复合有机酸对大肠杆菌攻毒小鼠免疫功能及肠道菌群的影响

【目的】旨在探究饲粮中添加复合有机酸对大肠杆菌攻毒小鼠生长、免疫功能及肠道菌群的影响。【方法】选取7周龄健康雌性昆明小鼠90只,随机分为5组,每组6个重复,每个重复3只小鼠。对照组（CON组）和大肠杆菌组（ETEC组）饲喂基础饲粮,3个有机酸化剂组（OA组）分别饲喂在基础饲粮中添加1.5%,3.0%,6.0%复合有机酸的试验饲粮。试验第15天,对照组小鼠腹腔注射PBS溶液,其余4组小鼠均腹腔注射大肠杆菌培养液（2×108CFU/mL）,试验期为21 d。【结果】（1）攻毒后,饲料中添加有机酸对小鼠的心脏、肝脏和脾脏等器官指数无显著影响（P>0.05）。（2）与CON组相比,ETEC组小鼠血清中炎症相关因子（TNF-α、IL-6、D-LA和DAO）水平升高（P<0.05）,空肠组织中炎症相关基因（IL-6、TNF-α、MyD88和MCP-1）mRNA表达升高（P<0.05）,添加1.5%有机酸可显著降低血清炎性因子含量并下调炎症相关基因mRNA表达量（P<0.05）。（3）与CON组相比,ETEC组小鼠空肠绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度显著降低（P<0.05）...     

抗菌肽对鹌鹑生长性能、免疫功能、血清抗氧化功能和肠道发育的影响

【目的】研究饲粮添加抗菌肽对鹌鹑生长性能、免疫功能、血清抗氧化功能和肠道发育的影响。【方法】选取1 200只1日龄健康、体重相近的雌性鹌鹑,随机分为4组,每组4个重复,每个重复75只。对照组饲喂基础饲粮,抗菌肽Ⅰ组饲喂基础饲粮+0.1%抗菌肽、抗菌肽Ⅱ组饲喂基础饲粮+0.2%抗菌肽、抗菌肽Ⅲ组饲喂基础饲粮+0.4%抗菌肽。试验期为35 d,预试期7 d,正试期28 d。【结果】(1)整个试验阶段,抗菌肽Ⅱ组和抗菌肽Ⅲ组平均日增重显著高于对照组（P<0.05）,料重比显著低于对照组（P<0.05）。(2)第21天,与对照组相比,抗菌肽Ⅱ组、抗菌肽Ⅲ组均显著升高了血清新城疫抗体效价水平（P<0.05）;抗菌肽Ⅲ组胸腺指数显著增高（P<0.05）。第35天,与对照组相比,抗菌肽Ⅱ组、抗菌肽Ⅲ组血清新城疫抗体效价水平、胸腺指数、脾脏指数、血清IL-2和IFN-γ含量均显著升高（P<0.05）。(3)第21天和第35天,所有试验组的血清T-SOD活性和T-AOC含量均显著高于对照组（P<0.05）;抗菌肽Ⅱ组、抗菌肽Ⅲ组血清MDA含量显著低于对照组（P<...     

猪流行性腹泻病毒S1蛋白的免疫原性评估

为了评估猪流行性腹泻病毒(PEDV)S1蛋白的免疫原性,利用果蝇胚胎S2细胞表达重组S1蛋白,将纯化的S1蛋白免疫4周龄昆明小鼠,收集免疫血清及脾淋巴细胞,通过ELISA、病毒中和试验和流式细胞术等方法分析表达的重组S1蛋白的免疫原性。结果显示,与对照组(PBS)相比,重组PEDV S1蛋白免疫组小鼠血清中特异性IgG抗体水平显著提升;二免后14 d,果蝇细胞重组PEDV S1蛋白免疫组小鼠的中和抗体效价达到1∶320;免疫后小鼠脾脏淋巴细胞具有更强的增殖能力;外周血CD3⁺T细胞百分比显著增加,CD4⁺/CD8⁺T细胞比值高于对照组;小鼠血清中IL-4、IFN-γ水平显著上升。综上,成功表达了重组PEDV S1蛋白,其可以诱导小鼠产生高效价的中和抗体,促进细胞免疫应答。     

