禾谷炭疽菌CFEM效应子的生物信息学鉴定与转录分析

植物病原真菌效应子是指可以改变寄主植物细胞结构或者细胞功能的分泌蛋白或其他小分子物质。效应子对病原真菌的侵入、扩展以及致病发挥着至关重要的作用,是植物病原真菌与寄主的互作不断演化的必然结果。真菌特有的CFEM(common in several fungal extracellular membrane protein)蛋白对于病原真菌的致病性起重要作用,一些能够被分泌到胞外的CFEM蛋白被证明是病原真菌效应子。由禾谷炭疽菌(Colletotrichum graminicola)引起的玉米炭疽病是玉米上的重要病害,常年造成严重损失。本研究运用生物信息学工具对禾谷炭疽菌中的CFEM蛋白进行信号肽分析和亚细胞定位分析,进而通过转录分析明确禾谷炭疽菌CFEM蛋白的表达时期。分析结果表明,该病原真菌编码32个CFEM蛋白,其中22个具有信号肽并可分泌至胞外,为分泌蛋白。转录分析表明,10个CFEM分泌蛋白于病菌侵染时附着胞形成期表达,2个CFEM分泌蛋白于侵染后的活体寄生阶段表达,1个于死体寄生阶段表达,其余9个CFEM分泌蛋白在病菌侵染时期的3个阶段均稳定表达。结合生物信息学和转录分析结果,我们预测这22个CFEM分泌蛋白为禾谷炭疽菌致病相关的效应子(简称CFEM效应子)。明确禾谷炭疽菌中CFEM蛋白数量,预测病菌致病相关的CFEM效应子组成,可为开展病原真菌CFEM蛋白介导的病菌—寄主互作研究奠定基础,并为玉米炭疽病的防治和抗性育种研究提供参考。     

辣椒胶孢炭疽菌遗传转化体系的建立

由辣椒胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides导致的辣椒炭疽病是辣椒生产上最为严重的真菌病害之一。本文以辣椒胶孢炭疽菌CSLL11为供试菌株,采用PEG-CaCl_2介导的原生质体转化法,将含有潮霉素B抗性基因和eGFP表达基因的DNA片段成功转入辣椒胶孢炭疽菌的原生质体中,获得了稳定表达绿色荧光的转化子,从而成功建立了辣椒胶孢炭疽菌的遗传转化体系。试验结果表明,可有效筛选阳性转化子的潮霉素B浓度为500 mg/L;PCR及Southern blot结果显示,eGFP表达基因已单拷贝整合至辣椒胶孢炭疽菌转化子的基因组中;使用荧光显微镜观察第一代及继代培养后的转化子,菌丝与分生孢子均表现出强烈的绿色荧光信号,说明GFP能在转化子中稳定遗传;将转化子与野生型菌株相比,菌落形态、生长速率及致病力水平无明显差异。本研究建立了辣椒胶孢炭疽菌遗传转化体系并获得了稳定表达绿色荧光蛋白的转化子,对辣椒炭疽菌与寄主互作的研究及病害防治具有重要意义。     

假禾谷镰孢菌细胞自噬相关基因的鉴定与表达分析

细胞自噬是真核生物中一类包含多种进化保守的Atgs蛋白参与的蛋白质降解途径,该途径也参与多种植物病原真菌的产孢、孢子萌发和致病性过程。本研究利用模式物种已知的Atgs,通过生物信息学分析在假禾谷镰孢菌中鉴定到29个Atgs,分属29种不同蛋白类型。细胞自噬核心调控机制相关蛋白Atg1、Atg6、Atg8和Atg9的氨基酸序列系统进化分析结果显示,Atgs在丝状真菌间非常保守,符合物种进化的特点。通过假禾谷镰孢菌跟亲和与非亲和寄主转录组数据分析发现,与菌丝阶段相比26个Fp Atgs在侵染阶段的表达发生改变,其中Fp Atg1、2、3、4、5、7、8、9、13、22、23、28和Fp Vps34在侵染初期和中后期均诱导表达;Fp Atg6、14、17、20、24、29和Fp Vps15在侵染初期和中后期表达量均降低;Fp Atg10、11除在非亲和互作中后期表达量略有上调,其余阶段均显著下调表达;Fp Atg15、16在亲和互作初期诱导表达,其余阶段均下调表达;Fp Atg26、27在亲和互作初期下调表达,中后期诱导表达,而在非亲和互作初期表达量升高,到中后期下调表达。推测细胞自噬参与调控假禾谷镰孢菌的侵染过程。     

