A3启动子缺陷piggyBac转座子在家蚕中的转基因研究

构建了A3启动子缺陷piggyBac转座质粒,以增强型绿色荧光蛋白基因EGFP为标记基因对家蚕品种N is-tari进行转基因实验,发现其具有较高的表达EGFP的转化效率,G0代中EGFP阳性蛾区检出占总注射蚕卵的比率达0.618%,且EGFP的表达呈组织特异性。PCR实验分析也证实了标记基因的成功导入。该实验中标记基因及转基因阳性个体均易于检出,为启动子缺陷转基因方法在家蚕组织特异性启动子筛选研究上的应用奠定了基础。     

利用非转座子载体介导的转基因家蚕表达人胰岛素样生长因子Ⅰ

为了实现利用非转座子载体介导的转基因家蚕整体表达人胰岛素样生长因子Ⅰ(hIGF-Ⅰ),将hIGF-Ⅰ基因克隆进非转座子类型的昆虫细胞表达载体pIZT/V5-His,构建转基因载体pIZT/V5-His-hIGF-Ⅰ。利用精子介导法将该转基因载体导入家蚕卵,通过绿色荧光筛选并结合PCR和Dot blotting检测鉴定,表明已成功获得hIGF-Ⅰ转基因家蚕。对培育至G2代的转基因家蚕5龄幼虫蛋白质样品进行Western blotting分析,结果显示hIGF-Ⅰ在转基因家蚕中获得表达,重组hIGF-Ⅰ的分子质量约12.5 kD;ELISA检测hIGF-Ⅰ在G2代转基因家蚕5龄幼虫全蚕以及后部丝腺、脂肪体冻干粉中的质量比分别为65、411、469 ng/g。试验结果再次证实通过非转座子载体pIZT/V5-His介导可以将外源基因导入家蚕基因组,并实现外源基因在转基因家蚕中整体表达。     

表达短lef-1dsRNA转基因家蚕对BmNPV的抵抗能力与主要经济性状

为了提高家蚕对核型多角体病毒(BmNPV)的抵抗能力,将带有BmNPV晚期表达因子基因(lef-1)dsRNA表达盒和新霉素抗性基因(neo)表达盒的转基因载体pigA3-LEF-Neo通过精子介导法导入家蚕卵,经G418和GFP双重筛选并结合分子生物学鉴定,证实获得了转基因家蚕。对G6代转基因家蚕2龄幼虫接种BmNPV,结果显示转基因家蚕的死亡率比正常家蚕(对照组)下降了10～30个百分点,表明转基因家蚕对BmNPV的抗性有所提高;对接种BmNPV的5龄转基因家蚕A、B系统的定量PCR检测结果显示,2个系统体内的lef-1 mRNA转录水平比对照组平均降低了72倍和26.5倍,最高下降了104倍,进一步表明表达lef-1 dsRNA的转基因家蚕抑制了BmNPV lef-1基因的表达。转基因家蚕的饲养成绩显示其全茧量、茧层量和茧层率等主要经济性状与正常家蚕无明显差异。     

牛FABP3转基因小鼠的遗传及表达特性研究

旨在研究和分析牛FABP3基因在小鼠体内遗传和表达特性,对培育优质高产转基因肉牛新品种具有重要意义。本研究利用前期获得的4只FABP3转基因小鼠,通过制定的4组交配方案获得子代小鼠,并利用PCR、实时荧光定量PCR和组织原位表达技术对转基因牛FABP3基因小鼠的子代遗传特征,以及FABP3基因在G0代和G1代小鼠心、肝、肾、骨骼肌组织的表达情况进行了检测。RT-PCR检测结果表明,在G0代转基因小鼠中,牛FABP3基因能够表达;牛FABP3基因在转基因小鼠中可以遗传,G1代转基因小鼠平均阳性率达68.4%;相对定量PCR结果表明,转基因小鼠总FABP3基因在G1代小鼠心肌和骨骼肌中表达量相对于阴性个体有不同程度的增加;组织原位检测表明,在G0代个体中表达量较高,G1代个体中虽能看到绿色荧光,但略有降低。本研究表明,牛FABP3基因存在于小鼠基因组中,并能够被表达,且可以遗传给后代,这为后期进一步研究牛FABP3基因对小鼠骨骼肌脂肪含量的影响奠定坚实基础。     

