鹅细小病毒VP2基因在大肠杆菌中的表达及纯化

将鹅细小病毒 (GPV) VP2基因插入原核表达载体 p PROEX- HTb,获得重组表达质粒 p PROEX- HTb- VP2。将其转化大肠杆菌 DH5α,用 IPTG诱导表达 ,表达菌体蛋白中可产生与预期大小相符的约 72 0 0 0的蛋白。以光密度扫描对该表达产物进行定量分析 ,表达产物约占菌体总蛋白的 14 %。经 His- tag金属螯合层析纯化 ,获得纯度较高的 6 His- VP2融合蛋白。 Western- blot结果表明 ,所得蛋白与鹅抗 GPV高免血清有较好的免疫反应性 ,说明在 VP2的 N端融合 6个组氨酸不影响其与特异抗体结合的活性。     

鹅细小病毒NS2基因以及VP1与VP3非重叠序列基因的真核表达

采用pBlueBacHis2A系统筛选鹅细小病毒（GPV）的检测抗原，利用PCR扩增和双酶切方法分别构建了含有NS2基因和VPl与VP3非重复序列基因的重组质粒pBlueBacHis2A-GPV-NS2、pBlueBa-cHis2A-GPV-VP（1-3），分别转染sf9细胞，得到重组病毒，分别表达出了54ku的NS2融合蛋白和24ku的VP（1-3）融合蛋白。Western-blotting和Dot-ELISA检测结果证实，表达产物具有特异性；间接免疫荧光试验证实，重组蛋白在细胞中获得了表达。     

鹅细小病毒YBLJ株VP3基因的真核表达

为了研究鹅细小病毒(GPV)YBLJ株VP3基因的生物学特性,根据已克隆的GPV YBH株VP3基因序列(GenBank:JN836326),设计并合成一对特异性引物,经PCR扩增、克隆、转化、酶切与亚克隆,构建真核表达载体pcDNA-VP3,将鉴定正确的质粒转染至Vero细胞,经RT-PCR检测VP3基因转录水平,通过间接免疫荧光试验(IFA)观察VP3基因表达水平.结果显示,克隆的VP3基因全长约1 605 bp;构建了真核表达载体pcDNA-VP3,经RT-PCR对转染细胞总RNA扩增得到特异性目的片段,IFA检测显示VP3基因在Vero细胞中获得了稳定表达.本研究为GPV核酸疫苗的研制奠定了基础.     

鹅细小病毒主要免疫原性蛋白VP3基因遗传变异及其原核表达

根据鹅细小病毒(GPV)B株全基因序列,设计并合成了1对特异性引物,采用PCR技术对GPV GD-01株的VP3基因进行扩增,将目的基因克隆到pGEM(R)-T后测序,分析了GPV GD-01株VP3基因的遗传变异情况,并进行原核表达.结果表明,GPV GD-01株VP3基因全长1605bp,编码534个氨基酸(DQ665790),与已发表的GPV、番鸭细小病毒(MDPV)的核苷酸、氨基酸同源性分别为96.15%、80.1%,97.78%、89.13%,说明GPV VP3基因具有较高的遗传稳定性.结合亲水性、表面极性、抗原位点分析比较GPV、MDPV VP3基因,为研究GPV和MDPV感染谱差异的分子机制提供了一定的理论基础.原核表达显示,VP3蛋白的最高表达量占整个菌体蛋白含量的29.9%,经表达条件优化可产生大量可溶性VP3表达蛋白.SDS-PAGE与Western-blot分析显示,表达的VP3蛋白的相对分子质量约60000,并能与鼠抗GPV阳性血清反应,证明具有一定的反应原性,为进一步研制基因工程疫苗及诊断制品奠定了基础.     

鹅细小病毒SS/10株VP3蛋白的原核表达及鉴定

根据GenBank收录的鹅细小病毒(GPV)基因序列,设计并合成了一对VP3基因扩增引物。采用PCR技术对SS/10株的VP3基因进行扩增,将目的基因和原核表达载体PET-32a分别经HindⅢ和BamHⅠ双酶切后进行连接,获得重组质粒PET-32a-VP3,并将其转化表达菌BL21(DE3)pLysS。经IPTG诱导,SDS-PAGE分析,结果获得了72ku左右的融合蛋白,大部分以包涵体的形式存在于菌体中。Wesern blot结果表明,该蛋白能与GPV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。     

