SMAD6对猪未成熟支持细胞增殖和凋亡的影响

睾丸未成熟支持细胞的增殖活性对种公畜繁殖性能有重要影响,睾丸基因组DNA甲基化(5mC)不同发育阶段特异性引起的基因差异表达可以调控支持细胞的增殖活性。在课题组前期研究中,SMAD6被鉴定出是睾丸发育过程中受3′UTR甲基化水平调控的枢纽基因之一,但其生物学功能尚未被发掘。本研究旨在探究SMAD6对猪未成熟支持细胞增殖和凋亡的作用。在体外培养的猪未成熟支持细胞中过表达SMAD6或干扰SMAD6表达后,检测细胞周期和增殖相关基因的相对表达量、细胞增殖情况、细胞ATP水平、细胞凋亡率及凋亡相关蛋白的表达情况。结果显示：过表达SMAD6后细胞周期及增殖相关基因的相对表达量上升(P<0.05或P<0.01)、细胞增殖增加(P<0.05或P<0.01)、细胞ATP水平升高(P<0.01)、细胞的凋亡率下降(P<0.05)、促凋亡相关蛋白BAX和Caspase3的表达降低(P<0.05);干扰SMAD6表达结果则与之相反。研究结果提示,SMAD6促进猪未成熟支持细胞的增殖且抑制其凋亡。     

BMP4调控睾丸支持细胞增殖的初步研究

旨在研究BMP4对睾丸支持细胞增殖的调控.本试验选取0、1、2和3月龄组的健康大足黑山羊公羊各3只,采集睾丸支持细胞,每次试验均设3个生物学重复和3次技术重复,通过体外培养、细胞免疫荧光、基因干扰、过表达、qPCR和Western blotting等技术对BMP4是否通过Id2对山羊睾丸支持细胞进行调控以及它们的调控关...     

miR-18a通过靶向结合CTGF调控猪颗粒细胞凋亡

为探究miR-18a对猪卵巢颗粒细胞凋亡的调控作用,利用生物信息学分析、荧光素酶活性检测和体外培养颗粒细胞试验验证miR-18a对CTGF的靶向作用及其在猪颗粒细胞中对CTGF基因表达的影响,并通过流式细胞技术检测其对猪卵巢颗粒细胞凋亡的调控作用。生物信息学分析结果表明,CTGF是miR-18a的潜在靶基因,荧光素酶活性检测进一步验证了miR-18a与CTGF的结合。在培养的颗粒细胞中转染miR-18a模拟物后,qRT-PCR和Western blot结果显示CTGF的mRNA和蛋白水平均显著降低,流式细胞技术检测表明miR-18a显著促进颗粒细胞的凋亡。而转染miR-18a抑制剂后,猪颗粒细胞的凋亡率显著降低,共转染miR-18a抑制剂和CTGF的干扰RNA后,颗粒细胞的凋亡率呈现回升。试验结果表明miR-18a通过靶向结合CTGF基因调控猪颗粒细胞的凋亡。     

miR-21:生成、表达调控及对其细胞凋亡的影响

凋亡是细胞的一种基本生物学现象,在机体生命过程中发挥着重要作用。miRNAs是在真核生物内发现的一类长度约22个核苷酸的内源性非编码单链小RNA,通过调控靶基因的表达参与调控细胞的凋亡、分化、增殖、侵袭和代谢。大量的研究表明,miR-21作为miRNAs重要成员之一,与细胞凋亡有重要联系。本文将从miR-21的生成、表达调控及对细胞凋亡的影响方面进行综述。     

miR-196a降调RCC2对睾丸支持细胞增殖的促进作用

为探究miR-196a对猪未成熟支持细胞增殖的影响及其机制,将miR-196a的激活剂(mimics)、抑制剂(inhibitor)及miR-ShNC转染至支持细胞,MTS方法检测细胞活力。发现miR-196a mimics能促进支持细胞的增殖,miR-196a inhibitor抑制细胞增殖;使用Targetscan软件预测miR-196a靶基因为RCC2 (regulator of chromosome condensation 2),将miR-196a的mimics及inhibitor转染支持细胞后使用RT-qPCR和Western blot法检测RCC2的表达,结果显示miR-196a下调RCC2的表达,RCC2是miR-196a的靶基因;使用RCC2的siRNA与miR-196a inhibitor共转染支持细胞,MTS方法观察支持细胞活力,发现干扰RCC2基因后,可促进支持细胞的增殖。本研究表明miR-196a通过下调RCC2促进支持细胞的增殖,为后续探索miR-196a在猪睾丸支持细胞发挥的作用提供一定的试验基础和理论依据。     