草莓果生炭疽菌LysM效应子CfLysM2的致病功能分析

果生炭疽菌Colletotrichum fructicola侵染引起的草莓炭疽病是草莓生产中的重要病害。前期研究发现一个在果生炭疽菌侵染阶段高表达的含LysM结构域的候选效应子CfLysM2。为进一步研究CfLysM2的致病功能,运用同源重组方法构建CfLysM2缺失突变株ΔCfLysM2和回补菌株CfLysM2c。致病力测定结果表明,接种后15 d,ΔCfLysM2接种的草莓叶片病情指数显著下降。荧光定量PCR分析表明CfLysM2基因在果生炭疽菌接种草莓叶片后24 h相对表达量最高。利用转录组技术对野生型菌株(wild-type strain, WT)和ΔCfLysM2接种后24 h的草莓叶片样品进行比较分析,获得差异表达基因109个。CfLysM2的缺失导致宿主代谢途径尤其是次生代谢物生物合成通路的激活,说明CfLysM2可能在果生炭疽菌侵染草莓过程中通过靶向黄酮醇合成酶等代谢相关基因,抑制植物次生代谢产物合成及其介导的抗真菌免疫,保证其顺利侵染。该研究为揭示CfLysM2机理及对果生炭疽菌和草莓互作研究奠定了理论基础。     

草莓应答炭疽菌侵染的转录组分析

本研究以栽培草莓为材料,用炭疽菌对植株进行侵染,对健康草莓和患病草莓进行转录组分析(RNA-seq),共得到86 988个序列以及2 127个差异表达基因。利用GO数据库对差异表达基因进行了聚类分析,结果发现差异表达基因主要聚类在光合作用、氧化还原过程、氧化还原酶活性、碳固定过程以及糖代谢过程等方面。同时,利用KEGG数据库对差异表达基因影响的通路进行注释后发现,炭疽菌侵染主要影响了光合作用、倍半萜和三萜生物途径、类黄酮生物合成、谷胱甘肽代谢和植物激素信号转导等途径中关键基因的表达水平。挑选了20个差异表达基因进行qRT-PCR,结果有19个基因的表达趋势与转录测序结果一致。本研究获得的草莓应答炭疽菌侵染转录组数据信息,将有助于丰富草莓抗炭疽病的调控机制。     

可可毛色二孢效应子LT_397基因的克隆及转录分析

可可毛色二孢Lasiodiplodia theobromae是引起葡萄溃疡病的主要致病菌之一。病原菌会分泌许多效应子抑制植物的防御反应。本试验对可可毛色二孢特有的效应子LT_397基因进行克隆,开放阅读框(open reading frame,ORF)全长1140 bp,含有11个半胱氨酸。生物信息学软件预测显示:效应子LT_397信号肽为位于N端的1~16个氨基酸。qRT-PCR结果表明:LT_397受可可毛色二孢诱导下,在侵染24 h的基因相对转录水平最高;在逆境胁迫处理方面:LT_397在营养、氧化、离子、酸碱和UV胁迫下基因的相对转录水平都上升。烟草瞬时表达表明,效应子LT_397可抑制水稻细菌性谷枯病菌Burkholderia glumae引发的过敏反应(hypersensitive response,HR)。以上结果为进一步分析效应子对寄主的致病机制奠定了基础。     

云南葡萄产区葡萄炭疽病病原鉴定及致病力分析

为了明确引起云南葡萄产区炭疽病的病原种类,利用形态鉴定和特异性引物分子检测相结合的方法对从云南省主要葡萄产区采集的60株炭疽病菌菌株进行了鉴定。葡萄炭疽病菌菌株的菌落形态和生长速率与对照菌株尖孢炭疽菌Colletotrichum acutatum差异不明显,但其分生孢子大小显著小于尖孢炭疽菌,附着胞深褐色,球形或不规则形。胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides特异性引物CgInt/ITS4从供试葡萄炭疽病菌菌株基因组DNA中扩增出1条约500 bp的特异性条带,而尖孢炭疽菌特异性引物CaInt2/ITS4对葡萄炭疽病菌无扩增条带。研究表明,引起云南葡萄主产区炭疽病的病原为胶孢炭疽菌;供试胶孢炭疽菌对红提葡萄均有致病力,但菌株致病力差异较大,对番茄和草莓存在交叉侵染的能力,且对多菌灵的敏感性较尖孢炭疽菌高。     

