野桑蚕scalloped同源基因的克隆和序列分析

Hippo通路与昆虫的生长、发育和变态等过程密切相关,在动物不同物种之间高度保守。scalloped基因是Hippo通路元件Yki的偶联因子之一,参与调控基因的表达。克隆了野桑蚕(Bombyx mandarina)scalloped基因的完整开放阅读框(ORF)及其上下游的部分非编码序列。序列联配分析表明,与家蚕相比,野桑蚕scalloped基因序列存在多处的核酸片段缺失、插入及位点差异。结构域分析表明,野桑蚕Scalloped蛋白与家蚕、黑腹果蝇、小鼠和人的蛋白结构类似,均含有完整的TEAD蛋白家族典型TEA结构域和PDB结构域,但野桑蚕编码蛋白缺失蛋白C末端序列。系统发生树分析表明,昆虫Scalloped蛋白与脊椎动物TEF3可能存在共同的起源;家蚕Scalloped在进化中出现晚于野桑蚕且经历较多遗传选择过程。     

野桑蚕br-c基因的克隆与序列分析

昆虫BR-C(Broad complax)蛋白是一个含BTB结构域和锌指结构域的转录因子,介导蜕皮激素20E和保幼激素JH的信号转导,是昆虫变态发育调控的关键基因之一。研究克隆了野桑蚕br-c基因开放阅读框及其上下游的部分非翻译区序列,并对该基因编码序列进行了特征分析。结果表明:野桑蚕BR-C蛋白具有保守的BTB和ZnF-C2H2结构域,N端含有胞外区、跨膜区和胞内区等结构。聚类分析表明:家蚕与野桑蚕在亲缘关系上最为接近,其BR-C蛋白序列基本一致。     

野桑蚕Hippo通路核心基因的鉴定与序列比较分析

Hippo信号通路在动物生长发育过程中起到关键作用。根据已知的Hippo通路组成基因序列,利用BLAST软件同源鉴定野桑蚕(Bombyx mandarina)转录组中的Hippo通路组成基因序列,利用生物信息学工具(ORFinder、web CD-search tool、Expasy-protparam、EMBL-EBI、MEME)分析蛋白质相对分子质量、等电点、二级结构、保守结构域和保守基序等。利用Clustalx和MEGA 6.0进行同源序列比对并构建系统进化树。在野桑蚕中鉴定了salvador、warts、mats、yorkie和scalloped同源基因,并预测了ORF框和编码蛋白。结果表明,野桑蚕Warts、Sav和Mats与家蚕同源蛋白的一致性均在98%以上,Yki和Scalloped与家蚕一致性分别为89.02%和79.13%。比较两者差异,家蚕Yki、Sd蛋白分别缺失了近WW2结构域和在YAP结合结构域中存在蛋白片段插入,野桑蚕Sd蛋白缺失了核定位信号基序和脯氨酸富集基序之间的铰链区。Yki和Sd可按照物种科属分别聚类,野桑蚕与家蚕聚为一支,表明这些同源蛋白在功能相似的同时,也具有基于物种的功能特异性。本研究为深入研究野桑蚕Hippo通路的作用机制提供理论基础。     

家蚕醛糖1-表异构酶基因的克隆和序列分析

为研究家蚕半乳糖代谢途径,对家蚕醛糖1-表异构酶基因(aldose 1-epimerase,AEP)进行了克隆和序列分析。结果表明:家蚕基因组中存在单拷贝的醛糖1-表异构酶基因,基因ORF框长度为1017bp,由5个外显子组成,编码由339个氨基酸残基构成的醛糖1-表异构酶蛋白。蛋白序列含有一个aldose 1-epimerase超家族结构域,同源鉴定表明其余果蝇等昆虫的醛糖1-表异构酶具有较高序列一致性。进化分析表明家蚕醛糖1-表异构酶基因较其他昆虫经历了更多的进化选择和事件。本研究为研究家蚕半乳糖代谢提供了一定理论基础。     

