基因芯片技术的应用

基因芯片(gene chip)也叫D N A芯片、D N A微阵列(D N A m icroarray)、寡核苷酸阵列(oligonucleotide array),是指采用原位合成(in situ synthesis)或显微打印手段,将数以万计的D N A探针固化于支持物表面上,产生二维D N A探针阵列,然后与标记的样品进行杂交,通过检测杂交信号来实现对生物样品快速、并行、高效地检测或医学诊断,由于常用硅芯片作为固相支持物,且在制备过程运用了计算机芯片的制备技术,所以称之为基因芯片技术。基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上,所以可以一次性对样品大量序列进行检测和分析,从而解决了…     

基因技术在动物营养科学中的应用

1概述基因技术是利用生物有机体或其组成部分发展新产品、新工艺、新技术的一整套技术体系,它与细胞技术、酶技术、发酵技术密切相关。基因技术主要涉及生物类所共有的遗传物质——D N A、R N A的分离纯化、体外剪切、拼接重组以及扩增、表达等技术。基因工程与细胞工程相结合,     

日粮蛋白质水平对湖羊胃肠道内pH值、氨态氮和菌体蛋白的影响

试验借助瘤胃、十二指肠造瘘技术,研究4种蛋白质水平[8.4%(A)、11.2%(B)、14.0%(C)、16.8%(D)]日粮对湖羊胃肠道pH值、氨态氮和菌体蛋白的影响,对科学的指导反刍动物生产具有现实意义。试验结果显示,随着日粮蛋白质水平的升高,湖羊胃肠道各参数也呈现了升高的趋势。瘤胃液氨氮浓度在食后4h达到峰值,蛋白质水平高时产氨量也较高,D组极显著高于其它组(P<0.01);C组极显著高于A组(P<0.01)。十二指肠食糜中D组氨氮浓度最高,极显著高于其它三组(P<0.01);B、C组极显著高于A组(P<0.01)。瘤胃液中的菌体蛋白以D组(5.24mg N/100ml)最高,A组最低(4.18mg N/100ml),D组显著高于A组(P<0.05)。表明蛋白质水平日粮对湖羊胃肠道内环境各参数有显著影响。     

家禽DNA疫苗研究进展(上)

家禽D N A 疫苗具有安全性好、稳定性好、特异性能强等特点，本文综述了D N A 疫苗的结构、接种途径与免疫应答机制、影响免疫应答的因素以及D N A 疫苗的佐剂，并对目前研究中存在的问题进行了总结，提出了切实可行的对策，具有一定的科学性和实践性。     

连翘酯苷A对感染H9N2-AIV小鼠的炎症基因水平表达的影响

本研究旨在探究连翘酯苷A对感染H9N2禽流感病毒后小鼠的炎症基因水平表达的影响,探讨连翘酯苷A抗病毒的免疫作用机制。对不同分组处理的小鼠于3、5、7、14d采血(n=3),检测白介素1β(IL-1β)含量;取第7d小鼠肺组织(n=3),通过荧光定量PCR检测髓样分化因子(My D88)与核因子-κB(NF-κB)变化,分析连翘酯苷A对其表达的影响。结果表明连翘酯苷A可减少IL-1β分泌;与模型组相比,连翘酯苷A治疗后My D88与NF-κB基因表达水平降低。研究提示,连翘酯苷A的免疫调节作用可能是通过调控炎症基因表达,降低炎症因子的分泌来实现的。     

中国地方品种淮猪FSHβ亚基、ESR和HAL基因的多态性及其产仔效应分析

实验采用PCR-RFLP分析技术,对51头淮猪的DNA样品进行检测分析,发现淮猪具有FSHβ、ESR基因的多态性,而Hal基因中只含有等位基因N,这和人们对其他中国地方品种的研究结果比较一致。研究结果显示:在FSHβ基因中,A、B等位基因的频率分别为0.9314和0.0686;在ESR基因中,C、D分别为0.2400和0.7600;在Hal基因中,只有等位基因N证明了淮猪具有优良的抗应激特性。同时FSHβ基因中,B等位基因具有增加总产仔数和产活仔数的趋势。在ESR基因中,A等位基因具有增加总产仔数和产活仔数的效应,其加性效应分别为1.515和1.325,差异显著(P<0.05)。     