鹅细小病毒主要结构蛋白基因的扩增、克隆与原核表达载体的构建

根据已发表的鹅细不病毒（GPV）核苷酸序列设计并合成了1对引物,对GPV主要结构蛋白VP2和VP3基因进行扩增。所获得的PCR产物与预期片段大小相符,约1.8kb。将该片段直接与真核表达pCR3.1T载体连接,转化人感受态大肠杆菌TOP10F＇中增值。在对所提质粒进行快速鉴定、PCR扩增以及BamH I酶切线性化初步鉴定的基础上,经限制性内切酶Sca I 和EcoR V分别酶切进行正反向鉴定,获得了3个正向插入的克隆（PVPA）和2个反向插入的克隆（PVPB）。将正向插入的克隆PVPA1与原核表达载体pET-28b（ ）分别用BamH I和Xho I双酶切后,回收目的片段进行定向连接,并转化入感受态大肠杆菌DH5a中。对所获得的重组质粒分别经Sca I、EcoR V、BamH I/Xho I酶切,证实含有目的基因,且基因插入方向正确,成功地构建了含有GPV主要结构蛋白基因的原核表达载体,为高效原核表达以及研制更为有效的基因工程疫苗打下了基础。     

猪细小病毒VP2基因的克隆、测序与原核表达

利用PCR技术从猪细小病毒的RF DNA模板中扩增了含有VP2全基因的2.0kb的基因片段，将PCR产物克隆至pMD18-T载体，利用双脱氧末端终止法测定了VP2全基因的核苷酸序列。将所得的核心苷酸序列和推导的氨基酸序列分别与GenBank中的相应序列进行同源性比较，同源性均在99%以上，从而说明该蛋白的碱基序列和氨基酸序列均具有高度的保守性。将VP2全基因分别克隆入原核表达载体pET15(b)、pET17(b)和pET28(b)构建成表达质粒pET15bVP2、pET17bVP2和pET28bVP2；将含有VP2基因起始位点至EcoRⅠ切点间的0.8kb片段克隆入pET17(b)中构建成表达质粒pET17bVP2f。利用上述四种质粒转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导后SDS-PAGE检测表达情况，结果发现pET17bVP2f质粒在45kD处有一特异性表达带，而其它几种质粒均未看到特异性表达带，推测VP2基因3‘端的某些结构可能对VP2全基因的表达有一定影响。这一结果对研究VP2基因的结构与功能具有重要意义。     

鹅细小病毒NS2基因的原核表达及抗原性检测

为原核表达鹅细小病毒(GPV)NS2蛋白,本研究利用特异性引物扩增获得GPV的H1分离株NS2基因,将其克隆于pMD18-T载体后进行序列测定。并将NS2基因亚克隆于原核表达载体pGEX-6P-1中,获得重组质粒pGEX-NS2。该质粒转化于感受态菌BL21(DE3)plysS中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析,表达的重组蛋白约为75ku左右。经过亲和层析方法获得了纯化的重组NS2蛋白。Westernblot和Dot-ELISA鉴定结果表明,表达的重组NS2蛋白可以与GPV阳性血清发生特异性反应。     

猪细小病毒PPV-SD1株VP2全基因的克隆及原核表达

为研究猪细小病毒PPV-SD1分离株的VP2蛋白的结构与功能,自行设计引物,通过PCR扩增的方法,获得VP2全基因,克隆到pMD18-T载体中进行测序,然后亚克隆到pET30a(+)表达载体中,构建并筛选出阳性重组子,标记为pET30a-VP2。将阳性重组质粒转化进RosettaTM宿主菌中,通过改变IPTG浓度、诱导温度和诱导时间,使重组蛋白获得表达,并确定最佳诱导条件为:IPTG终浓度1.0 mmol/L、诱导温度37℃、诱导时间为3~4 h。经SDS-PAGE和Western-blotting分析表明该重组蛋白相对分子量约为68 ku,具有良好的免疫学活性。     

犬细小病毒VP2基因克隆及原核表达分析

试验旨在了解河北与甘肃地区犬细小病毒流行情况,并通过原核表达系统获得犬细小病毒VP2蛋白,制备该蛋白的多克隆抗体,为进一步研究犬细小病毒致病机理和治疗方法奠定基础。从10份疑似感染犬细小病毒犬的病料中提取病毒基因组DNA,并以其作为模板进行VP2基因的PCR扩增,将目的片段进行测序和分析后克隆至原核表达载体pET-30a中,阳性质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并诱导表达,诱导产物经SDS-PAGE鉴定表达后切割目的蛋白条带免疫豚鼠制备多克隆抗体。序列分析结果显示成功克隆VP2基因,10株分离株中CPV-2a型占80%,CPV-2b型占20%。本试验检测的毒株与部分中国毒株形成了一个分支,与韩国、美国分离株呈现一定差异,与意大利分离株同源性较低。Western blotting分析证实了通过原核表达系统成功获得的大小为70 ku左右的重组蛋白具有反应原性和免疫原性。该试验初步表明河北与甘肃地区以CPV-2a型为主,原核表达的VP2蛋白具有良好的抗原性,本试验结果为犬细小病毒的防控提供科学依据。     