3种免疫增强剂对猪伪狂犬灭活疫苗的免疫效果评价

【目的】评价盐酸左旋咪唑(LH)、刀豆素(ConA)和胞壁酰二肽(MDP)3种免疫增强剂对猪伪狂犬病毒(PRV)灭活疫苗的免疫增强作用。【方法】将免疫增强剂混入灭活的PRV水相,和油相乳化后制成相应含有免疫增强剂的灭活疫苗,使各免疫增强剂终剂量为:LH 7.5 mg·mL~(–1)、ConA 25.0 mg·mL~(–1)、MDP 150.0 mg·mL~(–1)。首次免疫后14 d进行二次免疫,首次免疫后14 d、二次免疫后7和14 d采取小鼠血清,检测相关的细胞因子和特异性抗体水平,并在二次免疫后14 d攻毒,计算最终的攻毒保护率。【结果】相对于白油组,ConA组和MDP组在二次免疫后14 d对小鼠白介素2(IL-2)含量提升效果极显著;LH组在首次免疫后14 d、MDP组在二次免疫后14 d对白介素4(IL-4)含量提升效果显著;3种免疫增强剂分别在二次免疫后14和7 d对干扰素(IFN-γ)和特异性抗体含量提升效果极显著,并提高了攻毒保护率,LH组和ConA组存活率为20%,MDP组存活率为60%。【结论】3种免疫增强剂使用试验剂量均能不同程度地提升猪伪狂犬灭活疫苗的免疫效果,具有较好的应用前景。本研究结果为后续复合免疫增强剂筛选打下了基础。     

牛IL-18真核表达载体的构建及其对FMD疫苗的免疫增强作用

【目的】探讨牛IL-18(BoIL-18)对口蹄疫(FMD)灭活疫苗的免疫增强作用。【方法】PCR扩增BoIL-18蛋白基因片段,将其定向克隆至pcDNA3.1载体中,构建牛IL-18真核表达质粒pcDNA3.1-BoIL18。将pcDNA3.1-BoIL18与FMD灭活疫苗联合免疫小白鼠,同时设空载体和单纯接种FMD灭活苗组为对照,通过对口蹄疫抗体效价的检测、T淋巴细胞转化试验及NK细胞活性检测试验,研究BoIL18对FMD灭活疫苗的免疫增强作用。【结果】同时接种FMD灭活疫苗和IL-18真核表达质粒的小白鼠T淋巴细胞转化率和NK细胞活性,从接种第21天开始均明显高于单纯FMD灭活苗接种组(P<0.05),所产生的中和抗体效价从第28天开始与单纯接种FMD灭活疫苗组差异显著(P<0.05);空载体组与单纯FMD灭活疫苗组上述3项指标间无显著差异。【结论】牛IL-18真核表达质粒在小白鼠体内得到了良好表达,且表达产物对FMD灭活疫苗的免疫效果具有明显的增强作用。     

猪流行性腹泻病毒3种抗原卵黄抗体的制备

【目的】探讨猪流行性腹泻病毒(PEDV)3种不同抗原制备的卵黄抗体对PEDV的中和能力,为抗猪流行性腹泻卵黄抗体的制备提供新的方法和理论基础。【方法】根据PEDV S糖蛋白基因设计引物扩增PEDVS534基因(636~789位氨基酸)和PEDV COE基因(499~638位氨基酸),并构建原核表达质粒pET32a-PEDV S534和pET32a-COE,分别转化表达菌株BL21(DE3)进行诱导表达。以原核表达的PEDV S534蛋白、COE蛋白以及PEDV灭活病毒为抗原,分别免疫产蛋鸡并制备卵黄抗体,通过病毒中和试验评价各卵黄抗体的中和效力。【结果】成功表达了PEDV S534蛋白和COE蛋白,Western-Blotting分析显示,2种蛋白均具有很好的免疫原性;制备的3种特异性卵黄抗体均具有一定的病毒中和能力,PEDV S534蛋白特异性卵黄抗体的中和效价为1∶12,COE蛋白特异性卵黄抗体的中和效价为1∶25,而PEDV灭活病毒的卵黄抗体中和效价达到1∶120。【结论】PEDV灭活病毒的中和能力最强,其次为COE蛋白特异性卵黄抗体,PEDV S534卵黄抗体的中和能力较弱。     

