H9N2亚型禽流感病毒NA和M2基因的克隆与表达

旨在分别构建NA蛋白和M2蛋白的重组质粒,并进行表达鉴定。采用PCR扩增了H9N2分离株A/chicken/Shandong/LY1/2017毒株的NA基因和M2基因。同源性分析证实,这2个基因序列与目前流行毒株的基因同源性很高。将NA基因克隆至pcold1原核表达载体,将M2基因克隆至pET28a原核表达载体,成功构建了pcold1-NA和pET28a-M2重组质粒,并成功表达出相应的融合蛋白。然后对表达的融合蛋白进行纯化,并采用免疫印迹验证其免疫反应性。本试验为进一步研究H9N2亚型禽流感病毒致病机制及检测技术奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的原核表达及鉴定

为获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白,以一株PRRSV NADC30-like毒株的基因组RNA为模板,利用RT-PCR扩增出ORF5基因后,将该基因克隆至原核表达载体pCold-TF中,构建了重组质粒pCold-TF-GP5,转化Rosetta(DE3)后用IPTG诱导,经SDS-PAGE、Western blot鉴定,重组蛋白获得了可溶性表达,大小约为72 ku。将该蛋白过镍柱纯化后获得浓度为0.5 mg/mL的纯化蛋白,为下一步GP5蛋白单克隆抗体的制备奠定物质基础。     

基于间接ELISA检测方法新生仔猪流行性腹泻病探析

本文为探析新生猪仔的流行性腹泻病毒,构建猪流行性腹泻病毒蛋白间接的ELISA检测方法,从新分离PEDV流行毒株中扩增其N基因,并将N基因克隆至DNA原核表达载体中构建重组质粒,经过诱导的重组蛋白呈可溶性表达。将纯化的N蛋白作为包被抗原建立ELISA检测方法,并且对各种检测条件进行优化优化后确定N蛋白最佳包被条件为37度,该间接ELISA方法为PEDV诊断和流行病学调查提供了有益参考。     

禽呼肠孤病毒σC基因的克隆和表达

采用RT-PCR技术设计扩增禽呼肠孤病毒(ARV)S1133毒株的σC基因,将扩增基因克隆至pMD-19T载体上,经PCR、酶切及测序鉴定,克隆的基因片段为ARV σC基因.将该基因重组至pET32a(+)原核表达载体上成功构建了表达裁体pET32a-σC.该重组质粒在大肠杆菌BL21中经1.0 mmol/L IPTG诱导5 h得到最佳表达.表达重组蛋白的相对分子质量为54 000,以包涵体形式存在.经Western-blot分析表明,该重组蛋白能于ARV阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性.     

新疆株猪圆环病毒3型Cap基因的序列分析及原核表达

克隆并原核表达新疆株猪圆环病毒3型(PCV3)衣壳蛋白(Cap)基因,为PCV3检测试剂的研发奠定基础。采用PCR扩增PCV3新疆分离株的Cap基因,采用Chou-Fasman法、Karplus-Schulz法、Kyte-Doolittle法、Emini法和Jameson-Wolf法预测蛋白的二级结构、蛋白质骨架区的柔韧性、亲水区/疏水区、可及性和抗原指数,将PCV3 Cap基因克隆到pEASY-Blunt Simple载体,经HindⅢ、NdeⅠ双酶切,亚克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET30a-PCV3-Cap,测序验证后转入大肠埃希氏菌BL21(DE3)感受态细胞,通过IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE和Western blot对表达的重组蛋白进行分析鉴定。结果显示,成功扩增并克隆到新疆株PCV3 Cap基因,通过序列分析发现所获PCV3 Cap基因与参考毒株的同源性为98.0%～98.6%之间,推导氨基酸有6个点突变,分别位于24、27、29、56、75、77和150aa位置;在11-17、37-41、54-60、97-101、119-134、138-140、142-146、155-160、170-172、175-181和192-202aa含有潜在B细胞抗原表位。构建了重组原核表达质粒pET30a-PCV3-Cap,并在大肠埃希氏菌中表达了重组PCV3 Cap蛋白,分子质量约为32 ku,该重组蛋白以包涵体的形式存在,Western blot鉴定表明,带His标签的重组蛋白能被His单克隆抗体识别。成功克隆并原核表达了新疆株PCV3衣壳蛋白,为PCV3诊断试剂的研发奠定了基础。     