表达Ⅰ型类人胶原蛋白和脯氨酰4-羟化酶α-蛋白的转基因家蚕品系构建

家蚕丝腺具有高效合成与分泌蚕丝蛋白质的能力,探究利用转基因方法开发家蚕丝腺为生物反应器生产高附加值外源蛋白质的技术途径。将Ⅰ型类人胶原蛋白基因(HCool-Ⅰ)和胶原蛋白羟基化修饰所必需的脯氨酰4-羟化酶α-亚基基因(BmP 4Hα)通过piggyB ac转座子及显微注射方法,同时转入家蚕早期胚胎,在丝素轻链基因fib-L启动子驱动下转入的2个外源基因在家蚕幼虫后部丝腺获得表达。利用反向PCR和生物信息学等方法鉴定、分析转基因家蚕基因组中有19个外源piggyB ac的整合位点,分别位于基因的外显子区域、内含子区域和基因间区,可定位至家蚕的15条染色体上。实时荧光定量PCR检测不同整合位点的转基因家蚕品系幼虫后部丝腺中HCool-Ⅰ基因mRNA转录量存在极显著差异,转录量最高和最低的品系间相差23倍左右;转基因家蚕后部丝腺中BmP 4Hα基因mRNA的转录量比野生型家蚕高出2万多倍。利用SDS-PAGE检测转基因家蚕G3代5龄5 d幼虫的后部丝腺总蛋白质在55 kD和64 kD处分别存在特异性蛋白条带,表明BmP 4Hα和HCool-Ⅰ蛋白已在G3代转基因家蚕丝腺中获得表达。     

BmLSP基因启动子驱动DsRed在转基因家蚕中的表达分析

家蚕幼虫血清蛋白(BmLSP)是由脂肪体细胞合成的一种贮藏蛋白,是研究家蚕幼虫期发育调控的理想靶标。基于家蚕基因组数据,克隆了BmLSP基因5'端侧翼区～1.6 kb的调控序列,构建成以红色荧光蛋白基因DsRed为报告基因的pig-gyBac表达载体并进行转基因注射,在个体水平上验证该启动子的特性。结果表明:BmLSP-DsRed表达框以单拷贝形式整合至家蚕基因组;DsRed在转基因家蚕脂肪体中特异转录表达,其时期表达特征与BmLSP基因基本一致,随发育阶段的不同呈现有规律的变化,即幼虫期表达,但1龄、2龄眠期不表达,3龄、4龄眠期有微弱表达,上蔟后表达量逐渐降低直至化蛾阶段消失。提示BmLSP可能通过其启动子区的特异元件受激素的精确调控而行使功能。     

家蚕雌特异剪接体dsxF2的转基因品系建立及功能分析

家蚕双性基因dsx通过选择性剪接产生性别特异剪接体而影响体细胞性别发育,之前对Bmdsx进行c DNA末端快速扩增(RACE)分析时获得一个雌特异剪接体Bmdsx~(F2)。为揭示Bmdsx~(F2)的生物学功能,构建由A4启动子驱动Bmdsx~(F2)表达的转基因异位表达载体,通过显微注射和荧光筛选,获得2个Bmdsx~(F2)转基因品系L1和L2。RT-PCR结果显示Bmdsx~(F2)在2个转基因品系雄蚕中都成功异位表达;连续6代观察都未发现L1和L2的个体发育表型异常;W染色体特异性PCR检测表明所有转基因雌性个体的染色体组型都为ZW型,没有ZZ型;连续6代调查L1和L2的个体性别比例都遵循1∶1的正常比例;实时荧光定量PCR检测在2个转基因品系雄性个体中,Bmdsx~(F2)的下游靶基因SP1和Vg都明显上调表达,而PBP的表达则明显下调,表明雌特异剪接体Bmdsx~(F2)能够调控Bmdsx下游靶基因的表达,暗示Bmdsx~(F2)同样可参与家蚕体细胞性别发育调控。     