新现猪Delta冠状病毒RT-PCR检测方法的建立及其应用

【目的】猪Delta冠状病毒（Porcine Deltacoronavirus, PDCoV）是近年来新发现的可引起猪只,特别是新生仔猪腹泻的冠状病毒,其引发的腹泻具有较高的发病率和死亡率,是造成新生仔猪死亡的重要原因之一。试验拟建立新现PDCoV RT-PCR检测方法,并调查当前江西腹泻猪群中PDCoV的感染情况。【方法】通过对GenBank数据库中PDCoV全基因组序列的比对分析,找出保守序列,用Primer 3.0在线软件设计1对扩增PDCoV核衣壳（N）蛋白基因片段的特异性引物,基于该引物建立PDCoV RT-PCR检测方法;用建立的方法检测腹泻猪粪便及肠道样品,挑选阳性扩增产物进行克隆、测序;用本试验获得的PDCoV序列与其他国家或地区的PDCoV序列以及猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）共同构建进化树,分析PDCoV各毒株及其与PEDV和TGEV之间的进化关系;以PEDV、TGEV、猪库布病毒（PKoV）、猪星状病毒（PAstV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）及猪瘟病毒（CSFV）RNA为模板验证引物的特异性;构建PDCoV核衣壳蛋白基因片段重组质粒,并以系列稀释的重组质粒为模板确定所建立的PDCoV RT-PCR方法的敏感性;应用建立的RT-PCR方法调查249份2012-2015年江西省猪群腹泻样品中PDCoV的存在情况,随机抽取一定数量的RT-PCR阳性扩增产物进行克隆、测序进一步验证反应的特异性。【结果】①以腹泻猪粪便样品RNA为模板,应用所设计的特异性引物扩增出了329 bp的单一条带,与预期目的片段大小一致,扩增产物经克隆后测序,将获得的序列与NCBI GenBank数据库序列进行比对,比对结果表明试验所获得的序列与数据库中PDCoV序列的同源性高达99.1%,证明所扩增的序列属于PDCoV;②将8条本试验获得的PDCoV N基因片段序列与18株其他国家或地区的PDCoV毒株以及PEDV、TGEV的相应N基因片段序列构建进化树,结果表明26条PDCoV序列属于同一个分支,而PEDV和TGEV则分别属于不同的分支。试验获得的PDCoV序列与韩国PDCoV毒株KNU14-04亲缘关系最近,同源性高达99.1%;与两株香港毒株HKU 15-44和HKU 15-155亲缘关系相对较远;③本试验建立的RT-PCR方法特异性强,仅能扩增出PDCoV,而对PEDV、TGEV、PKoV、PAstV、PRRSV及CSFV核酸无交叉扩增现象;④所建立的RT-PCR方法灵敏度高,将含扩增片段的重组质粒以1.0×10⁶拷贝/μL为起始浓度依次10倍稀释至1.0×10¹拷贝/μL作为模板验证方法的灵敏度,结果表明所建立的方法对PDCoV最低可检出量为1.0×10³拷贝/μL;⑤应用建立的RT-PCR方法检测了249份2012-2015年采集自江西省各地区的腹泻母猪粪便及腹泻仔猪粪便/肠道样本,结果显示腹泻样本中PDCoV的检出率为31.33%（78/249）,母猪粪便中PDCoV的检出率（27.78%）稍低于仔猪粪便及肠道样品PDCoV的检出率（31.92%）,最早可从2012年的样品中检测出PDCoV。【结论】试验成功建立了检测新现PDCoV的RT-PCR方法;应用所建立的RT-PCR方法检测了249份2012-2015年江西地区猪群临床腹泻样品中PDCoV存在情况,结果表明PDCoV是一种普遍存在于腹泻猪群中的病毒;研究建立的RT-PCR方法对猪群PDCoV的临床诊断和流行病学调查等具有应用价值。     