基于链特异性RNA-seq的禾谷镰刀菌全生活史转录组分析

为明确植物病原真菌禾谷镰刀菌Fusarium graminearum全生活史的转录组特征和基因表达模式,采用生物信息学技术对其生活史不同阶段15个时期或组织的链特异性RNA-seq数据进行分析。结果表明,共有8 106个基因在所有时期均有表达,为禾谷镰刀菌生活史核心基因,占总基因数的47.2%;有性生殖和侵染过程中表达的基因数相对较多,其中有性生殖后期表达的基因数最多,达15 221个;无性产孢和侵染小麦穗过程中基因表达水平整体较高,而分生孢子中基因表达水平最低。在燕麦培养基上禾谷镰刀菌气生菌丝的基因表达模式与侵染过程中的基因表达模式较为相似,而与营养生长菌丝的基因表达模式差异较大。该菌次生代谢物合成特征酶基因和分泌蛋白基因的表达模式均分成3类,即分别在侵染、营养生长和有性生殖过程上调表达,暗示其在生活史不同阶段的特异性功能。     

锈菌效应子的研究现状与展望

锈菌是最大的一类植物病原真菌,由其引起的病害严重威胁着全球农业生产安全。锈菌作为活体营养寄生菌,在其与寄主互作过程中会分泌大量效应子以促进其侵染。开展病菌效应子调控寄主免疫机制的研究将为锈病持久绿色防控提供理论依据。该文主要针对锈菌效应子的功能及其调控寄主免疫机制方面的研究进行了概述,并对锈菌效应子今后的研究方向进行了展望。     

大丽轮枝菌及激素处理后棉花酵母双杂交文库的构建

大丽轮枝菌是引起棉花、马铃薯等重要作物黄萎病的土传病原真菌,其分泌的胞外蛋白是侵染寄主的重要毒力因子,因此研究胞外蛋白与寄主的相互作用具有重要意义。本研究旨在构建高效的棉花酵母双杂交cDNA文库,并通过已知大丽轮枝菌效应子VCR1互作蛋白的筛选来评价构建文库的质量。分别采用大丽轮枝菌及茉莉酸甲酯、水杨酸和乙烯处理海岛棉‘海7124’以诱导其抗病基因表达,混合RNA样品构建酵母双杂交cDNA文库,文库滴度达1.18×10⁸ cfu/mL,检测重组率100%,插入片段在300~2000 bp之间。以效应子VCR1为诱饵筛选获得27个潜在互作蛋白,并进一步确证了1个与VCR1互作的靶标蛋白。本研究构建的酵母双杂交文库将为筛选与大丽轮枝菌效应子互作的蛋白及后续互作机理研究提供重要的研究基础。     

高温处理西花蓟马若虫对其雌成虫寿命、繁殖力及后代发育的影响

温度是影响昆虫生长发育的重要生态因素之一,高温逆境作为一种绿色防控手段可以有效控制温室害虫种群发展。为了探究高温处理西花蓟马若虫对其种群发展的影响,本试验用41℃和43℃两个温度分别处理西花蓟马初孵若虫2、6、12、24和36h后,观察并记录其雌成虫寿命、繁殖力及后代发育指标的变化情况。结果表明,随着处理时间的延长,两个高温处理后西花蓟马雌成虫寿命,子代若虫总数、成虫总数和总存活率(若虫发育到成虫的存活率)均显著下降,后代雌雄性比呈总体下降趋势。41℃处理后,性比从2.30∶1降低到2.13∶1;43℃处理后从2.25∶1降低到2.07∶1,均明显低于对照的2.69∶1。另外,两性生殖种群相比于孤雌生殖种群更易遭受高温处理的影响。     

Identification of a class of CFEM proteins containing a new conserved motif in Fusarium oxysporum