亚热带型EGFP荧光绿茧转基区家蚕品系杂交组配试验

为探索EGFP荧光绿茧转基因家蚕品系与常规品种进行杂交时,其F1代的EGFP外源基因在杂交过程中的表达量和稳定性,笔者利用创新育成的亚热带型EGFP荧光绿茧转基因家蚕品系进行杂交组配测试。结果表明：转EGFP家蚕品系与常规白茧品种杂交,外源基因的表达情况有差异,造成绿茧比率各不一样;但利用已经纯合、外源基因表达量高的转EGFP家蚕新品系进行品系间二元杂交,其F1绿茧率高达100％;与常规白茧品种进行二元杂交测试,其F1代绿茧率高达90％以上;与常规白茧品种进行三元杂交测试,其F1代大多组合的绿茧率达到75％以上;测试杂交组合的结茧率、全茧量及茧层率等主要经济性状与两广二号相仿。     

重离子射线辐照家蚕生殖腺诱发后代幼虫斑纹突变

为解明高能重离子射线辐照家蚕生殖腺所产生的突变效应,以不同剂量的12C^5+射线分别辐照家蚕幼虫不同发育时期、不同性别的生殖腺部位,以次代幼虫斑纹突变为依据鉴定辐照后代的突变率。结果显示,高能12C^5+射线辐照家蚕幼虫生殖腺部位,可以高效诱发后代突变,对于同一发育阶段的幼虫,在1~9 Gy剂量范围内,造卵数及产卵数随幅照剂量增加而减少,而后代斑纹突变率在1~5 Gy剂量范围内随辐照剂量增加而升高;与熟蚕相比,4龄第3天幼虫辐照后诱发的后代突变率较高;家蚕幼虫辐照后诱发的突变率存在性别差异,雄性的突变率高于雌性。结果表明,对家蚕生殖腺部位进行重离子射线辐照是获得家蚕突变体的有效方法。     

家蚕vasa基因的结构及表达型研究

vasa是决定生殖系发育的重要调控蛋白因子之一,具有广泛的保守性。利用家蚕基因组和EST库的数据资源,分析了家蚕vasa基因的结构,并与已有报道的18个物种的VASA蛋白质的结构域序列进行了比对分析,同时对家蚕vasa基因在家蚕胚胎发育11个时期的表达型及幼虫期8个不同组织的表达特异性进行了验证。结果表明,家蚕vasa基因包含有13个外显子,比果蝇vasa基因的外显子数量(7个)增加了6个,在第3内含子有1个转座子插入;家蚕vasa基因在未受精卵和胚胎发育的各个时期均有表达,但只在幼虫生殖腺中有表达。将家蚕vasa基因的一条cDNA片段用地高辛标记作为探针,对家蚕幼虫的生殖腺及胚胎进行全胚原位杂交,结果进一步表明家蚕vasa基因在幼虫期只在精原细胞、精囊、卵巢管等生殖系相关的细胞和组织中表达,在发育5d胚胎的生殖腺部位也有明显表达。     

家蚕精子介导转基因技术体系的优化

为了构建高效的家蚕转基因技术,对采用piggyBac转座载体的家蚕精子介导转基因的主要技术参数进行优化,结果表明外源DNA的稀释剂和注射方式对导入效率影响较大,G0代未整合的外源DNA在5龄期前基本被降解破坏。推荐的家蚕精子介导基因转移技术方案为:处女蛾交尾囊注射6～8μL以0.1×TE稀释的2 g/Lpig-gyBac转座子载体DNA后正常交配产卵,根据G0代5龄期及蛾期PCR检测标记基因为阳性的蛾区自交,G1代阳性个体自交以获得纯合后代。     