PPV-VP2蛋白和PCV2-Cap蛋白二联亚单位疫苗的研究

【目的】研制PCV2ORF2基因编码的Cap蛋白与PPV VP2结构蛋白二联亚单位疫苗。【方法】设计截去NLS信号肽序列的Cap蛋白氨基酸序列和VP2蛋白氨基酸全序列,分别进行大肠杆菌偏嗜密码子优化,构建重组表达质粒,利用大肠杆菌表达系统表达出可溶性的Cap蛋白和VP2重组蛋白。将重组蛋白纯化后分别与ISA201佐剂混合制备单苗和二联亚单位疫苗,免疫ICR小鼠,同时设立PBS空白对照和大肠杆菌BL21对照。首免后21d进行加强免疫,利用MTT比色法、细胞中和试验法和ELISA法对免疫小鼠淋巴细胞的转化功能及细胞因子(IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α)mRNA水平、免疫后中和抗体效价以及ELISA抗体水平进行检测。小鼠二免21d后进行PPV和PCV2混合攻毒,利用Real-time PCR法定量测定攻毒后小鼠脾脏的病毒含量。【结果】成功构建了重组质粒pET32a-Cap和pET32a-VP2,表达出可溶性蛋白Cap和VP2,经GEM颗粒和饱和硫酸铵沉淀法纯化蛋白,获得的PCV2Cap蛋白质量浓度为1 213μg/mL,PPV VP2蛋白质量浓度为1 025μg/mL。两种蛋白混合乳化制苗后无相互免疫抑制作用,并且能够诱导机体产生良好的体液免疫和细胞免疫应答。免疫后42d,单苗免疫组和二联亚单位疫苗组PCV2ELISA抗体效价均能达到800以上,中和抗体达到32~38,PPV HI抗体效价均高于6,PPV中和效价高于300,并且诱导机体产生强烈的淋巴细胞增殖反应,提高IL-4和IFN-γ的mRNA表达水平。攻毒试验结果显示,免疫组小鼠脾脏中PCV2和PPV含量显著低于对照组,免疫组组间无显著性差异。【结论】利用大肠杆菌表达的PCV2Cap蛋白和PPV VP2蛋白制备的二联亚单位疫苗免疫ICR小鼠,其抗体水平与Cap、VP2单苗免疫水平相当,且对ICR小鼠有较好的免疫保护作用。     

玉米秸秆发酵垫料微生物对小鼠免疫功能的影响

 【目的】以小白鼠为实验动物模型、玉米秸秆为发酵床垫料,探讨发酵床垫料中的微生物对小鼠机体免疫功能的影响。【方法】将小鼠随机分为4组,第1—3组小鼠分别置于用不同微生物配方发酵的玉米秸秆垫料中饲养,第4组作为对照组,放入未发酵的垫料中饲喂。期间检测小鼠血清中的抗体效价、IL-4和IFN-γ的含量,血液中白细胞总数、淋巴细胞数量、红细胞总数及小鼠盲肠内乳酸菌数量,抗疲劳游泳时间等指标。【结果】发酵垫料组微生物能显著提高小鼠抗体效价和血液中红细胞数量、血红蛋白浓度及盲肠乳酸菌数量（P＜0.05）;可增加血清中IFN-γ、IL-4含量和血液中白细胞总数、淋巴细胞数量,差异不显著（P＞0.05）;抗疲劳试验结果表明,发酵垫料微生物能显著延长小鼠的游泳时间（P＜0.05）。【结论】玉米秸秆发酵垫料微生物可显著提高动物体的免疫功能及健康状况。     

PEDVN蛋白单克隆抗体的制备及间接免疫荧光检测方法的建立

【目的】制备猪流行性腹泻病毒(PEDV) N蛋白单克隆抗体,并建立检测PEDV的间接免疫荧光试验方法。【方法】以重组表达的PEDV N蛋白为免疫原,免疫8周龄雌性BALB/c小鼠,分离高抗体效价小鼠的脾细胞,与SP2/0细胞融合。筛选分泌抗PEDV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。在已经感染PEDV的Vero细胞中,以抗PEDV N蛋白的单克隆抗体为一抗,FITC-羊抗鼠IgG为二抗,建立PEDV的间接免疫荧光检测方法。【结果】制备的杂交瘤细胞株可以稳定分泌抗PEDV N蛋白抗体,细胞上清液的ELISA抗体效价在1∶3 200以上,而诱导的小鼠腹水抗体效价在1∶1 000 000以上。将单克隆抗体应用在间接免疫荧光试验时,最适条件为-20℃80%(φ)丙酮溶液中固定30 min;一抗用PBS缓冲液按体积比1∶1 000稀释,4℃条件下过夜孵育;二抗用PBS缓冲液按体积比1∶100稀释,37℃条件下孵育1 h。以建立的间接免疫荧光试验方法检测细胞中的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PPRV)、猪肠道α冠状病毒(PEAV)、猪轮状病毒(PoRV)和PEDV,只有PEDV显示阳性,其他病毒均为阴性。【结论】制备了抗PEDV N蛋白单克隆抗体,以该抗体为一抗建立检测PEDV的间接免疫荧光试验方法具有良好的特异性,为PEDV的实验室检测及PEDV在培养细胞中的定位和动态分布提供了有效的手段。     

