浅谈基因工程技术在动物科学上的应用

基因工程就是把甲种生物的基因(即目的基因)用类似外科手术的方法转移到乙种生物的细胞内(称宿主细胞)，使其在乙种生物细胞内复制和表达自己，以直接或间接地利用生物体的机能来生产人类所需物质的技术。由于生物的基因可在生物四大系统(即人类、动物、植物、微生物)中相互交流，其遗传密码是一致的，转译出来的氨基酸也是一致的。     

基因重组技术

基因重组,即染色体上DNA分子的断裂和再结合。这种重组在自然的有性繁殖过程中即可发生,但它受生物亲缘关系的严格限制。本文所述的基因重组技术是用人工方法将基因重新组合,然后转化或转导到受体细胞内进行表达的技术。基因重组操作程序包括以下几个主要技术环节。(1) 分离和提取目的的基因。分离的前题是准确地从DNA链上把目的基因切割下来,这种情确的切割功能是以能识别DNA上特异核苷酸顺序的限制性内切酶完成的。(2) 载体的准备。载体是作为载用目的的基因的工具,具有能与目的基因结合、进入宿主细胞美在宿主细胞内增殖的一个     

细胞因子IL-2和IL-12在基因免疫中的佐剂作用

基因免疫(Gene immunization)又称DNA免疫或核酸免疫,是指将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)与质粒重组后,利用某种方法直接导入动物细胞内,使带有目的基因的表达载体转化到体内,通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白,诱导宿主产生针对该抗原的抗体并引起特异的免疫应答以     

核酸疫苗的研究进展

核酸疫苗又称基因疫苗，包括DNA疫苗和RNA疫苗。目前研究最多的是DNA疫苗，由于其不需要任何化学载体，又称裸DNA疫苗，主要是利用基因重组技术直接将编码抗原蛋白的外源抗原基因导入动物体细胞内，在宿主细胞中表达外源抗原基因，诱导宿主产生对该抗原的免疫应答，从而使被接种动物获得免疫保护。     

核酸疫苗研究进展

核酸疫苗是利用基因重组技术生产的疫苗,又称为基因疫苗,包括DNA疫苗和RNA疫苗。目前研究最多的是DNA疫苗,因它不需要任何化学载体,所以又称为裸DNA疫苗。先将编码抗原蛋白的基因连接到真核质粒表达载体上,然后导入宿主细胞内,抗原基因就可以在宿主细胞内被表达,从而诱导宿主对     

生物工程的现状与展望(四)

四基因工程基因工程主要是基因重组技术。利用类似工程设计的办法,按照人们的需要,将基因剪切下来,将目的基因与载体(微生物质粒、噬菌体、病毒)进行重组,然后把人工重组的基因转入宿主细胞(大肠杆菌等),进行无性繁殖,并使新的遗传性状得到表达,产生出人类所需要的产物,或创建新的生物类型,此即基因工程。基因工程构建新生物,目前已不仅限于微生物。但基因工程的成果已直接转给生产部     

基因工程技术

基因工程是70年代初兴起的一门新技术,它是用人工方法把不同生物的遗传物质分离出来,在体外进行剪切、拼接、重组在一起,然后再把其重组体放回宿主细胞内进行大量复制,并使遗传信息在新宿主细胞或个体中高效表达,最终获得基因产物。这种人工创造新生物并给予生物以新功能的过程称为基因工程。把新的遗传物质引入细胞,需要克服一系列的技术难关。第一,要从复杂的生物有机体基因组中,经过酶切消化等步骤,分离出带有目的基因的DNA片段。第二,在体外将目的基因连接到能够自我复制并具有选择记号的载体分子上,形成重组DNA分子。第三,必须有一种良好的手段将重组DNA分子转移到适当的受体细胞。第四,受体细胞必须能在各次细胞间期复制这种新获得的DNA,这就需要从大量的细     

嗜吞噬无形体效应蛋白Ats-1调控宿主细胞剪接体转录机制的初步分析

为研究嗜吞噬无形体效应蛋白Ats-1对宿主细胞内蛋白表达的影响,并初步分析Ats-1对宿主细胞剪接体的调控机制,本研究将嗜吞噬无形体的Ats-1基因克隆后连接至pcDNA3.1质粒,构建pcDNA3.1-Ats-1重组质粒,经PCR和测序鉴定正确后利用脂质体Lipofectamine^TM3000将其转染HEK293T细胞,继续培养至24 h、48 h时经western blot鉴定,结果显示,在48 ku (全长蛋白)和35 ku (成熟蛋白)出现特异性条带,表明Ats-1蛋白在细胞内可正确表达;且相较于24 h,48 h Ats-1蛋白在细胞内的表达量显著增加(P<0.05)。将重组质粒pcDNA3.1-Ats-1和空质粒pcDNA3.1分别转染HEK293T细胞,48 h后收获细胞并裂解取裂解液,利用同量异位标签定量蛋白质组学方法(iTRAQ)筛选Ats-1表达后宿主细胞内差异显著表达的蛋白,并采用基因本体论(GO)分析差异显著表达蛋白的功能,利用京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库分析差异显著表达蛋白参与的信号通路。从剪接体通路选取34个差异表达...     