乙型脑炎病毒NS1蛋白的可溶性表达与抗原性分析

为获得可溶性表达的乙型脑炎病毒(JEV)NS1蛋白,将编码JEV SA14-14-2株NS1蛋白基因克隆至原核表达载体pMAL-c5X中,构建重组融合表达质粒pc5X-NS1;用重组质粒转化宿主菌ER2523后,经IPTG诱导得到可溶性的融合蛋白MBP-NS1;优化诱导表达条件,于28℃、0.3 mmol/L IPTG诱导4 h;最后融合蛋白经直链淀粉树脂柱纯化。结果表明:重组融合蛋白MBP-NS1具有良好的抗原性和特异性。     

致倦库蚊天蚕素CecB2基因的原核表达及蛋白纯化

构建致倦库蚊(贵阳株)天蚕素B2(CecB2)基因原核表达载体,并原核表达获得重组蛋白。定向克隆CecB2成熟肽序列至原核表达载体pET32a(+)上,将成功构建的pET32a-CecB2重组表达质粒转化大肠埃希菌Rosetta中经IPTG诱导表达,对IPTG诱导浓度和诱导时间优化后表达所得目的蛋白采用镍离子亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blot检测鉴定表达蛋白。结果表明,成功构建原核表达载体pET32a-CecB2,IPTG浓度和时间优化结果为IPTG浓度为0.05mmol/L,诱导时间为3h。SDS-PAGE检测获得大小约25ku的可溶性纯化蛋白,Western blot鉴定纯化蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生抗原抗体结合反应。说明所构建原核表达载体pET32a-CecB2能在大肠埃希菌中可溶表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

新型鹅星状病毒ORF2基因的原核表达及多克隆抗体的制备

以新型鹅星状病毒(goose astrovirus, GAstV)ORF2基因为序列设计1对特异性引物,利用PCR方法进行扩增,将其克隆到原核表达载体pET-30a中,转化DH5α感受态细胞,经酶切鉴定及测序后,获得重组质粒pET30a-ORF2。随后转化BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE和Western blot检测重组蛋白。将鉴定正确的重组蛋白纯化后免疫家兔,制备抗鹅星状病毒衣壳蛋白的多克隆抗体。结果:成功获得ORF2基因,构建的原核表达重组质粒成功表达预期的重组蛋白,大小约84 kDa,且均能与His单抗和鹅阳性血清特异反应。制备的多克隆抗体,Western blot检测能与重组蛋白发生特异性反应,间接免疫荧光试验(IFA)检测也能与新型鹅星状病毒发生特异性反应。本试验结果表明,原核表达的新型鹅星状病毒结构蛋白ORF2及制备的多抗均具有良好的免疫原性和反应原性,为新型鹅星状病毒检测方法的建立及ORF2基因功能研究奠定了基础。     

马立克氏病病毒囊膜糖蛋白Ⅰ的原核表达及多克隆抗体的制备

提取感染MDV 814A3毒株的鸡胚成纤维细胞(CEF)总基因组,利用PCR技术扩增获得gI基因.将鉴定正确的gI基因克隆至pET-32a(+),构建原核表达载体pET-gI.将诱导表达获得的gI重组蛋白免疫新西兰大白兔,产生的抗血清能够与MDV814A3病毒发生特异性反应.本试验所制备的gI重组蛋白和多克隆抗体将在MDV检测、血清学诊断等方面具有重要应用价值.     

牛星状病毒神经型与肠道型ORF2蛋白原核表达及间接ELISA的建立与初步应用

通过GenBank中登录号(神经型BufAstV-GX-NN-ORF2-14、肠道型BufAstV-GX-NN-ORF2-12)合成神经型ORF2-14-1与肠道型ORF2-12-1基因序列,运用PCR技术扩增神经型ORF2-14与肠道型ORF2-12目的片段的基因并克隆到pET-32a(+)载体,成功构建了重组质粒神经型pET-32a-ORF2-14与肠道型pET-32a-ORF2-12,经鉴定正确后转化BL21(DE3)感受态细胞中成功诱导表达,纯化后的重组蛋白利用SDS-PAGE、Western blot进行鉴定。以纯化的神经型pET-32a-ORF2-14与肠道型pET-32a-ORF2-12重组蛋白为诊断抗原,成功建立牛星状病毒(bovine astrovirus, BoAstV)神经型与肠道型的间接ELISA抗体检测方法。运用建立的间接ELISA对2019-2020年广西省部分地区采集的712份牛血清进行BoAstV抗体的检测,结果显示肠道型共检出170份抗体阳性血清,BoAstV抗体阳性率为23%;神经型共检出124份抗体阳性血清,BoAstV抗体阳性率为17%;其中,2...     