日粮添加鱼油对高脂日粮饲喂小鼠肠道屏障功能的影响

【目的】研究日粮添加鱼油对高脂日粮饲喂小鼠肠道屏障功能的影响。【方法】选用36只4周龄C57BL/6J雌性小鼠,随机分为对照组、高脂组、高脂+鱼油组,每组12只小鼠,分别饲喂基础日粮、高脂日粮、高脂日粮添加质量分数为5%的鱼油(等能替换高脂日粮中脂肪)。试验持续21周,每周测定小鼠采食量和体质量,期间测定小鼠肠道通透性以及粪便粗脂肪含量和能值;试验结束后,检测小鼠血清内毒素水平,检测小鼠肠道形态、杯状细胞的数量、肠道紧密连接蛋白和炎症因子的表达。【结果】与高脂组相比,日粮添加鱼油显著提高了小鼠采食量和能量摄入、降低了粪便中粗脂肪的含量和能量排出,显著降低了小鼠体质量(P0.05)。在肠道形态方面,与高脂组相比,添加鱼油使小鼠空肠和回肠的绒毛高度与隐窝深度比值(l V/d C)分别提高了43.1%和67.5%,使回肠绒毛杯状细胞的数量增多了16.7%(P0.05)。与高脂组相比,添加鱼油使血清荧光葡聚糖和内毒素水平分别降低了34.3%和50.4%(P0.05),并逆转了高脂日粮造成的肠道紧密连接蛋白表达的降低。在炎症因子表达方面,与高脂组相比,添加鱼油显著降低了空肠和回肠内促炎因子IL-8、IL-6和IL-1β的表达,同时显著增加了抗炎因子IL-10的表达(P0.05)。【结论】日粮添加鱼油可降低由高脂日粮导致的小鼠肠道屏障功能损伤,这可能与鱼油降低肠道炎症有关。     

猪流行性腹泻病毒S1-NTD蛋白表达及其免疫原性研究

【目的】在昆虫细胞中表达猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) S1-NTD蛋白,研究其免疫原性,为基于PEDV S蛋白的基因工程亚单位疫苗的研究奠定基础。【方法】PCR扩增PEDV S1-NTD基因,构建其重组表达质粒pFastBac Dual PEDV S1-NTD和重组穿梭质粒Ac-PEDV S1-NTD。将Ac-PEDV S1-NTD转染sf9昆虫细胞,利用昆虫杆状病毒表达系统制备重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD。将P2代重组杆状病毒感染sf9细胞,Western blot鉴定重组蛋白的表达,空斑试验测定重组杆状病毒的滴度。在此基础上,分别以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.1,1和3的P2代重组杆状病毒感染sf9细胞,并在感染后1,2,3,4和5 d收集细胞,通过Western blot和空斑试验分别检测目的蛋白的表达量和重组杆状病毒的增殖情况。将MOI为0.1的P3代重组杆状病毒皮下注射免疫BALB/c小鼠,每隔2周免疫1次,共免疫3次,以注射PBS、空载体Bacmid和PEDV商业疫苗为对照组,于首免后不同时间采集血液分离其血清,ELISA法检测血清中PEDV特异性抗体的水平;于首免后35 d剖取小鼠脾脏,分离其淋巴细胞;PEDV刺激后,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞的增殖情况。【结果】PCR扩增获得了约738 bp的PEDV S1-NTD基因;成功构建了重组表达质粒pFastBac Dual PEDV S1-NTD、重组穿梭质粒Ac-PEDV S1-NTD和重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD。利用杆状病毒表达系统在sf9细胞内成功表达了重组PEDV S1-NTD蛋白,且杆状病毒以MOI为1感染sf 9细胞后在第3天蛋白表达量达到最高。在首免后35 d,重组杆状病毒免疫组小鼠血清效价达到最高值,为1∶5 000,与商业疫苗组效价一致;淋巴细胞增殖试验表明,重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD免疫组小鼠脾淋巴细胞对PEDV的刺激也发生了显著增殖(P0.05),而PBS和空载体Bacmid对照组淋巴细胞未发生明显增殖(P0.05)。【结论】成功构建了重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD,在昆虫细胞中成功表达了PEDV S1-NTD蛋白,且具有较好的免疫原性。     