DNA疫苗的研究进展

大约十年前,人类进入第三次疫苗革命阶段,其起始标志是Wolff在一次实验中偶然发现,他将裸露的DNA注射到肌肉中结果得到了表达的蛋白产物.自1993年起,Robinson首次报道了禽流感病毒(AIV)DNA疫苗研究成功,紧接着Ulmer证实了表达流感病毒核蛋白的质粒DNA不仅能诱导小鼠的特异性细胞免疫反应,而且可对不同血清亚型的异源流感病毒产生交叉免疫保护.在大量实验工作的基础上,一种新的疫苗——DNA疫苗诞生了,其概念可表述为将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA)与质粒重组后,直接导人动物细胞内,并通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白,诱导宿主细胞产生对该抗原蛋白的免疫应答,从而达到预防和治疗疾病的目的.     

感染马传染性贫血病毒的巨噬细胞差异表达microRNA分析

为研究马传染性贫血病毒(EIAV)感染靶细胞-马单核巨噬细胞(eMDM)后细胞内microRNA (miRNA)表达的变化,本研究采用EIAV强毒株EIAVDLV34感染eMDM,并以未感染组作为对照,提取细胞内总RNA,通过高通量测序分析细胞内miRNA表达谱的变化。结果显示,与对照相比,感染EIAVDLV34后eMDM有16个miRNA发生差异表达,其中8个miRNA上调表达,8个miRNA下调表达,通过荧光定量PCR技术对这16个miRNA的表达进行了验证,结果与高通量测序一致,最后利用生物信息学方法对这16个miRNA的靶基因及其参与的生物学过程进行了分析,显示靶基因主要参与转录调控、信号转导、细胞凋亡等生物学过程。本研究为进一步分析EIAV与其宿主相互作用、致病机制以及慢病毒相关疾病的预防提供了参考依据。     

影响核酸疫苗免疫效果的因素及提高核酸疫苗免疫效果的方法

核酸疫苗(nucleic acid vaccines)是将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)直接导入动物体细胞内,并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白,诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答,以达到预防和治疗疾病的目的.     

禽类DNA疫苗研究进展

新型疫苗的研究对于禽类传染病的防制意义重大。传统疫苗是基于抗原刺激机体产生特异性抗体的原理,它们大多数激发机体的体液免疫,很难启动细胞免疫。脱氧核糖核酸(DNA)疫苗作为第3代疫苗,具备传统疫苗和其它基因工程苗不可比拟的优点,能够诱导全方位的免疫反应且使用更安全更方便,DNA疫苗是将外源基因与真核质粒重组后直接导入细胞内,使外源基因在宿主细胞内表达合成保护性抗原蛋白。这是模拟病毒自然感染提呈过程,既能产生细胞免疫,又能产生体液免疫。文章对DNA疫苗在禽类应用的可行性和应用研究新进展作了综述。     

口蹄疫病毒3C蛋白酶结构与功能及应用研究进展

口蹄疫病毒(FMDV)3C蛋白酶是FMDV基因组编码中具有酶学活性的病毒产物之一,在FMDV编码蛋白的成熟和子代病毒在宿主细胞体内大量扩增中发挥着重要作用。3C蛋白酶能剪切多聚蛋白,降解特定的蛋白质,是宿主细胞中重要的毒力因子。3C蛋白酶能调控蛋白的转录和翻译,使宿主细胞内的干扰素等多种抗病毒基因低水平表达,使FMDV逃避宿主的天然免疫。论文主要综述了FMDV 3C蛋白酶的结构、生物学功能,并介绍了其在研制新型疫苗中的应用,以期为今后FMDV 3C蛋白酶的研究、新型疫苗的研发提供参考。     

影响猪繁殖与呼吸综合征病毒感染与增殖的因素

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染宿主细胞以及在宿主细胞内进行复制的过程受到宿主细胞的细胞受体、胞内大分子及细胞因子影响。随着单克隆抗体制备技术、分子生物学技术与蛋白质研究技术的日趋成熟,使深入研究影响PRRSV感染与增殖的因素成为可能。目前在猪肺巨噬细胞(PAM)与Marc-145细胞中发现了多个PRRSV细胞受体,这与PRRSV感染宿主细胞所具有严格的细胞嗜性有关。同时胞内大分子物质可导致PRRSV在宿主细胞内产生增殖性感染。包括干扰素在内的细胞因子具有抑制PRRSV在宿主细胞内增殖的作用。研究影响PRRSV感染与增殖的因素,对于预防PRRSV感染与合理利用PRRSV具有重要意义。     