鹅细小病毒VP3基因重组禽痘病毒转移载体的构建

从含有鹅细小病毒（GPV）H1株主要结构蛋白VP3基因的重组质粒pPROEX HTb-VP3中切取GPV H1株VP3基因片段，将其亚克隆于pSY538的EcoRI位点，并将带有痘苗病毒启动子P11的LacZ报告基因平端克隆于上述重组子的SmaI位点，再用Not I切下同时含有VP3基因和LacZ报告基因的片段，亚克隆于pSY681的NotI位点，构建了含有VP3基因的重组禽痘病毒转移载体。上述结果为GPV基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

口蹄疫病毒VP2基因的真核表达及其产物抗原性的检测

利用PCR技术，扩增出口蹄疫病毒（FMDV）VP2基因，并克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A上。用重组质粒pB-VP2与重组病毒同时转染sf9昆虫细胞，获得了重组病毒。经过蚀斑筛选纯化后，感染sf9细胞，表达VP2融合蛋白，分子质量为33ku左右。以牛抗O型FMDV血清为第一抗体，通过Western-blotting和Dot-ELISA鉴定，说明VP2基因在真核表达系统中获得正确表达，且可以与牛抗。型FMDV血清发生特异性反应。     

轮状病毒VP4基因和VP7基因原核表达载体的构建及表达

经PCR从含有VP4基因、VP7基因片段的重组质粒pT-VP4和pT-VP7中护增VP4、VP7基因，连接至pGEM-5zf( )。经筛选和鉴定正确后同时酶切目的基因和表达质粒pET-28a( )，连接、转化受体菌，经PCR、酶切和序列分析证明，连接向位和阅读框架是正确的，从而构建了轮状病毒保护性抗原VP4基因、VP7基因片段的原核表达载体pET28a-VP4、pET28a-VP7。重组质粒转化表达菌在IPTG诱导下，用SDS-PAGE、薄层凝胶扫描分析表达的蛋白。结果表明，表达的目的蛋白以包涵体的形式存在，蛋白的分子量分别为37.69和36.20ku，表达量占菌体总蛋白的比例分别为17.1%和14.4%。     

鹅细小病毒NS1基因的克隆及原核表达

本研究根据GenBank发表的GPVB株全基因核苷酸序列，设计了1对用以扩增GPV主要非结构蛋白NS1基因的引物。通过PCR技术，扩增出NS1完整基因片段1．9kb。将PCR产物克隆到pMD18-T载体后进行序列测定及分析，结果表明：GPV H1株NS1基因全长1884bp，编码627个氨基酸，与国外已发表的B株核苷酸序列同源性为98．15％。同时将该目的基因正向插入到GST融合蛋白原核表达载体PGEX-6P-1的BamH1多克隆位点，构建了GPV NS1的原核表达载体，成功的表达了约97KD的NS1融合蛋白。     

犬细小病毒VP2蛋白的原核表达与纯化

为了研究犬细小病毒（canine parovirus,CPV）VP2蛋白的结构和功能,本试验对CPV VP2蛋白进行表达和纯化。采用大肠杆菌表达外源蛋白的方法,将CPV VP2基因插入原核表达载体pET-32a（+）中构建重组原核表达载体pET-VP2,转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,在不同IPTG浓度、诱导温度和诱导时间条件下进行原核表达,确定最佳诱导条件。最佳条件下的诱导产物经超声破碎离心后,利用镍柱对重组蛋白进行纯化并用SDS-PAGE和Western blotting进行双重鉴定。结果显示,重组质粒pET-VP2经双酶切鉴定分别获得大小为5 900 bp左右的载体条带和1 755 bp左右的目的基因条带,成功构建了pET-VP2重组质粒;重组VP2蛋白的分子质量约为64 ku,与预期大小一致,且在37℃、1.0 mmol/L IPTG、诱导5 h条件下表达量最高,条带最亮;蛋白超声破碎后经SDS-PAGE发现,只在沉淀中出现了目的条带,而上清中并未出现相应条带,说明重组蛋白均以包涵体的形式存在;纯化后获得的重组蛋白,经SDS-PAGE和Western blotting双重鉴定,均在64 ku处出现条带,说明纯化后的蛋白为重组蛋白pET-VP2。本试验通过对CPV VP2蛋白的原核表达及纯化成功获得了大量纯度较高的CPV VP2蛋白,为今后制备CPV VP2蛋白多克隆抗体及进一步研究该蛋白在对治疗犬细小病毒病中的临床应用价值提供了基础理论依据。     