日粮添加脂肪细胞膜蛋白抗体对猪胴体品质和脂肪代谢相关激素和酶活性的影响

 【目的】 研究口服型脂肪细胞膜蛋白抗体对生长肥育猪胴体品质和代谢的影响及其作用机理。【方法】 体重27 kg左右的杜×长•梅三元杂交商品猪160头，随机分成试验组和对照组。试验组基础日粮中添加75 mg•kg-1脂肪细胞膜蛋白抗体，对照组在基础日粮中添加等量阴性抗体辅料，饲喂104d后屠宰，采集血液和组织样品。用放射免疫法测定血清胰岛素（insulin）和瘦素（leptin）浓度,组织学方法测量脂肪细胞直径，分光光度法测定脂肪组织DNA、RNA浓度、脂肪组织氧化型辅酶Ⅱ-苹果酸脱氢酶（NADP-MDH）活性以及脂肪与肌肉组织中脂蛋白脂酶（LPL）活性。【结果】 试验组平均日增重及瘦肉率分别提高13.03%（P<0.01）和10.30%（P<0.01），背膘厚以及肾周脂肪、肠系膜脂肪和皮下脂肪比率分别下降24.14%（P<0.01）、27.27%（P<0.05）、20.42%（P<0.01）和29.21%（P<0.01），而肌内脂肪含量则不受影响；试验组血清insulin浓度降低26.19%（P<0.05）,leptin 浓度下降26.53%（P<0.05）；不同部位脂肪细胞的直径显著降低；脂肪组织NADP-MDH活性变化不显著；脂肪组织脂蛋白脂酶活性以及脂肪组织与肌肉组织脂蛋白脂酶活性的比值显著下降（P<0.05）。【结论】口服脂肪细胞膜蛋白抗体可显著改善猪的胴体品质；血清insulin、leptin以及组织脂蛋白脂酶活性的改变可能参与这种作用的调节。     

MPLA对口蹄疫O型灭活疫苗的免疫增强效应

【目的】探讨单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A,MPLA)对口蹄疫(food and mouth disease,FMD)O型灭活疫苗的免疫增强效应,提高口蹄疫灭活疫苗的免疫效果.【方法】通过检测MPLA刺激脾脏细胞的增殖情况和刺激DC后成熟及吞噬能力的大小,对MPLA的体外免疫刺激效应进行评价;将MPLA与ISA 206和灭活FMDVO型抗原配制疫苗后免疫小鼠,通过检测抗体水平、T细胞亚群、抗原特异性淋巴细胞增殖及浆细胞的比例,评价MPLA对口蹄疫O型灭活疫苗的免疫增强作用.【结果】MPLA体外可刺激B淋巴细胞增殖,上调DC表面共刺激分子的表达,使其吞噬能力减弱;制备疫苗免疫小鼠,血清抗体水平检测发现,MPLA组在7、14 d时抗体水平显著高于ISA 206组,且其抗原特异性的B淋巴细胞增殖,外周血中CD19~+CD27~+CD38~+浆细胞的比例也显著高于ISA 206组.【结论】MPLA通过促进B淋巴细胞的增殖与活化增加了抗体的产生,增强了小鼠对口蹄疫疫苗的免疫应答能力,证实MPLA是口蹄疫疫苗的良好候选免疫佐剂.     

表达PEDV S蛋白重组仙台病毒的构建及其免疫原性研究

为构建表达猪流行性腹泻病毒(PEDV) S蛋白的重组仙台病毒(SeV),并评价其诱导的特异性免疫应答反应,利用PCR扩增得到PEDV中国流行株的全长S基因,构建含S基因的重组仙台病毒感染性克隆质粒(pBeloBAC-SeV-PEDV-S),并拯救重组病毒SeV-PEDV-S。对重组病毒进行鉴定并测定其生长曲线以确定成功获得表达PEDV S蛋白的重组仙台病毒。将表达S蛋白的仙台病毒免疫小鼠;间接免疫荧光和Western blot试验检测血清中特异性抗体的产生;利用脾脏淋巴细胞分离和流式细胞技术检测特异性T淋巴细胞增殖反应;对血清中的中和抗体效价进行评价。结果表明：重组仙台病毒能特异性表达PEDV S蛋白,且与野生型仙台病毒有一致的生长曲线;免疫小鼠后,重组仙台病毒能有效刺激小鼠产生特异性抗体,诱导较高的中和抗体水平,且能显著促进PEDV特异性T淋巴细胞增殖。综上,该试验为进一步研究重组仙台病毒在猪体上的免疫反应奠定了基础,也为新一代安全有效的PEDV活载体疫苗的研发提供了策略。     