猪圆环病毒2型Cap蛋白原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化

为了表达并纯化猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV-2)Cap蛋白,试验将ORF2基因的密码子改造为大肠杆菌嗜好的密码子,但编码的氨基酸序列不变。合成优化后将ORF2基因全部基因序列,克隆于pET-30a原核表达载体并转化至大肠杆菌BL21中,经PCR和测序鉴定阳性克隆后,采用IPTG诱导表达目的蛋白。优化蛋白表达条件,采用Ni-NTA亲和层析胶纯化目的蛋白。结果表明:基因序列合成正确,无点突变。重组质粒成功转化入大肠杆菌BL21中,经诱导表达出现约37 ku的蛋白条带,与预期分子量大小一致。优化表达条件后,加入终浓度为1.2 mmol/L IPTG诱导6 h,表达产物含量最高。经Western-blot检测,能被PCV-2抗体阳性血清结合。说明成功构建了PCV-2 Cap蛋白的原核表达质粒pET-30a-ORF2,优化了表达条件并纯化出目的蛋白。     

猪细环病毒2型衣壳蛋白的原核表达及纯化

本试验通过在大肠杆菌中表达衣壳蛋白,确定最优表达条件并对其进行纯化。用PCR法扩增猪细环病毒2型（TTV2）ORF1抗原基因,定向克隆至质粒pGEX-4T-1中,获得重组质粒pGEX-4T-1-ORF1。经双酶切鉴定及测序正确后转化到BL21(DE3)工程菌中,获得衣壳蛋白大肠杆菌表达株。IPTG诱导表达,表达的重组融合蛋白经SDS-PAGE及Western blotting鉴定,并对影响重组蛋白表达的3个因素,即诱导时间、诱导温度和IPTG浓度进行优化,确定最优表达条件。重组表达质粒PCR及双酶切鉴定结果显示衣壳蛋白原核表达载体构建正确。重组融合蛋白分子质量约80 ku,主要以包涵体形式存在。37 ℃诱导5 h表达量最多,IPTG浓度对表达量无明显影响。蛋白质串联肽谱分析检测氨基酸序列与GenBank中公布的TTV2 ORF1基因序列翻译的氨基酸序列相对应,且可被鼠抗GST单克隆抗体特异性识别。该融合蛋白首次用KCl染色切胶回收法对表达的融合蛋白进行纯化,纯化效果较好,性价比高。结果表明,成功构建了pGEX-4T-1-ORF1重组质粒,衣壳蛋白得到了高效表达及纯化,为间接ELISA的建立及单克隆抗体的研制提供了抗原。     

猪细小病毒6型ORF2基因的截短表达及多克隆抗体制备

【目的】原核截短表达猪细小病毒6型(Porcine parvovirus type 6,PPV6)ORF2基因,并制备PPV6 VP1₍(348 aa-675 aa))蛋白多克隆抗体,为后续研究该蛋白的生物学功能提供材料。【方法】以PPV6分离毒株基因组为模板,PCR扩增获得ORF2截短基因片段,将其克隆至原核表达载体pET30a(+)中构建重组质粒pET30a-PPV6-ORF2。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂亲和层析纯化,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定纯化后重组蛋白。将纯化后的重组蛋白与弗氏佐剂混匀乳化,免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体,采用Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)和间接ELISA鉴定免疫兔血清特异性。【结果】成功构建了pET30a-PPV6-ORF2重组表达载体,原核截短表达了PPV6 VP1₍(348 aa-675 aa))蛋白;SDS-PAGE结果显示,重组PPV6 VP1₍     