miR-188对小鼠乳腺癌细胞增殖、迁移及凋亡的影响

【目的】探讨microRNA-188-5p(miR-188)在乳腺癌细胞增殖、迁移和凋亡过程中的调控作用,以期为乳腺癌相关治疗药物的研发提供理论依据。【方法】培养小鼠乳腺癌细胞(4T1),建立4T1细胞小鼠移植瘤模型,分离肿瘤组织和瘤旁组织,用实时荧光定量PCR法检测miR-188的表达情况;在4T1细胞中分别转染miR-188的模拟物(miR-188 mimics)、模拟物对照(mimics-NC)、miR-188抑制物(miR-188 inhibitor)及抑制物对照(inhibitor-NC),不转染的细胞为空白对照(Con),用实时荧光定量PCR法检测各组细胞miR-188的表达水平,CCK-8法检测细胞增殖能力,细胞划痕试验检测细胞的迁移率,流式细胞术检测细胞的凋亡率,Western blotting检测细胞相关凋亡蛋白的表达情况。【结果】瘤旁组织中miR-188的相对表达量显著高于肿瘤组织(P<0.05);细胞转染结果表明,与Con组相比,miR-188 mimics组miR-188的相对表达量显著上调(P<0.05),而miR-188 inhibitor组显著...     

miR-16a对牛肌卫星细胞增殖和分化的影响

为了探究miR-16a对牛肌卫星细胞增殖和分化的影响,试验通过NCBI和Ensembl数据库分析整合miR-16a的位置及信息,用miR-16a mimics转染牛肌卫星细胞,将牛肌卫星细胞分为试验组(miR-16a mimics)和对照组(NC),采用实时荧光定量PCR扩增、Western-blot检测和EdU细胞增殖试验对转染处理后的牛肌卫星细胞的增殖和分化两个时期进行研究。结果表明：miR-16a位于牛12号染色体的反义链上,并由前体bta-miR-16a的5′端加工生成成熟的miR-16a。在增殖期,与对照组比较,试验组增殖标志因子Pax7 mRNA和其蛋白相对表达量显著或极显著下调(P<0.05或P<0.01),EdU标记指数显著降低(P<0.05)。在分化期,与对照组比较,试验组分化标志因子MyoG mRNA相对表达量极显著下调(P<0.01)。说明miR-16a对牛肌卫星细胞的增殖和分化均存在抑制作用。     

miR-186-5p调控猪原代前体脂肪细胞增殖和分化的研究

旨在探究miR-186-5p对猪原代前体脂肪细胞增殖和成脂分化的调控作用及机制.本研究采集7日龄健康马身猪公猪的颈部皮下脂肪,分离培养马身猪原代前体脂肪细胞;猪原代前体脂肪细胞分为4组,分别转染miR-186-5p模拟物(mimics)及其对照组(mimics NC),miR-186-5p抑制剂(inhibitor)及...     

H2O2对睾丸支持细胞凋亡的影响

本试验利用H2O2处理培养的仔猪睾丸支持细胞(SC),通过细胞活力检测、酶活性检测、电镜观察、流式细胞仪等方法,研究H2O2对 SC凋亡的影响.结果发现,H2O2对SC的作用具有时间和剂量依赖性,600 μmol/L的H2O2能诱导SC的凋亡率明显增加,细胞的超微结构受到破坏,出现明显的凋亡小体,同时也发现细胞的抗氧化能力下降.这表明,H2O2通过降低细胞的抗氧化能力,促进了SC的凋亡.     

miR-193a在MDBK细胞中诱导细胞凋亡的研究

本试验旨在研究miR-193a在致细胞病变型牛病毒性腹泻病毒(cp BVDV)感染MDBK细胞过程中诱导细胞凋亡的分子机制。试验利用TargetScan和Microcosm Targets等生物信息学在线软件预测凋亡相关的miR-193a靶基因Bax,并利用双荧光素酶报告基因系统验证miR-193a的靶基因;用过表达miR-193a的慢病毒pre-miR-193a-lv和抑制miR-193a表达的慢病毒pre-miR-193a-inhibitor-lv分别侵染MDBK细胞,48 h后收集细胞,然后用实时荧光定量PCR、Western blotting和流式细胞仪检测凋亡通路中Bax的表达水平及MDBK细胞凋亡率。结果预测并验证了miR-193a的靶基因为Bax;双荧光素酶报告基因分析结果显示miR-193a能直接结合到Bax 3'UTR区域中的miRNA反应位点,并极显著下调Bax的表达水平(P<0.01);流式细胞仪检测凋亡率结果显示,感染pre-miR-193a-lv慢病毒的MDBK细胞凋亡率极显著升高(P<0.01)。结果表明miR-193a能直接靶向凋亡通路中Bax基因,从而促进凋亡的发生。     