2份野桑蚕材料线粒体ATPsynthase F0 subunit 6基因的克隆及遗传进化分析

本研究对2份野桑蚕材料(ws-aksq和ws-akhb)线粒体atp6基因进行了克隆和序列分析。克隆结果表明,2株野桑蚕atp6基因ORF框全长678bp,编码225个氨基酸残基。序列联配比对结果表明2株野桑蚕atp6基因之间存在6处碱基的差异。ws-aksq野桑蚕atp6基因与家蚕c108、野桑蚕Qingzhou系、野桑蚕日本系的相似度分别为0.9926、0.9912和0.9690;ws-akhb野桑蚕与上述3者的相似度分别为0.9926、1.0000、0.9676。系统发生分析表明,鳞翅目下7个亚科的昆虫atp6基因分别聚为7枝,2份野桑蚕atp6基因与中国系野桑蚕亲缘关系较为接近,与日本株较远。本研究为深入利用线粒体基因组开展野桑蚕分类及与其它昆虫的遗传进化研究提供了理论基础。     

家蚕中Brown候选基因的克隆及序列分析

Brown是一种色素运输载体基因(ABC transporters),与色素颗粒形成与转运相关,对昆虫的眼色形成有着重要影响.根据果蝇中Brown蛋白氨基酸序列,在家蚕数据库Silk DB中进行相似性搜索,并结合cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得家蚕brown候选基因的cDNA序列,全长1887 bp,开放阅读框(ORF)大小为1797 bp,编码598个氨基酸残基,该基因组DNA含有外显子11个,且起始密码子在第1个外显子内.预测蛋白序列有典型的ABC_ trans和ABC2_ membrane结构域,同源性分析表明,编码的蛋白序列归类至ABC_trans家族中的Brown蛋白亚族.     

家蚕sirtuin家族基因的鉴定及系统发生与表达芯片分析

【目的】鉴于sirtuin家族基因重要而多样性的功能,从家蚕全基因组中鉴定sirtuin家族基因,并进行基因结构、蛋白结构及其理化性质、基因进化、组织表达芯片分析及在不同组织中的定量表达情况分析,为研究家蚕sirtuin家族基因的功能和推动家蚕模式生物系统化的研究奠定基础。【方法】基于家蚕基因组数据库,通过生物信息学手段,利用比较基因组学方法,鉴定家蚕sirtuin家族成员;开放阅读框（ORF）的预测用ORFfinder进行;使用SIM4进行ORF的内含子和外显子的预测;用GSDS和ExPaSy在线工具分别进行基因结构图和蛋白序列理化性质的预测;用CLUSTAL_X软件进行多序列联配及对其二级结构进行分析,并用ESpript进行二级结构作图;使用SMART在线软件进行蛋白功能域预测;MEGA5.0软件用于系统发生树分析;利用已有的家蚕幼虫5龄第3天的芯片数据进行组织表达分析;利用荧光定量PCR技术检测家蚕sirtuin家族基因在5龄第3天幼虫不同组织中的表达情况。【结果】系统分析鉴定了家蚕中存在的5个sirtuin家族基因（Bmsirt2、Bmsirt4、Bmsirt5、Bmsirt6、Bmsirt7）,共分为4类（I、II、III、IV）。5个基因分布在家蚕5条染色体上,均为单拷贝基因。基因结构分析显示5个基因均为多外显子基因。同源比对和系统进化分析发现家蚕的sirtuin家族基因与类群中其他昆虫的同源基因形成明显的直系同源关系且高度同源,同样不含有sirt3。蛋白结构预测发现家蚕的sirt6与其他物种的sirt6蛋白一样含有两个sir2结构域聚在一起。组织表达芯片分析发现,sirtuin家族基因在多个组织中具有转录活性。荧光定量PCR检测结果显示家蚕的Bmsirt4在脂肪体、丝腺中低表达;Bmsirt5在精巢、中肠中高量表达,在脂肪体、血液、丝腺中低量表达,与芯片数据基本一致。【结论】通过全基因组分析,家蚕共有5个sirtuin家族成员,进化上分为4类,且与其他昆虫高度同源,芯片数据和实时荧光定量 PCR 结果基本一致,分析表明组织表达模式具有多样性。     