饲粮纤维水平对猪肠道屏障功能、结肠微生物及代谢产物的影响

【目的】添加纤维原料是降低饲料成本的有效方法之一，通过探讨不同纤维水平饲粮对马身猪和杜长大猪肠道健康的影响，为纤维的合理利用提供依据。【方法】初始体重为（20±0.5）kg的马身猪（MS）和杜×长×大三元杂交猪（DLY）各80头，品种内随机分为4组，每组5个重复，每个重复4头猪（公母各半）。试验饲粮分别在玉米-豆粕基础日粮中添加0%、9.35%、18.64%和28.03%的大豆皮，日粮中中性洗涤纤维（NDF）含量分别为9%(9N)、13.5%(13.5N)、18%(18N)和22.5%(22.5N)。试验期30 d。【结果】对于马身猪，18N组回肠IL-10含量、13.5N和22.5N组盲肠TNF-α含量均显著降低（P<0.05）；空肠、回肠、盲肠杯状细胞数目随纤维水平的提高而增加，结肠杯状细胞数量和MUC2表达水平在13.5N和18N组均显著增加（P<0.05）;18N和22.5N组Claudin-2、Occludin、E-cadherin、ZO-1、ZO-2的表达量显著增加（P<0.05）;13.5N、18N和22.5N组的大肠杆菌志贺氏菌丰度显著降低（P<...     

猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗血清学效力检验与靶动物免疫攻毒保护相关性研究

以实验室试制的3批猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗(JL株+HN-1株),对3~5日龄仔猪进行接种,免疫后14、21 d分别采血,分离血清,检测各组仔猪的TGEV、PEDV中和抗体,并以TGEV和PEDV强毒进行攻毒。结果表明,中和抗体效价的升高,对仔猪的保护率也随之升高,两者呈正相关。当血清中TGEV中和抗体达到132时,可以完全保护仔猪抵抗TGEV强毒的攻击;PEDV中和抗体达到116时,可以完全保护仔猪抵抗PEDV强毒的攻击。     

猪δ冠状病毒N蛋白的原核表达和间接ELISA检测方法的建立

【目的】制备猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白及其多克隆抗体,建立检测PDCoV N蛋白抗体的间接ELISA方法。【方法】从PDCoV CH-01毒株中扩增N全基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-PDCoV-N,转入BL21(DE3),用IPTG诱导表达重组N蛋白,并对该蛋白的反应原性进行鉴定。诱导表达的N蛋白经镍柱纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。同时用镍柱纯化后的N蛋白作为包被抗原,建立PDCoV的间接ELISA检测方法,对该方法的特异性、重复性和稳定性进行检测,并利用该方法对河南部分地区猪场送检的165份临床猪血清样本进行PDCoV抗体检测。【结果】成功克隆了1 026 bp的N基因,构建了重组表达载体pET-28a-PDCoV-N,经诱导表达后获得了重组N蛋白,其相对分子质量约42.9 ku,Western blot分析表明所表达的蛋白可与抗PDCoV全病毒猪阳性血清发生反应。制备的PDCoV N蛋白多克隆抗体经Western blot检测表明,该抗体具有特异性;间接免疫荧光试验测定该多克隆抗体在ST细胞上的最佳使用稀释度为1∶200。以N蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法,确定最佳的反应条件如下:抗原2μg/mL在4℃过夜包被,10 g/L BSA在37℃下封闭2 h,血清(1∶80稀释)37℃孵育1 h,酶标二抗(1∶6 000稀释)37℃孵育1 h,TMB在37℃下显色15 min;待检血清OD_(450)值≥0.272判定为阳性。特异性试验结果显示,该包被抗原与其他猪常见病毒的阳性血清均无交叉反应,批内和批间重复试验变异系数均小于5%。用间接ELISA法对来自河南不同地区的165份血清样本进行检测,结果表明各地样本PDCoV抗体阳性率平均为53.94%。【结论】成功表达了PDCoV N蛋白,制备了其多克隆抗体,建立了PDCoV间接ELISA检测方法,该方法具有良好的特异性、重复性和稳定性,可用于临床猪血清中PDCoV抗体的检测。     