miR-92a对奶山羊乳腺上皮细胞增殖及凋亡的调控分析

miRNAs是对哺乳动物乳腺组织发育及泌乳机能进行调控的重要因子。本研究依据已有的关中奶山羊乳腺组织miRNA表达谱,选择不同泌乳时期差异表达的miR-92a为研究对象,探究miR-92a对山羊乳腺上皮细胞（GMEC）增殖及凋亡的调控作用,并挖掘其潜在的调控基因。采用荧光定量PCR、MTT检测、EdU检测及流式细胞术,检测miR-92a在不同泌乳时期乳腺组织的表达情况,并在细胞水平检测miR-92a对乳腺上皮细胞增殖、凋亡及细胞周期的调控作用。利用RNA-seq技术,分析过表达miR-92a乳腺上皮细胞中的差异表达基因。qRT-PCR结果显示,miR-92a在奶山羊泌乳初期乳腺组织中表达量极显著高于泌乳中期（P<0.01）,表明miR-92a可能对奶山羊泌乳性状有重要的调控作用。GMEC过表达miR-92a后,试验结果显示：与NC对照组比较,miR-92a过表达组的EdU阳性细胞数极显著减少（P<0.01）,S期的细胞数显著下降、G1期的细胞数显著增加,同时miR-92a组的凋亡细胞数目显著增加（P<0.05）。采用RNA-seq,构建了miR-92a过表达mRNA文库,发现下调基因54个,上调基因160个。GO terms及KEGG通路分析显示差异表达基因调控乳腺上皮细胞多种生物学功能。以上结果表明miR-92a促进GMEC凋亡、抑制其增殖,测序结果进一步证明miR-92a对奶山羊乳腺发育及泌乳性能具有潜在的调控作用。     

miR-23a-27a-24簇在猪卵巢颗粒细胞凋亡中的作用

为了解猪miR-23a-27a-24簇的序列及结构特征,分析其在猪卵巢颗粒细胞凋亡中的作用,采用测序技术获得猪miR-23a-27a-24簇前体序列;利用生物信息学方法分析miR-23a-27a-24簇的序列信息、结构和生物学功能;使用双酶切法构建猪miR-23a-27a-24簇的过表达载体,转染至体外培养的猪卵巢颗粒细胞中,qRT-PCR检测过表达效果;通过流式细胞术检测颗粒细胞凋亡率。结果显示：猪miR-23a-27a-24簇前体序列长度为408 bp,核苷酸序列与其他哺乳动物的一致性较高;哺乳动物miR-23a-27a-24簇均位于基因组中ZSWIM和miR-181c基因之间,成员转录顺序相同、间距相近;功能富集分析发现,miR-23a-27a-24簇的靶基因主要富集于RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控的生物学过程和PI3K-Akt信号通路中;成功构建猪miR-23a-27a-24簇的过表达载体,且在猪卵巢颗粒细胞中高效表达;流式细胞术分析发现,转染miR-23a-27a-24簇过表达载体能够显著提高颗粒细胞的凋亡率(P<0.05),极显著提高颗粒细胞早期凋亡率(P<0...     

FSH对仔猪睾丸支持细胞增殖和GDNF表达的调节

以原代培养的仔猪睾丸支持细胞（SC）为试验模型，研究了FSH对SC胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）表达及其增殖的影响。结果显示，外源性添加FSH可促进GDNF蛋白表达，而且这种促进作用具有浓度和时间依赖关系，GDNF蛋白水平随着FSH浓度的增加而升高，FSH浓度为50ng／mL时，GDNF水平达到最高，然后逐渐降低；FSH（50ng／mL）作用30min，可显著促进GDNF蛋白的表达（P〈0．05），当FSH作用1h时，GDNF蛋白水平达到最高，随后逐渐降低。FSH可以时间-剂量依赖性促进SC增殖细胞核抗原（PCNA）的表达，FSH（50ng／mL）作用30min时，PCNA的表达显著增加（P〈0．05），作用1h达极显著水平（P〈0．01），至2h时，PCNA蛋白的表达水平达到最高，随后逐渐降低。提示，FSH可在体外条件下通过刺激SC表达GDNF进而促进其增殖。     