多重PCR检测产气荚膜梭菌方法的建立及其临床应用

产气荚膜梭菌是牛羊猝死和肠出血症的重要病原之一。本研究根据其常见的A、B、C、D四种菌型菌株编码α、β和ε毒素的保守序列,分别设计合成了针对这3种毒素的特异性引物,建立了多重PCR检测不同血清型产气荚膜梭菌的技术方法。通过对参考菌株的分型检测表明,该方法不仅快速、客观,而且具有良好的特异性和敏感性。对羔羊猝死症中分出的菌株进行检测,确定其为产气荚膜梭菌A型和D型混合感染;对产后母牛血痢病料中分离的菌株进行检测确定其为产气荚膜梭菌A型。     

犬流感

早在20世纪70年代,Nikitin A等人通过动物试验证明犬可以感染人H3N2流感病毒,并且在犬血清内检测到相应的抗体[1].之后Romvary J Kilbourne E D Onta T等人也证明了犬可以感染流感病毒,但是一直未从自然发病犬体内分离到流感病毒,或者发现流感病毒在犬群中大量流行[2-7].近10年,关于甲型流感病毒(influenza A virus)感染犬猫的报道频繁出现,包括H3N8、H5N1、H3N2和H1N1共4种亚型流感病毒.     

禽流感病毒RT-PCR及多重RT-PCR检测技术的建立

研究建立了禽流感病毒（AIV）A型、H5、N1、H9、N2亚型特异性RT-PCR及HS／N1、H9／N2、A／H5／Nl多重RT-PCR检测技术，用于检测或同时检测和鉴别A型及H5N1、H9N2亚型AIV。所建立的RT-PCR和多重RT-PCR从核酸提取、基因扩增到产物分析在3～4h内即可完成，经对36株AIV及相关病毒分离物检测，与病毒分离鉴定的结果完全一致，且与相关病毒或其他亚型无交叉反应。采用多重RT-PCR检测80份棉拭子样品，并与病毒分离鉴定方法比较，二者H5N1、H9N2亚型的鉴定结果完全吻合。结果表明，该方法具有快速、敏感、特异等优点，为临诊样品中AIV型及H5N1、H9N2亚型鉴定和诊断的有效方法。     

不同精粗比底物对瘤胃细菌标记率的影响

以4头安装永久瘤胃瘘管的徐淮山羊为试验动物,运用15N稳定性同位素示踪技术,研究了1:9(A)、3:7(B)、5:5(C)、7:3(D)四种精粗比底物对瘤胃细菌15N标记率的影响。结果表明:(1)细菌产量D组显著高于A组,极显著高于B组,细菌含氮量以C组最高,为5.25%;(2)细菌15N富集量、瘤胃细菌对(NH4)2SO4的利用率以C组最高,分别为367.13μg/30ml、16.79%,而B组最小,分别为257.13μg/30ml、11.65%;(3)细菌15N标记率A、B组间差异不显著,A组显著高于C、D组,B组极显著高于C、D组,C、D组间差异不显著,且1.5h为最佳标记时间。     

H5N1亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及其应用

采用活病毒免疫，常规杂交瘤融合的方法，获得了4株针对H5N1亚型禽流感病毒(AIV)A／duck／Shandong／093／2004(A／D／SD／04)株血凝素(HA)的单克隆抗体：A8E8、D2F8、A8C8和C3G4。其中A8E8可以与11株不同来源的H5N1 AIV发生交叉免疫抑制性反应(HI)，具有广谱性。采用间接免疫荧光试验(IFA)，用A8E8单克隆抗体测定A／D／SD／04株对COS-1和MDCK2种细胞的半数感染量(TCID50)，结果显示，A／D／SD／04株在COS-1上的TCID50为10^-5.33／0．1mL，在MDCK上的为10^-7.33／0．1mL。将编码A／D／SD／04株的HA基因质粒与PR8质粒共转染COS-1细胞后，用A8E8进行IFA，能观察到特异性绿色荧光，这与鸡胚接种结果相符。表明，用此单克隆抗体能准确地检测到H5重组病毒。     