家蚕具有CHCH结构域的蛋白家族基因BmCH的原核表达和亚细胞定位

含有CHCH保守结构域的蛋白在不同物种中行使不同的功能。从家蚕蛹cDNA文库筛选获得一条cDNA序列,经生物信息学分析发现其编码蛋白含有一个CHCH保守结构域,将该基因命名为BmCH(GenBank登录号:DQ443425.1)。该序列开放阅读框大小为435 bp,编码144个氨基酸残基。将成功构建的重组质粒pET-28a(+)-BmCH转化到E.coli Rosetta(DE3)菌株,经IPTG诱导表达BmCH融合蛋白,用亲和层析进行纯化后,将融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。通过Westernblotting检测BmCH在家蚕4个发育时期和5龄幼虫组织中的表达情况与用荧光定量PCR检测BmCH在家蚕不同发育时期及5龄幼虫组织中的转录结果基本一致:该蛋白在卵、幼虫、蛹、蛾4个发育时期均有表达,其中在5龄幼虫期的表达量最高;该蛋白在5龄幼虫的表皮、精巢、中肠、丝腺和卵巢中有明显表达,在血淋巴、马氏管、脂肪体中的表达量较少,但差异不大,而在气管和头部没有表达。利用抗体的免疫荧光标记对BmCH在家蚕BmN细胞中的定位进行研究,观察到该蛋白主要分布在细胞质中。初步推测BmCH可能是家蚕生长发育的必需蛋白,参与多种细胞生命活动的过程。     

家蚕模式识别受体PGRP、βGRP编码基因的克隆鉴定及表达谱分析

模式识别受体(PRR)是生物体先天免疫系统中免疫受体的代表,对生物体的生存极为重要。克隆鉴定了家蚕的14个模式识别受体编码基因,包括10个肽聚糖识别蛋白(PGRP)基因和4个β-葡聚糖识别蛋白(βGRP)基因,并得到了BmPGRP-S3、BmPGRP-S4和BmPGRP-L5的完整编码序列。家蚕PGRP的长型和短型亚家族都具有典型的酰胺酶活性结构域,短型亚家族具有信号肽,长型亚家族则没有信号肽。5个PGRP长型亚家族基因成簇分布于第1号染色体;5个PGRP短型亚家族基因中有2个分布于第9号染色体,有3个分布于第16号染色体。家蚕βGRP家族成员都具有信号肽,其中BmβGRP1-3成簇分布于第11号染色体,编码蛋白不具有典型的葡聚糖结合结构域;BmβGRP4独立分布于第22号染色体,编码蛋白具有典型的葡聚糖结合结构域。基因芯片数据分析表明,BmPGRP-L5和BmβGRP1在5龄第3天幼虫各组织中没有表达,其余12个模式识别受体基因为多组织表达,但在丝腺组织中均无表达。在这12个模式识别受体基因中,BmPGRP-L3等6个模式识别受体基因在中肠组织中的表达水平偏高;BmβGRP3、BmβGRP4和BmPGRP-L3、BmPGRP-L4等在家蚕生殖腺中的表达水平较高。在生殖腺以外的其他各组织中,这12个基因的表达不具有雌雄差异性。BmβGRP1在家蚕各发育时期没有表达,BmPGRP-L5主要在变态发育的转折期表达,其余12个模式识别受体基因在各发育时期均有表达,并从5龄第3天幼虫到上蔟第2天有较高水平的表达,雌雄个体间无表达差异性。由此说明这些模式识别受体基因的表达具有一定的组织性和发育时期性。给人工饲料无菌饲养的家蚕5龄第3天幼虫分别添食大肠杆菌、家蚕黑胸败血菌和家蚕白僵菌,对免疫诱导3、6、12和24h的家蚕进行个体水平的实时荧光定量PCR检测,发现PGRP长型亚家族基因BmPGRP-L1、BmPGRP-L3和短型亚家族基因BmPGRP-S1-3均能被这3种微生物诱导上调表达;βGRP基因家族中的BmβGRP3、BmβGRP4也能被3种微生物诱导上调表达。同时对诱导12h时家蚕各组织中14个家蚕模式识别受体基因的表达谱进行分析,结果显示经3种微生物分别诱导后,家蚕头部组织中BmβGRP2、BmβGRP4、BmPGRP-L2和BmPGRP-S1、BmPGRP-S3-5均上调表达;表皮、中肠和脂肪体中仅有BmβGRP3、BmPGRP-L4等少数模式识别受体基因上调表达。     