玉米赤霉烯酮污染日粮添加改性蒙脱石对断奶仔猪免疫指标的影响

【目的】研究1.0 mg•kg-1玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEA）污染日粮对断奶仔猪血液学、外周血T淋巴细胞亚群、血清免疫球蛋白和猪瘟抗体效价的影响,同时评价改性蒙脱石的脱毒效应。【方法】将36头试验仔猪按体重随机分为6个处理组（公母各半）,仔猪采用试验笼单独饲养;对照组饲喂基础日粮,试验1组在基础日粮的基础上添加1.0 g•kg-1改性蒙脱石（商品名：Calibrin-Z）,试验2组在基础日粮的基础上添加1.0 mg•kg-1 ZEA,试验3、4和5组在试验2组的基础上分别添加1.0、2.0和4.0 g•kg-1 Calibrin-Z。预饲期7 d,正式期22 d。【结果】与对照组相比,日粮添加1.0 mg•kg-1 ZEA组能显著降低断奶仔猪血小板、淋巴细胞比率、血红蛋白含量、外周血CD4+和CD8+的比例、血清IgG产量和21 d仔猪血清猪瘟抗体水平（P＜0.05）,1.0 mg•kg-1的ZEA处理组日粮添加2.0-4.0 g•kg-1 Calibrin-Z能够显著改善ZEA诱导的免疫毒性（P＜0.05）;且随日粮Calibrin-Z水平的增加,血小板、淋巴细胞比率、血红蛋白和血清IgG线性升高（P＜0.05）。【结论】1.0 mg•kg-1的ZEA足以诱导仔猪的免疫毒性,添加2.0-4.0 g•kg-1 Calibrin-Z具有显著的脱毒效应。     

菌草灵芝多糖肽对闽西南黑兔生长性能、血液生化指标及免疫机能的影响

【目的】研究日粮中添加菌草灵芝多糖肽（JCGLPP）对闽西南黑兔生长性能、血液生化指标及免疫功能的影响,为JCGLPP在肉兔中的应用提供依据。【方法】选取(33±2) d、初始体质量（655.65±25.90）g、健康状况良好的断奶闽西南黑兔公兔100只,随机分为4组,对照组饲喂基础饲粮,试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别饲喂在基础饲粮中添加50,100和150 mg/kg JCGLPP的日粮,56 d后统计腹泻率和死亡率,测算平均日采食量（ADFI）、平均日增重（ADG）以及料重比（F/G）;屠宰后取背腰最长肌,测定pH值、滴水损失率和剪切力;采集血清,测定总蛋白（TP）、白蛋白(ALB)质量浓度,尿素氮(UN)、丙二醛(MDA)浓度,超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性以及IgG、IgA、IgM和IL-6质量浓度;计算心脏、肝脏、肾脏、圆小囊、脾脏、胸腺和蚓突器官指数;测定十二指肠、空肠、回肠黏膜炎性因子 IL-1α、IL-2和分泌型免疫球蛋白(sIgA)质量浓度及肠道淀粉酶、纤维素酶和胰蛋白酶活性。【结果】①各组间兔的终末体质量、平均日增重、平均采食量和料重比均无显著差异（P>0.05）;对照组兔的腹泻率和死亡率最高,Ⅱ组兔的腹泻率显著低于对照（P＜0.05）。②试验组兔肌肉的pH、滴水损失和剪切力均与对照无显著差异（P>0.05）。③Ⅱ组兔血液中的TP、ALB质量浓度及SOD、GSH-Px活性显著高于对照(P＜0.05),而UN和MDA浓度显著低于对照(P＜0.05)。④Ⅱ组兔血液中的IgG、IgA、IgM质量浓度均显著高于对照(P＜0.05),而IL-6质量浓度各组差异不显著（P>0.05）。⑤各组兔免疫器官指数差异均不显著（P>0.05）;试验组兔十二指肠、空肠、回肠IL-1α、IL-2和sIgA质量浓度大多显著高于对照（P＜0.05）,肠道淀粉酶活性均显著低于对照(P＜0.05),Ⅰ组兔的肠道纤维素酶和胰蛋白酶活性、Ⅱ组兔的肠道胰蛋白酶活性显著高于对照(P＜0.05)。【结论】JCGLPP对闽西南黑兔的促生长作用不明显,但能提高机体的抗氧化和免疫能力,降低腹泻率和死亡率,添加量以100 mg/kg为宜。