核酸疫苗的研究与应用

核酸疫苗(nucleicacidvaccine)是指将含有编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)序列质粒载体作为疫苗,直接导入到动物细胞内,通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白,诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答,以达到预防和治疗疾病的目的。核酸疫苗又称为基因疫苗或裸DNA疫苗,核酸疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗。这种免疫称为核酸免疫、基因免疫、DNA介导的免疫以及遗传免疫等。核酸疫苗与传统疫苗相比有许多优势。1核酸疫苗的研究历史核酸疫苗是由基因治疗发展而来的,1990年Wolff等发现,在小鼠肌肉组织内直接注射质粒DNA后,质粒及其携带的外…     

DNA干扰研究进展

DNA干扰(DNAi)即含有与体内某一基因的cDNA相同序列的DNA链,在没有启动子诱发其表达的情况下导致细胞内序列特异的基因表达被抑制.DNA干扰可参与真核生物的抗病毒侵粢,阻断转座子的异常活动,调控基因表达等.随着RNA干扰技术缺陷的暴露以及人们对多种同源基因依赖性基因沉默的深入了解,DNAi有望成为最有潜力的基因干预治疗方法,并将在抵抗人类重大疾病和基因治疗方面发挥重要作用.     

禽流感病毒PA-N182与鸡COPD蛋白互作的鉴定

宿主蛋白质广泛参与流感病毒基因组在宿主体内的转录、复制和翻译。病毒蛋白质和宿主蛋白质的互作对于病毒的感染有重要影响。PA-N182是新发现的PA基因的转录形式,关于其宿主互作蛋白质的研究目前尚少。COPD(coatomer protein complex,subunit delta)是负责细胞内新合成蛋白质从内质网向高尔基体转运的基因,COPD基因敲除后细胞内流感病毒滴度降低,表明COPD基因可能参与流感病毒的复制。COPD基因影响流感病毒感染的机制仍未见报道。本研究通过构建PA-N182和COPD过表达载体并共转染细胞,利用免疫共沉淀、Western blot的方法,证实在鸡细胞内H5N1禽流感病毒PA-N182蛋白和COPD蛋白有相互作用,表明COPD对流感病毒感染的影响可能与其和PA-N182蛋白的互作并影响PA-N182蛋白从宿主细胞内质网向高尔基体的转运有着密切的联系。     

DNA疫苗的免疫调节和接种方案的研究进展

1993年Ulmer等报道将含有流感病毒基因的质粒直接肌注于小鼠体内可诱导全面的免疫应答，并可抵抗流感病毒攻击。至此，被誉为“疫苗的第三次革命”的DNA疫苗技术应运而生。DNA疫苗与传统疫苗相比有多种优势：DNA疫苗生产简便，储运方便；能够诱导机体产生体液和细胞免疫；能够根据宿主细胞的表面蛋白．在细胞内表达天然的、     

利用CRISPRi技术敲低海分枝杆菌PPE13基因

为研究分枝杆菌PPE13基因在宿主细胞的生物功能，本试验利用成簇的规律间隔的短回文重复序列干扰(clustered regularly interspaced short palindromic repeat interference, CRISPRi)构建海分枝杆菌PPE13诱导型敲低菌株。CRISPRi主要包括表达失活的Cas9蛋白(dead cas9,dCas9)和特异性单向导RNA(single guide RNA,sgRNA),通过形成复合体特异性识别相应DNA序列并抑制目的基因的转录。用无水四环素(anhydrotetracycline, ATC)诱导海分枝杆菌PPE13诱导型敲低菌株，提取细菌RNA,利用定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)技术检测dCas9、PPE13基因的表达情况，观察细菌在不同时间D_{600 nm}的变化，分析诱导剂质量浓度和目的基因转录水平之间的关系。使用PPE13敲低菌株感染巨噬细胞并检测胞内菌的存活情况。结果表明，在ATC诱导后，dCas9表达水平显著增...     

牛支原体脂质相关膜蛋白诱导胎牛肺细胞差异表达的转录组学研究

为阐明牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)脂质相关膜蛋白(LAMPs)诱导胎牛肺(EBL)细胞的免疫应答机制,本研究采用转录组测序(RNA-seq)技术结合生物信息学方法分析M.bovis LAMPs诱导EBL细胞产生的差异表达基因。本实验首先分别构建LAMPs诱导组与对照组EBL细胞的c DNA文库并对其进行高通量测序,利用MAS3.0软件对差异表达基因进行筛选,结果显示共筛选得到706个差异表达基因,其中上调和下调差异基因分别为364个和342个;GO注释显示,差异表达基因编码蛋白主要与细胞黏附、免疫应答以及细胞增殖等相关;利用荧光定量PCR对部分差异表达基因(PIM2、F2RL1以及PTPN2)的表达情况进行验证,结果与RNA-seq测序结果相符。本研究为进一步阐述M.bovis的致病机制及宿主的免疫应答机制提供依据。