Fusarium oxysporum (Fo) is an important soil-borne fungus that cause huge economic losses worldwide. Fungal-specific Common in Fungal Extracellular Membrane (CFEM) proteins are known to be involved in some important physiological processes associated with pathogenicity. To date, few Fo CFEM proteins have been characterized. The recent publication of several genomes of Fo has allowed us to conduct a genome-wide comparison analysis of CFEM proteins in Fo. In this study, we identified CFEM proteins for 12 different Fo formae speciales(f. sp) and obtained an average of 16 CFEM proteins for each Fo. The Fo CFEM proteins were classified into three groups (groups 1–3) according to structural features. Importantly, we identified a new conserved motif containing about 50 amino acids (DR motif) in group 1 members. CFEM proteins containing DR motif (CFEM_DR proteins) are remarkably conserved among Fo, and their number is greater in Fo compared with other fungi. We found the expansion of CFEM_DR proteins in Fo can be attributed to the segmental duplications in the genomes. Expression analysis revealed that CFEM_DR genes had a higher expression level in mycelium than conidia, and their expressions increased dramatically in the host roots at 3 days post inoculation, indicating that Fo CFEM_DR genes have roles while colonizing and infecting their hosts.     

小麦条锈菌效应蛋白HASP2抑制寄主免疫反应

 由小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp. tritici,Pst)引起的小麦条锈病是小麦上的重要病害。研究小麦条锈菌在致病过程中分泌的毒性效应蛋白分子的功能,对揭示小麦条锈菌致病机理,进而研发病害防治新方法具有重要意义。前期在小麦条锈菌吸器转录组中筛选到一个高丰度表达的分泌蛋白基因HASP2。HASP2基因全长240 bp,其编码的蛋白质N端包含22_aa的信号肽,无跨膜区,无结构域。qRT-PCR显示HASP2在条锈菌CYR32侵染早期上调表达;农杆菌介导的烟草瞬时表达实验表明HASP2能够抑制由小鼠凋亡蛋白BAX诱导的烟草细胞坏死;利用细菌三型分泌系统(T3SS)将 HASP2在小麦中过表达,发现其可以抑制寄主PTI(PAMP-triggered immunity)相关胼胝质积累;同时对HASP2过表达的小麦接种无毒性菌系CYR23后,发现HASP2可以抑制寄主ETI(Effector-triggered immunity)相关活性氧积累和减少细胞坏死面积,但HASP2过表达对条锈菌的生长发育没有显著影响。     

辣椒疫霉CRN编码基因的克隆、转录特征及在与寄主互作中的作用

 CRN (crinkling and necrosis-inducing protein)蛋白是一类卵菌特有的效应分子,然而目前对其功能和分子机制知之甚少。为分析CRN效应分子在辣椒疫霉(Phytophthora capsici)与植物互作中的作用,本研究利用前期转录组测序结果,对辣椒疫霉基因组数据库进行序列比对分析,获得了7个CRN编码基因的全长序列;采用RT-PCR方法分析其在辣椒疫霉生长发育阶段(菌丝、游动孢子囊、游动孢子、萌发的休止孢)和侵染寄主阶段(本氏烟(Nicotiana benthamiana)灌根1.5、3、6、12、24、36和72 h后)的转录水平,发现3个基因在辣椒疫霉生长发育阶段和侵染阶段上调表达;将这3个基因克隆测序,发现其编码蛋白均含有保守的LFLAK和HVLVVVP基序;在本氏烟上的基因瞬时表达结果表明,Pc559084和Pc570403能够抑制由致病疫霉elicitin蛋白INF1或老鼠促凋亡蛋白BAX诱发的植物程序性细胞死亡,并且Pc559084能够促进辣椒疫霉侵染植物。这些研究结果为理解CRN效应分子在辣椒疫霉致病过程中的作用提供了重要的实验数据。     

稻瘟病菌效应蛋白MoIEEP1功能初探

由稻瘟病菌引起的稻瘟病是全球最严重的植物真菌病害之一, 严重威胁水稻生产安全?效应蛋白是病原菌与植物对抗过程中分泌产生的一种蛋白质, 可作为毒力因子促进侵染或作为无毒因子触发防御反应?本研究对实验室前期筛选到的在稻瘟病菌侵染早期诱导表达的效应蛋白(infection-induced expression effector protein 1, MoIEEP1)进行了功能验证与分析?结果表明: MoIeep1 在稻瘟病菌侵染初期8 h表达量最高; 信号肽和亚细胞定位分析验证该蛋白N端含有17个氨基酸的信号肽且在水稻原生质体中呈明亮点状的定位信号, 初步推测该定位信号为过氧化物酶体或线粒体等细胞器; 与野生型菌株Guy11相比, MoIeep1 基因敲除突变体菌丝生长无明显差异, 但其致病性受到影响?以上研究结果为进一步探究该蛋白质的作用机理打下良好基础, 也为揭示其他效应蛋白在稻瘟病菌侵染水稻过程中的功能提供新的理论依据?     