转染miR-106a对牦牛卵泡颗粒细胞增殖和激素分泌的影响

为探究miR-106a对牦牛卵泡颗粒细胞(GCs)增殖和激素分泌的影响,本试验通过体外分离培养牦牛卵泡GCs,分别转染miR-106a模拟物(miR-106a mimics)和miR-106a抑制剂(miR-106a inhibitors),利用CCK-8法检测GCs细胞增殖,ELISA法分别检测雌二醇(E₂)和孕酮(P₄)激素分泌情况。结果显示,与对照组相比,24、48、72和96 h时,miR-106a mimics组和miR-106a inhibitors组牦牛GCs的细胞增殖受到极显著抑制(P<0.01)。与对照组相比,GCs转染48 h时,miR-106a mimics组E₂分泌量极显著升高,而miR-106a inhibitors组E₂分泌量极显著降低(P<0.01);GCs转染72 h时,miR-106a mimics组和miR-106a inhibitors组E₂分泌量均极显著降低(P<0.01);GCs转染48 h时,miR-106a mim...     

绵羊miR-200b对卵泡颗粒细胞周期和凋亡的影响

旨在揭示miR-200b在绵羊卵泡颗粒细胞的作用。本研究利用在线工具（TargetScan、miRTarBase及miRDB）预测miR-200b的靶基因,并利用KOBAS对其进行GO和KEGG通路富集分析。将分离培养的绵羊卵泡颗粒细胞分为4组,分别转染miR-200b mimic、mimic NC、miR-200b inhibitor和inhibitor NC,每组6个重复。采用CCK8法分别检测转染24、48和72 h颗粒细胞的存活率;采用荧光定量PCR检测miR-200b、CDK4、CDK6、CCND1、CCND2、Bax和Bcl-2基因的表达水平。利用3种在线工具预测到25个miR-200b的共同靶基因,GO和KEGG通路富集分析发现这些基因富集在细胞的增殖分化、细胞周期及生殖发育过程;转染miR-200b mimic、miR-200b inhibitor和NC后,颗粒细胞存活率随时间延长呈“V”型趋势降低,且48 h达最低（P<0.01）;miR-200b inhibitor与inhibitor NC组相比,miR-200b表达量无显著差异（P>0.05）;与mimic NC相比,miR-200b mimic组极显著促进miR-200b表达（P<0.001）,显著下调CDK4（P<0.01）、CDK6（P<0.001）和CCND1（P<0.001）、CCND2（P<0.05）和Bcl-2（P<0.01）基因表达水平,Bax表达并无显著变化（P>0.05）,且极显著下调Bcl-2与Bax比值（P<0.001）。综上所述,miR-200b抑制绵羊卵泡颗粒细胞细胞周期和增殖并促进其凋亡。     

