明建立了鸡毒支原体TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,可实现对鸡毒支原体的快速检测,为鸡毒支原体感染的防控提供技术基础。     

牛巴贝斯虫TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种灵敏、特异、快速的牛巴贝斯虫检测方法,针对牛巴贝斯虫Rap-1a基因设计引物进行PCR扩增,然后构建重组质粒制作标准品,经过优化反应体系、绘制标准曲线,建立了牛巴贝斯虫TaqMan荧光定量PCR方法,并进行灵敏度、特异性及稳定性检测,同时利用该方法对37份田间样品进行检测。结果显示：建立的牛巴贝斯虫TaqMan荧光定量PCR检测方法的标准曲线方程式为y=-3.362×Log（X）+43.32,相关系数R2=0.999,扩增效率为98.4%。该方法的灵敏度为1.0×102 copies/μL,是普通PCR（1.0×104 copies/μL）的100倍。该方法对牛双芽巴贝斯虫、大巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫等7种常见的牛梨形虫病检测结果均为阴性,组内和组间重复试验的变异系数均小于2.5%,37份田间样品的阳性检出率为67.5%。结果表明,本试验建立的牛巴贝斯虫TaqMan荧光定量PCR灵敏度高,且特异、稳定,适用于牛巴贝斯虫的诊断,从而为其流行病学调查提供了快速有效的检测方法。     

猪源牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究旨在建立一种荧光定量PCR检测方法,用于猪源牛病毒性腹泻病毒(BVDVs)检测,同时能鉴别诊断猪瘟病毒(CSFV).根据BVDVs与CSFV 5 '-UTR保守序列,设计一套引物和特异TaqMan探针,以本实验室构建的猪源BVDVs 5′-UTR阳性重组质粒为标准品,通过优化反应条件,建立了标准曲线.以构建的标准品为模板进行了特异性、敏感性、重复性试验、并应用于临床检测.结果显示,该方法检测CSFV、猪繁殖与呼吸综合征病毒均为阴性;最低可检测到每个反应相当于10拷贝的标准品DNA;重复性试验的批内变异系数为0.20％～0.95％;应用所建立方法对临床样品进行检测,其结果与普通RT-PCR结果的符合率为86.7％.本研究建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于猪感染BVDVs、猪瘟疫苗污染BVDVs的监测.     

IBRVgB基因TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank登陆的IBRV保守基因gB序列,利用分子生物学软件Primer Express3．0分别设计2对特异引物及其相应的TaqMan探针,优化反应体系后,建立牛传染性鼻气管炎病毒TaqMan探针荧光定量PCR检测方法。本方法利用10倍稀释的标准品进行扩增确定该方法的灵敏性,通过对伪狂犬病病毒（PRV）、马立克病病毒（MDV）等检测验证特异性,并进行临床检验。结果显示,建立的IBRVgB基因TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的灵敏度为11个拷贝／μL,而且与PRV等非IBRV无交叉反应。本研究所建立的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏、准确、等优点,可用于IBRV的检测。     

流产衣原体TaqMan实时荧光定量PCR 检测方法的建立及初步应用

流产衣原体是导致绵羊地方性流产的主要病原体,给全球畜牧业经济发展构成了巨大威胁。为建立一种灵敏、特异且快速的检测流产衣原体的实时荧光定量PCR方法,依据衣原体蛋白酶样活性因子的基因组序列设计了针对检测流产衣原体的引物和TaqMan探针,对反应体系和反应条件进行了优化,对方法的灵敏度、特异性及重复性进行了评价,并初步应用于临床样本检测。结果显示,该方法的最低检测限为26 copies/μL,灵敏度是普通PCR的10倍;与其他可以引起类似症状的病原体无交叉反应;组内和组间变异系数均小于3%;对156份流产羊拭子的基因组进行检测,检出率为78.21%。研究表明,该方法可以很好的应用于流产衣原体的大规模临床样本检测,为流产衣原体病的高通量检测和流行病学调查提供技术手段。     