家蚕翅原基发育关联基因BmHMGS的鉴定与表达特征分析

家蚕幼虫的翅原基最终发育为成虫的翅,翅原基发育与家蚕的变态发育紧密关联。为了研究激素作用下家蚕翅原基发育的分子调控机制,以经过蜕皮激素20E体外诱导培养和未经诱导培养的家蚕5龄幼虫翅原基为材料分别提取总蛋白质,利用Shotgun质谱分析在20E诱导组的翅原基中获得132种差异蛋白,在未经20E诱导组的翅原基中获得76种差异蛋白。进一步通过生物信息学技术及GO分类法在20E诱导组的翅原基的差异蛋白中,筛选到1个具有生物调节作用的酶类蛋白基因Bm HMGS作为翅原基发育相关的候选基因,设计引物并以上蔟1 d的蚕体翅原基总RNA反转录得到的c DNA为模板,克隆了该基因。通过qRT-PCR检测到Bm HMGS基因在幼虫5龄1 d、上蔟3 d、蛹期1 d蚕体内的表达量较高,其中在上蔟3 d的表达量达到峰值。构建重组载体进行Bm HMGS的原核表达并制备抗体后,采用Western blot技术在5龄1~7 d和上蔟1~3 d的蚕体翅原基、脂肪体中及上蔟1~3 d的生殖腺中都可以检测到Bm HMGS的表达,并且在翅原基中的表达没有发育时期特异性。研究结果表明,从20E诱导组的家蚕翅原基中鉴定的Bm HMGS与翅原基发育相关,其表达在5龄至上蔟阶段没有时期和组织的特异性,推测Bm HMGS是一个具有多种生物学功能的基因。     

基于piggyBac转座子转hGM-CSF基因家蚕的研究

将由家蚕核型多角体病毒IE-1基因启动子控制下的hGM-CSF基因克隆到p igA3GFP载体中,构建了家蚕转基因载体p igA3GFP[IE-GMCSF],利用压力渗透法和精子介导法将其与辅助质粒helper p igA3一起导入家蚕蚕卵,获得产生绿色荧光的家蚕,次代产生荧光蚕的比例分别为0.17%,0.15%。将次代荧光蚕与正常蚕交配后代(G1)的荧光蚕个体再相互杂交,连续进行多代选育,获得了稳定遗传的转hGM-CSF基因家蚕品系。     

干涉BmNPV极早期非必需基因ie-2的转基因家蚕系统构建和抗性检测

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)是严重危害家蚕的病原之一。为了探究通过转基因干涉BmNPV非必需基因抑制病毒的增殖,提高家蚕抗性的可行性,选择BmNPV极早期非必需基因ie-2作为靶标,构建转基因干涉载体,通过显微注射获得转基因家蚕系统A4Pie2H-A和A4Pie2H-B。3龄幼虫添食感染BmNPV后,A4Pie2H-A与A4Pie2H-B的幼虫死亡率分别比非转基因对照品种降低19%和24%;定量PCR结果显示A4Pie2H-A与A4Pie2H-B的幼虫体内的ie-2 mRNA表达量分别为非转基因对照品种的50%和20%,病毒DNA含量分别为非转基因对照品种的32%和12%。此外,2个转基因家蚕系统的全茧量和茧层率与正常家蚕品种比较无显著差异。研究结果表明,干涉BmNPV极早期非必需基因ie-2可以显著抑制转基因家蚕体内病毒的复制增殖,使幼虫死亡率降低。     

家蚕山梨醇脱氢酶基因的转录水平特性分析

为了探究家蚕山梨醇脱氢酶基因（BmSDH）在家蚕各发育时期和组织的转录水平,根据家蚕二化性品种子代滞育性受亲代胚胎期催青条件调控的原理,利用半定量RT-PCR分析25.0℃常温明催青和17.5℃低温暗催青对家蚕品种“秋丰”各发育时期蚕体和组织中BmSDH转录水平的影响.结果显示,BmSDH-1、BmSDH-2a和BmS-DH-2b在家蚕的各个发育阶段均有表达：在幼虫期5龄3d,BmSDH-1在常温明催青组脂肪体中转录水平较高;BmSDH-2a和BmSDH-2b在常温明催青条件下的血液、脂肪体和卵巢中转录水平均高于低温暗催青;在蛹期3d,BmSDH-2a和BmSDH-2b在常温明催青条件下血液和卵巢中的转录水平均低于低温暗催青;在次代卵产下后6～24h期间,BmSDH-2a和BmSDH-2b的转录水平逐渐升高.因此,BmSDH-1和蚕卵滞育与否没有直接关系,而BmSDH-2a和BmSDH-2b与家蚕二化性品种卵滞育与否有重要的平行关系,为从分子水平阐明家蚕滞育的分子机制积累了试验数据.     