miR-181a和miR-181d-5p对猪前体脂肪细胞成脂分化调控的研究

【目的】 探究miR-181a和miR-181d-5p在荣昌猪原代前体脂肪细胞分化中的作用及机制。【方法】 通过比对种子序列差异分析miR-181a和miR-181d-5p在猪、人、大鼠和小鼠不同物种间的序列保守性;实时荧光定量PCR检测miR-181a和miR-181d-5p在猪肌肉和背部皮下脂肪组织中表达;利用miRandn和TargetScan在线软件预测miR-181a和miR-181d-5p的靶基因,并进行GO和KEGG富集分析;使用RNAhybrid在线软件预测miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的结合自由能。取7日龄雄性荣昌猪背部皮下脂肪组织分离原代前体脂肪细胞。分别设计miR-181a和miR-181d-5p的靶基因野生型和突变型载体,并与对应的miRNA共转染前体脂肪细胞,进行双荧光素酶报告基因试验验证miRNA与靶基因的靶标关系,测定miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的结合情况。构建miR-181a和miR-181d-5p的模拟物（miR-181a mimics、miR-181d-5p mimics）、抑制物（miR-181a inhibitor、miR-181d-5p inhibitor）、阴性对照（NC）及其靶基因的干扰siRNA （Gene-siRNA）,转染细胞6 h后进行诱导分化。6 d后,分别对不同处理的细胞通过实时荧光定量PCR检测基因表达情况,油红O染色鉴定甘油三酯生成情况。【结果】 保守性分析结果表明,miR-181a和miR-181d-5p在猪、人、大鼠和小鼠间具有高度序列保守性;miR-181a与miR-181d-5p在猪不同组织中定量结果显示,miR-181a与miR-181d-5p在猪脂肪组织中特异性高表达;靶基因预测结果表明,miR-181a与miR-181d-5p的靶基因分别为线粒体甘油3-磷酸脱氢酶（GPD2）和环腺苷酸反应元件（CREB1）;GO和KEGG功能富集分析发现,miR-181a和miR-181d-5p的靶基因可以抑制甘油三酯生成,调节脂肪细胞分化,且miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的自由结合能均<－87.8 kJ/mol;双荧光素酶报告基因试验结果表明,转染miR-181a与miR-181d-5p的mimics可以极显著抑制靶基因3'-UTR野生型双荧光素酶报告载体中的荧光素酶活性（P<0.01）,但不影响靶基因突变型双荧光素酶报告载体中的荧光素酶活性。诱导分化结果表明,与未分化脂肪细胞（0 d）相比,miR-181a表达量在分化的第4天显著升高（P<0.05）,到第6天达到极显著差异（P<0.01）;miR-181d-5p及GPD2和CREB1基因表达量在分化的第4、6天均极显著升高（P<0.01）。miR-181a和miR-181d-5p的细胞转染试验均得到相似结果,与NC组相比,mimics组miR-181a与miR-181d-5p的表达量均极显著上升（P<0.01）,inhibitor组miR-181a与miR-181d-5p表达量均极显著下降（P<0.01）;mimics和siRNA组的GPD2与CREB1基因表达量均极显著下降（P<0.01）,inhibitor组GPD2与CREB1基因表达量均极显著上升（P<0.01）;mimics和siRNA组PPARγ和C/EBPα基因的相对表达量均显著或极显著上升（P<0.05;P<0.01）,inhibitor组PPARγ和C/EBPα基因的表达量均显著下降（P<0.05）;油红O染色结果表明,与NC组相比,mimics和siRNA组细胞脂滴数目增加,inhibitor组细胞脂滴数目减少。【结论】 miR-181a和miR-181d-5p可以分别靶向结合GPD2和CREB1基因3'-UTR区域序列,降低GPD2和CREB1基因的表达,促进猪前体脂肪细胞成脂分化。     

锌对鹅淋巴细胞凋亡和细胞增殖周期影响的研究

试验选用120只1日龄鹅随机分成4组，A组喂以玉米大豆为基础日粮未加锌的饲料，另3组在基础日粮中添加ZnSO₄·H₂O，使锌含量分别为40(B组)、110(C组) 和2000 mg/kg(D组)。应用流式细胞仪观测锌对鹅细胞周期和细胞凋亡的影响。结果显示锌添加量为110 mg/kg时，鹅血液淋巴细胞、胸腺、脾脏细胞的增殖指数和DNA含量最高。低锌和高锌饲料可以引起血液淋巴细胞的凋亡。     

miR-218-5p调控安哥拉兔毛囊毛乳头细胞增殖的研究

本文旨在探讨miRNA-218-5p对兔毛乳头细胞毛囊发育相关基因的影响,为研究家兔毛囊发育中的作用机制提供理论依据。用酶消化法分离兔毛乳头细胞,用MSCM培养基培养毛乳头细胞。将培养的毛乳头细胞分为4组,分别转染miR-218-5p mimics、miR-218-5p mimics NC、miR-218-5p inhibitor、miR-218-5pinhibitorNC。培养48h后,收集细胞。使用RNA提取试剂盒提取各组RNA,使用RT-qPCR检测各组miR-218-5p的mRNA表达水平和毛囊生长发育相关基因表达水平。使用CCK-8检测各组细胞增殖情况。结果发现,在兔DPCs(Dermal Papilla Cells)中过表达miR-218-5p能够显著上调毛囊生长发育相关基因如CCND1、CTNNB1、LEF1的mRNA表达水平,显著下调TGF-β1、BMP4的mRNA表达水平;敲减miR-218-5p能够显著下调毛囊生长发育相关基因如CCND1、CTNNB1、LEF1的mRNA表达水平,显著上调TGF-β1、BMP4的mRNA表达水平。过表达miR-218-5p后,极显著...