BPV1贵州株L1基因序列分析及原核表达

为表达牛乳头瘤病毒1型贵州株(BPV1-GZLZ株)衣壳蛋白L1基因,采用PCR方法从贵州省六枝特区某规模化养牛场疑似病牛的皮肤肿瘤病料样品中扩增BPV1 L1基因,克隆至p MD19-T载体,测序后进行生物信息学分析;同时将BPV1-GZLZ株L1基因克隆于原核表达质粒p ColdⅠ中,经IPTG诱导L1蛋白表达,并对重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blotting分析。生物信息学分析显示,BPV1-GZLZ株L1基因核苷酸序列长为1488 bp,编码495个氨基酸,分子结构式为C2484H3884N678O737S16,理论等电点(PI)为8.68,二级结构主要包括α-螺旋、无规则卷曲和β-折叠为主,无跨膜结构域和信号肽; BPV1-GZLZ L1基因序列与BPV1参考株的核苷酸和氨基酸同源性均为99.8%,处在同一遗传进化分支,且与BPV13和BPV2、BPV2-GZ01的亲缘关系较近; Western blotting结果显示,经IPTG诱导的重组表达蛋白能与His单抗产生特异性反应,条带为55.6 kD左右与SDS-PAGE结果一致。研究表明,试验构建了BPV1-GZLZ株L1基因原核表达载体并成功表达。     

猪圆环病毒2型ORF2基因在Sf9细胞中表达及免疫原性研究

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达猪圆环病毒2型(PCV2)核衣壳(Cap)蛋白。将优化合成的PCV2 ORF2基因克隆到杆状病毒转移载体p Fast HTA中,并将鉴定正确的重组质粒p Fast HTA-Cap2转化至大肠杆菌感受态细胞,经蓝白斑筛选得到含有目的基因的重组杆状病毒质粒(r Bac-Cap2),转染至Sf9细胞,获得重组杆状病毒,对感染重组杆状病毒的细胞培养物进行重组蛋白的表达,进行SDS-PAGE和Western blot分析,并对表达的重组蛋白进行小鼠免疫试验及其病毒血清中和试验。SDS-PAGE分析表明,优化合成的PCV2 ORF2基因得到表达,蛋白分子质量大小为33 ku;Western blot证实重组蛋白能够识别抗PCV2阳性血清,表明重组蛋白具有反应原性;小鼠免疫试验结果显示,该蛋白能刺激机体产生特异性抗体,具有较好的免疫原性;病毒血清中和试验证实,抗PCV2 Cap血清抗体具有中和病毒的活性,中和效价为1∶42。该蛋白在杆状病毒系统中的成功表达,为PCV2感染的诊断及亚单位疫苗的研制奠定基础。     

猪繁殖与呼吸综合征、猪2型圆环病毒病二联基因疫苗的构建

将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)长春分离株的ORF5基因克隆至真核表达载体pIRES的CMV的启动子下游,并用猪二型圆环病毒的内蒙古分离株的ORF2基因替代pIRES的neo基因,构建真核表达质粒。通过West-ernblot以及IFA检测方法鉴定,所构建的重组质粒能在BHK细胞内进行有效的转录,并表达了目的蛋白。     

兔出血症病毒镇江株的分离鉴定及VP60蛋白活性表达

试验旨在分离兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)镇江株,分析其遗传进化变异,并表达具有良好活性的重组VP60蛋白。通过排除细菌感染、血凝(HA)和血凝抑制(HI)检测、动物攻毒试验与病毒传代、LD50测定等方法,自江苏省镇江市某兔场发病死亡动物肝脏组织样品中分离病原并鉴定;RT-PCR方法获得VP60基因,通过分析VP60基因核苷酸及氨基酸序列研究其遗传进化;将VP60基因与pCold-Sumo载体连接,构建低温诱导、融合Sumo标签原核表达载体,15℃、IPTG诱导表达重组VP60蛋白并对表达产物进行反应原性鉴定。结果显示,分离鉴定获得RHDV ZJ2015毒株,该毒株能凝集人"O"型红血球,HA效价为11log2,其血凝性能被RHDV(AV33)抗血清抑制,该毒株的LD50为10-6.38/mL,具有较强的毒力;RT-PCR扩增得到大小约为1 740bp的特异性条带,系统进化树分析显示,该毒株属于RHDV1抗原遗传变异株(RHDVa),与RHDV1和RHDV2VP60基因核苷酸序列同源性分别为89.4%～97.6%和81.1%～81.5%,氨基酸序列同源性分别为93.8%～98.3%和87.4%～87.6%。构建的低温原核融合表达质粒pCold-VP60在大肠杆菌Rosetta(DE3)中成功表达,通过SDS-PAGE及Western blotting分析,在分子质量74ku处有特异性表达蛋白条带,且与抗血清发生特异性抗原抗体结合反应,说明重组蛋白具有良好的反应原性。本研究为开展兔病毒性出血症流行病学研究、开发新型重组疫苗与诊断试剂提供参考依据。