鹅细小病毒VP3基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

为真核表达鹅细小病毒（GPV）融合蛋白VP3基因,本研究通过PCR扩增GPV FY89株VP3基因,并将其克隆至杆状病毒转移载体pFastBac/HBM-TOPO中,经双酶切、PCR及测序鉴定正确后,转化感受态细胞DH10Bac,提取重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-VP3,将经PCR鉴定正确的rBacmid-VP3转染Sf9昆虫细胞,连续传代后,细胞病变明显。SDS-PAGE分析结果表明成功表达了分子质量约为61 ku的VP3蛋白;Western blotting分析结果表明重组VP3蛋白具有良好的抗原性。     

鹅细小病毒H1株VP2基因的克隆和序列分析

参考GenBank发表的鹅细小病毒(GPV)B株全基因序列，设计并合成一对引物，采用PCR方法对国内鹅细小病毒分离株H1(GPV-H1)株的结构蛋白VP2基因进行扩增，将扩增产物与pMD18-T载体连接并测序。结果表明：H1株VP2的核苷酸序列全长1764bp，编码587个氨基酸，与GenBarrk发表的GPV-B株、GPV-SHM株、GPV-YG株、番鸭细小病毒(MDPV)FRANCE株、FM株的VP2相比，核苷酸同源率分别为98．6％、96．2％、93．2％、80．3％、80．0％，推导氨基酸序列同源率分别为98．3％、97．5％、96．1％、88．2％、87．4％。     

番鸭细小病毒NS2原核表达载体的构建

根据已发表的番鸭细小病毒(MDPV)核苷酸序列设计并合成1对引物,对MDPV非结构蛋白NS2基因进行扩增。所获得的PCR产物与预期片段大小相符,约1.4 kb。将该片段直接与pMD18-T载体连接,转化入感受态大肠杆菌DH5α中增殖。在对所提质粒进行快速鉴定、PCR扩增及BamH I酶切线性化初步鉴定的基础上,经限制性内切酶BamH I和Sal I进行双酶切鉴定。将克隆产物pMD18-T-NS2与原核表达载体pET-32a分别用BamH I和SalI双酶切后,回收目的片段进行定向连接,并转化入感受态大肠杆菌DH5α中。对所获得的重组质粒分别经BamH I单酶切、BamH I和Sal I双酶切,证实含有目的基因,且基因插入方向正确,成功构建了含有MDPV NS2非结构蛋白基因的原核表达载体,为高效原核表达及研制更为有效的基因工程疫苗打下了基础。     

鹅细小病毒VP1与VP3非重叠序列的克隆与原核表达

根据鹅细小病毒GPVH1株基因组核苷酸序列设计了一对引物，对其结构蛋白VP1与VP3非重叠核苷酸序列进行PCR扩增，并克隆到表达性载体pGEX-6p-1，经酶切鉴定筛选出阳性克隆，并转化到大肠杆菌BL21(ED3)plysS进行原核表达，并用SDS—PAGE鉴定，结果表明融合蛋白在表达性细菌BL21中重获得了高效表达。     

水貂肠炎病毒VP2基因原核表达及鉴定

采用PCR技术扩增MEV VP2基因,将该基因片段定向克隆原核表达载体PET-30a,构建MEV VP2基因原核表达重组质粒PET-30a-VP2。将该重组质粒转化到宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导后进行SDSPAGE和Western-blotting分析。结果表明:该基因全长1 755 bp,其目的基因序列完全正确,能编码584个氨基酸。利用载体上的His标签对其进行纯化,经SDS-PAGE鉴定该重组蛋白以包涵体的形式存在,大小约为70 ku;Western-blotting验证该重组蛋白具有被抗MEV血清识别的特性,具有良好的反应原性,可为MEV基因工程亚单位疫苗、免疫学诊断方法等提供参考。