对重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型，Re-1株）对家禽免疫效果方面的调研

2006-2007年,通过检测免疫注射H5N1重组禽流感病毒灭活疫苗（Re-1株）后3-4周的444个鸡场、66个鸭场和28个鹅场共计16140份血清中H5亚型禽流感血凝抑制抗体水平,比较A、B、C、D、E5个不同厂家的疫苗对鸡、鸭、鹅免疫效果。结果显示：重组禽流感灭活疫苗（H5N1亚型,Re-1株）对鸡的免疫效果明显好于鸭和鹅;不同厂家疫苗质量和免疫效果有差异,其中A厂疫苗质量和免疫效果最好。     

泛素化激酶Cbl蛋白对H9N2亚型禽流感病毒早期复制的抑制作用

为研究Cbl蛋白(Casitas b-lineage lymphoma)对H9N2亚型禽流感病毒(AIV)复制的影响,采用PCR技术扩增Cbl基因片段并连接到FLAG-N载体中,Western blot技术验证FLAG-Cbl重组载体表达及病毒NP蛋白的表达情况,并采用荧光定量PCR技术检测病毒的血凝素(HA)、核蛋白(NP)和非结构蛋白(NS)基因水平;采用RNAi技术检测Cbl对病毒HA基因表达水平的影响。结果显示:EcoRⅠ、HindⅢ双酶切鉴定及测序分析发现,成功构建真核表达重组载体FLAG-Cbl; Western blot结果证实H9N2亚型AIV感染FLAG-Cbl重组载体转染的A549细胞6 h时,病毒NP蛋白表达降低;荧光定量PCR结果证实病毒NP、NS及HA基因在AIV感染FLAG-cbl重组载体转染的A549细胞的6和12 h时表达水平均明显降低;RNAi敲低A549细胞内源性Cbl蛋白后,H9N2亚型AIV的HA基因表达水平在病毒感染12、24和36 h明显升高。结果表明:Cbl蛋白能在早期抑制H9N2亚型AIV在A549细胞上的复制,为深入研究Cbl蛋白抗病毒复制的机制提供了重要的试验依据,同时为开展抗AIV的药物研发提供了参考。     

A型流感病毒分型基因芯片在流感病毒各亚型监测中的应用

为验证自行研制的A型流感病毒分型基因芯片方法在实际中的应用效果,了解A型流感病毒各亚型在我国不同地区和不同宿主中的分布情况,对我国20个地区、不同宿主源(鸡、鸭、鹌鹑、鸽子、猪、人等)拭子和组织样品共16 852份进行了检测。利用自行研制的A型流感病毒分型基因芯片方法,对样品进行RNA提取、多重不对称RT-PCR扩增、芯片杂交、洗涤和扫描分析;同时将基因芯片检测阳性的样品,用普通RT-PCR扩增后进行序列测定。结果显示:利用该方法检出阳性样品2 582份,总检出率为15.32%(2 582/16 852),共检测到H1N1、H2N9、H3N2、H4N6、H5N1、H7N1、H7N9、H9N2、H10N5、H16N3等10个亚型,且均与阳性样品测序结果一致。结果表明,该方法可准确检测不同地区、不同宿主中的A型流感病毒不同亚型。同时,该方法能在同一张芯片上准确鉴定A型流感病毒的多种亚型,解决了其他常规方法无法检测已发现和可能发生变异的所有亚型的棘手问题,从而为A型流感诊断和分子流行病学监测提供了一种新技术。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体的制备及生物学特性分析

分别用纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和纯化的重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSV N蛋白的单克隆抗体(McAb)。用纯化的PRRSV免疫小鼠,经细胞融合获得2株可分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为4B8、4D8。用重组N蛋白免疫的小鼠,经细胞融合获得3株可分泌特异性McAb的抗PRRSV N蛋白的杂交瘤细胞2F3、4D5、5D11。间接ELISA检测4D8、4B8、4D5和5D11杂交瘤上清效价为1∶32~1∶512,而2F3的腹水效价为1∶12 800。单抗2F3、4B8和4D8与纯化病毒的Western blotting反应都为阳性,而4D5和5D11为阴性。IFA检测结果5株单抗都有明显的荧光,与PRRSV呈阳性反应。2F3的Ig亚型为IgM。5株单抗杂交瘤细胞连续传代至20代,分泌相应McAb的效价基本一致。本研究为PRRSV生物学诊断和方法研究提供有用工具。     