人脑源性神经营养因子基因(hBDNF)在转基因家蚕丝腺中的特异表达

家蚕丝腺具有强大合成与分泌蛋白质的能力,利用其作为生物反应器生产高附加值外源蛋白有着广阔的市场前景。以人血白细胞基因组DNA为模板,扩增并克隆了人脑源性神经营养因子基因(hBDNF)核苷酸序列。序列分析表明,克隆的hBDNF核苷酸序列与已发表序列(GenBank登录号:NM_170735)的同源性为100%。随后采用家蚕丝胶基因(Ser1)启动子,以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为筛选标记,将hBDNF构建到piggyBac转座表达载体并注射入家蚕早期胚胎,在G1代筛选获得了54头转基因阳性个体。经分子检测证实,hBDNF已整合到家蚕基因组并在丝腺有较高水平的特异表达。     

催青温度对家蚕二化性品种丙酮酸脱氢酶激酶基因(BmPDK)表达的影响

丙酮酸脱氢酶激酶(PDK)在生物体的新陈代谢中具有重要的生理功能。为了探讨家蚕(Bombyx mori)PDK基因的表达特性,用蛾区半分法将二化性家蚕品种的活化越年卵(丙2期)分别以常温(25℃)光照和低温(15℃)黑暗催青,通过实时荧光定量PCR技术检测分析2种温度催青处理后家蚕不同发育阶段和不同组织的BmPDK表达水平。常温光照催青区BmP-DK的表达水平表现出发育时期和组织差异:胚胎发育阶段BmPDK在己4期的表达水平最高,其次是戊2、己3和己5期;幼虫发育阶段BmPDK的表达水平在蚁蚕期极显著高于其它龄期,5龄期在卵巢和精巢的表达水平高于其它组织;蛹期BmPDK的表达水平比其它发育时期低;成虫期的表达水平与胚胎发育末期相当,其中雌蛾的脂肪体和卵巢中BmPDK的表达水平较高。推测BmPDK在家蚕胚胎发育末期及产卵过程中有重要作用。催青温度影响BmPDK在家蚕各发育时期及卵巢组织中的表达水平:胚胎发育阶段戊2期BmPDK的表达水平为常温催青区显著高于低温催青区,己3～己5期常温催青区BmPDK的表达呈低-高-低的趋势,而低温催青区则呈上升趋势;蚁蚕期BmPDK表达水平为低温催青区极显著低于常温催青区;蛹期和成虫期卵巢中,常温催青区BmPDK的表达水平极显著高于低温催青区。催青温度对二化性家蚕BmPDK的表达的影响主要出现在胚胎戊2期、胚胎己3期～蚁蚕期、蛹期、成虫期。     

DNMTs基因在苏博美利奴羊皮肤毛囊发育不同时期的表达分析

为探讨DNMT1、DNMT3a、DNMT3b基因在苏博美利奴羊皮肤毛囊不同发育时期中mRNA的表达规律,本研究选取2～3岁经产母羊,同期发情并使用同一种公羊精液进行配种,采集胚胎期65 d、85 d、105 d、135d和出生后7d、30d(分别记为G1、G2、G3、G4、G5、G6期)胎儿的皮肤组织,采用qRT-PCR检测皮肤组织中DNMTs的mRNA水平。结果表明:DNMT1在G1时期的表达量极显著高于G2、G3时期,显著高于G4、G5、G6时期;随着毛囊发育时期的变化,DNMT3a的表达量呈先上升后下降的趋势,DNMT3b表达量持续下降。在相同时期DNMT1、DNMT3a、DNMT3b 3个基因之间的相对表达量水平差异不显著。本研究获得了DNMTs基因在苏博美利奴羊毛囊发育不同时期的表达模式,为进一步揭示甲基化对苏博美利奴羊毛囊发育的调控机制奠定了基础。