牛轮状病毒TaqMan实时荧光RT-PCR 快速检测方法的建立

本研究按照牛轮状病毒(BRV)结构蛋白VP6基因序列,设计合成引物和探针,经各反应条件的优化,建立了BRV TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术。对BRV进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,TaqMan实时荧光RT-PCR最低可检测到100个拷贝病毒RNA;与牛病毒性腹泻病毒(BVD)、猪瘟病毒(CSFV)、牛结核杆菌(MB)和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)不发生交叉反应;所制作的标准曲线在10²~10⁹拷贝/μL浓度范围内有极好的线性关系且线性范围宽,相关系数为0.997;与常规的RT-PCR相比,该方法具有快速、特异、敏感、重复性好、可同时检测大量样品等优点。可对样品中微量BRV进行准确检测,对BRV的诊断有重要意义。     

猪源盖塔病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

猪盖塔病毒感染是由盖塔病毒(GETV)引起母猪妊娠初期胎儿死亡、初生仔猪发病的一种繁殖障碍性疾病。猪是自然界中GETV的主要扩增宿主,可以产生足够高的病毒血症滴度来感染叮咬的蚊子并维持GETV的传播周期,所以定期对猪群进行GETV监测对于预防潜在的GETV暴发具有重要意义。本研究通过分析GETV E2蛋白基因特征,设计特异性引物和探针,条件优化后建立检测GETV感染的Taq Man实时荧光定量PCR方法。结果表明：以阳性质粒为标准品建立的标准曲线在1×10²～1×10⁷ copies/μL内呈现良好的线性关系,扩增效率为1.61;该检测方法的最低检出限低至3.16 TCID₅₀/mL,远远低于普通PCR的检测限3.16×10³ TCID₅₀/m L;组内、组间重复性试验的变异系数均小于2%,具有良好的重复性和稳定性。本研究建立的方法能够快速有效的检测和定量GETV,为猪群中GETV监测提供可靠的检测方法。     

基于TaqMan探针的虎制品实时荧光定量PCR的特异性鉴定

根据虎线粒体细胞色素b核苷酸保守序列设计引物和探针,建立了一种快速鉴定虎制品的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释的含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示,5.0×10⁵~ 5.0×10¹拷贝/μL范围内定量PCR均有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为50拷贝/μL。对豹、狮子、猫等7种非虎哺乳动物DNA样本的检测结果均为阴性。本研究建立的实时荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性和重复性好、方便经济的特性,在虎制品的检测与鉴定中具有良好的应用前景。     

梅迪-维斯纳病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立检测梅迪-维斯纳病毒(MVV)的TaqMan实时荧光定量PCR方法,本研究根据MVV核苷酸保守序列设计引物和探针。以梯度稀释的含有MVV目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示:5.0×105～5.0×101拷贝范围内定量PCR均有S型扩增曲线,检测灵敏度为50拷贝。对羊的其他病毒核酸均无扩增反应。本研究建立的实时定量PCR方法,灵敏度高,特异性好,在MVV的快速检测中具有良好的应用前景。     

羊口疮病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中的羊口疮病毒基因组(AY386264)ORFVgORF121及ORFVgORF122基因的DNA序列,应用Beacon Designer 7.7软件设计一对引物和一条TaqMan探针,以含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了羊口疮病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。该方法组内及组间重复试验变异系数均低于2%,上机检测时间不超过40min,检测灵敏度达1×101copies/μL,山羊痘及禽痘病毒特异性检测均为阴性,标准曲线的相关系数(R2)为0.998 088,线性关系良好。应用该方法对云南保山和普洱送检的羊口疮临床组织病料进行绝对定量检测,送检样品抽提DNA中病毒拷贝数分别为1.35×108copies/μL和9.62×107copies/μL。结果表明,研究建立的羊口疮病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法具有特异、灵敏、稳定、快速和安全的特点,适于羊口疮临床组织样品的早期检测及常规病原监测。