口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒二重RT-LAMP鉴别检测方法的建立

LAMP技术是一种快速新型的核酸检测技术,该技术利用4条引物在恒温下扩增目的 DNA,特异性好敏感性高。本试验旨在建立一种能同时鉴别诊断FMDV和VSV的二重RT-LAMP检测方法。根据口蹄疫病毒(FMDV)3D基因和水泡性口炎病毒(VSV)N基因的保守序列,设计了2套特异性引物,在每套引物的内引物中插入酶切位置EcoRⅠ,对反应条件进行了优化,建立了恒温快速的检测方法。结果显示:该方法特异性好,能检测到口蹄疫病毒的A,O,Asia1亚型和水泡性口炎的NJ和IND亚型,并与其他对照牛病原体不发生交叉反应;敏感性高,最低能够检测个100个FMDV病毒RNA和100个VSV病毒RNA;干扰性小,能同时检测两个模板的不同浓度组合。本试验建立的口蹄疫和水泡性口炎二重RT-LAMP方法具有简便、快速、特异、敏感等优点,可用于FMDV和VSV的临床检测和流行病学调查。     

盐酸阿比朵尔体外抑制2009新型流感病毒A(H1N1)的作用

<正>目的检测盐酸阿比朵尔体外对2009新型流感病毒A(H1N1)复制的影响。方法采用2009新型流感病毒A(H1N1)感染MDCK细胞系统,检测盐酸阿比朵尔抗流感病毒的活性。血凝实验、细胞病变保护实验、RT-PCR和定量RT-PCR实验用于病毒滴度确定。使用Chou软     

对重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型，Re-1株）在家禽免疫效果方面的调研

2006-2007年,通过检测免疫注射H5N1重组禽流感病毒灭活疫苗（Re-1株）后3～4周的444个鸡场、66个鸭场和28个鹅场共计16140份血清中H5亚型禽流感血凝抑制抗体水平,比较A、B、c、D、E5个不同厂家的疫苗对鸡、鸭、鹅免疫效果。结果显示：重组禽流感灭活疫苗（H5N1亚型,Re-1株）对鸡的免疫效果明显好于鸭和鹅;不同厂家疫苗质量和免疫效果有差异,其中A厂疫苗质量和免疫效果最好。     

日粮蛋白质水平对湖羊胃肠道pH值、氨态氮和菌体蛋白的影响

试验借助瘤胃、十二指肠造瘘技术,研究4种蛋白质水平[8.4%(A)、11.2%(B)、14.0%(C)、16.8%(D)1日粮对湖羊胃肠道pH值、氨态氮和菌体蛋白的影响,对科学的指导反刍动物生产具有现实意义.试验结果显示,随着日粮蛋白质水平的升高,湖羊胃肠道各参数也呈现了升高的趋势.瘤胃液氨氮浓度在食后4 h达到峰值,蛋白质水平高时产氨量也较高,D组极显著高于其它组(P<0.01);C组极显著高于A组(P<0.01).十二指肠食糜中D组氨氮浓度最高,极显著高于其它三组(P<0.01);B、C组极显著高于A组(P<0.01).瘤胃液中的茵体蛋白以D组(5.24 mg N/100 m1)最高,A组最低(4.18 mg N/100 ml),D组显著高于A组(P<0.05).表明蛋白质水平日粮对湖羊胃肠道内环境各参数有显著影响.     

H9N2禽流感病毒核蛋白NP单克隆抗体的制备

为了了解抗H9N2禽流感病毒(AIV)单克隆抗体的确切用途,试验用纯化后的H9N2禽流感病毒免疫Balb/c小鼠,经细胞融合后再进行筛选。结果表明:获得2株能够稳定分泌抗H9N2 AIV的杂交瘤细胞株,分别命名为1E7和3D6,2株单克隆抗体的腹水效价分别为1∶25 600和1∶12 800;应用间接ELISA和间接免疫荧光检测显示,2株单克隆抗体均能与H9N2亚型AIV发生反应;进一步研究发现,3D6可以与H9N2 AIV中的NP蛋白结合,使得表达NP蛋白的MDCK细胞显现出绿色荧光。说明3D6是一株针对H9N2 AIV NP蛋白的单克隆抗体。