Identification of Maize Kernel Endosperm Proteins Associated with Resistance to Aflatoxin Contamination by Aspergillus flavus

ABSTRACT Aflatoxins are carcinogens produced mainly by Aspergillus flavus during infection of susceptible crops such as maize (Zea mays). Previously, embryo proteins from maize genotypes resistant or susceptible to A. flavus infection were compared using proteomics, and resistance-associated proteins were identified. Here, we report the comparison of maize endosperm proteins from five resistant and five susceptible genotypes, and the identification of additional resistance-associated proteins using the same approach. Ten protein spots were upregulated twofold or higher in resistant lines compared with susceptible ones. Peptide sequencing of these proteins identified them as a globulin-2 protein, late embryogenesis abundant proteins (LEA3 and LEA14), a stress-related peroxiredoxin antioxidant (PER1), heat-shock proteins (HSP17.2), a cold-regulated protein (COR), and an antifungal trypsin-inhibitor protein (TI). The gene encoding one such upregulated protein, PER1, was cloned and overexpressed in Escherichia coli. The overexpressed PER1 protein demonstrated peroxidase activity in vitro. In addition, per1 expression was significantly higher in the resistant genotype Mp420 than in the susceptible genotype B73 during the late stage of kernel development, and was significantly induced upon A. flavus infection, suggesting that it may play an important role in enhancing kernel stress tolerance and aflatoxin resistance. The significance of other identified proteins to host resistance and stress tolerance also is discussed.     

枸杞内生真菌对胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides的拮抗作用及生防潜力

为了明确枸杞内生真菌对胶孢炭疽菌的抑制作用,通过室内抑菌试验和离体试验测定了内生真菌对胶孢炭疽菌的抑制作用及对枸杞炭疽病的防治效果。结果表明,镰刀菌属Fusarium菌株NQ8GII4、NQ8GII7、NQ7GII4和篮状菌属Talaromyces菌株NQ6GIII11对胶孢炭疽菌有明显的拮抗作用。平板对峙试验显示,上述4株枸杞内生真菌具有较强的营养和空间竞争能力,菌株NQ8GII4对病原菌的抑制率高达93.43%。显微观察发现,枸杞内生真菌能缠绕并穿透胶孢炭疽菌菌丝,使胶孢炭疽菌菌丝膨胀崩解。菌株NQ7GII4的培养滤液在浓度为15%时对病原菌菌丝的抑制率达到70.75%,菌株NQ8GII7产生的挥发性物质对胶孢炭疽菌抑制率高达83.44%。离体生防试验结果表明,用拮抗性内生真菌预先占位接种枸杞嫩果及叶片,能有效抑制枸杞炭疽病菌的侵入和病斑的扩展,菌株NQ8GII4 10%培养滤液对枸杞炭疽病的防治效果最强,防效达到了92.54%和95.57%,说明枸杞内生真菌具有很好的生防潜力和应用前景。     

利用酵母双杂交筛选与致病疫霉菌效应蛋白PITG_07586互作的寄主蛋白

 致病疫霉是引起马铃薯晚疫病的病原菌,其分泌的效应蛋白是侵染寄主的重要毒力因子。本研究在致病疫霉转录组中筛选到一个侵染早期表达的效应蛋白基因PITG_07586(GenBank:XM_002904522.1)。该基因全长447 bp,其编码蛋白包含1个信号肽,1个核定位信号序列(RRRRKRRKKKK)。在本氏烟草中,瞬时表达该基因显著促进病原菌侵染。亚细胞定位表明GFP-PITG_07586定位在细胞核中。利用酵母双杂交技术并以PITG_07586为诱饵筛选马铃薯cDNA文库,最终获得3个靶标蛋白。经序列比对分析,这3个靶标蛋白分别是马铃薯POM30蛋白、电压依赖阴离子通道蛋白VDAC以及SRC2类蛋白。研究结果为致病疫霉菌效应蛋白PITG_07586及其靶标蛋白如何调控植物免疫提供重要依据。