野桑蚕核糖体蛋白L21基因的克隆及序列分析

[目的]克隆野桑蚕(Bombyx mandaina)核糖体蛋白L21(RPL21)基因并进行半定量分析,为研究RPL21基因在昆虫体内的生物学功能提供参考.[方法]采用RT-PCR克隆野桑蚕RPL21基因序列,并采用半定量PCR分析该基因在野桑蚕4龄幼虫不同组织中的表达情况.[结果]扩增获得的野桑蚕RPL21基因序列全长为586 bp,其包含一个完整的开放阅读框(ORF),长度为480 bp,编码159个氨基酸;预测蛋白的分子量和等电点分别为18 kDa和11.01.序列比对结果表明,野桑蚕与其他12个物种的RPL21基因的相似性介于55.5%~91.6%,其中与致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)RPL21的相似性最低,与家蚕(Bombyx mori)的相似性最高.半定量分析结果表明,野桑蚕RPL21基因在野桑蚕幼虫的中肠、丝腺、脂肪体、血液、睾丸、表皮、卵巢和脑组织中均有表达,且转录水平无明显差异.[结论]野桑蚕RPL21基因进化较保守,在各组织中分布广泛且表达水平稳定.     

野桑蚕核糖体蛋白L21基因的克隆及序列分析（英文）

【目的】克隆野桑蚕(Bombyx mandaina)核糖体蛋白L21(RPL21)基因并进行半定量分析,为研究RPL21基因在昆虫体内的生物学功能提供参考。【方法】采用RT-PCR克隆野桑蚕RPL21基因序列,并采用半定量PCR分析该基因在野桑蚕4龄幼虫不同组织中的表达情况。【结果】扩增获得的野桑蚕RPL21基因序列全长为586 bp,其包含一个完整的开放阅读框(ORF),长度为480 bp,编码159个氨基酸;预测蛋白的分子量和等电点分别为18 k Da和11.01。序列比对结果表明,野桑蚕与其他12个物种的RPL21基因的相似性介于55.5%~91.6%,其中与致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)RPL21的相似性最低,与家蚕(Bombyx mori)的相似性最高。半定量分析结果表明,野桑蚕RPL21基因在野桑蚕幼虫的中肠、丝腺、脂肪体、血液、睾丸、表皮、卵巢和脑组织中均有表达,且转录水平无明显差异。【结论】野桑蚕RPL21基因进化较保守,在各组织中分布广泛且表达水平稳定。     

甘薯花青素合成酶(ANS)基因的克隆及其组织表达模式分析

从NCBI数据库中检索得到甘薯ANS序列,利用同源比对在前期转录组数据库中筛选获得同源序列,通过PCR反应克隆出甘薯ANS基因(IbANS)的c DNA全长序列,进而预测和分析IbANS基因的蛋白质序列,同时对其在不同甘薯品种的不同组织进行了实时定量PCR分析。结果表明,该c DNA具有最大开放阅读框(ORF),共1 086个碱基,编码362个氨基酸残基;ANS蛋白为亲水性蛋白质,不存在信号肽;保守结构域预测分析表明,该基因编码的蛋白具有典型的ANS蛋白功能结构域,属于2OG-Fe II_Oxy双加氧酶超家族;系统进化树分析显示,甘薯ANS与三浅裂野牵牛亲缘关系最近;荧光定量PCR结果表明,IbANS在紫心甘薯块根中高表达。研究结果可为进一步阐明IbANS基因在紫心甘薯块根中的形成及累积机制提供理论基础。     

家蚕BmHsp19.5基因的鉴定及在滞育卵中的表达分析

基于前期转录组学研究结果,从家蚕滞育卵和发育蚕卵中筛选出差异表达基因家蚕BmHsp19.5.为了进一步了解该基因的序列信息、表达特征以及在家蚕卵滞育过程中的功能,本文采用基因克隆、生物信息学方法以及qPCR检测等技术手段对该基因进行分析.结果表明:家蚕BmHsp19.5基因的ORF(open reading frame)框全长504 bp,共编码167个氨基酸,其蛋白的理论相对分子质量为1.95×10⁴.该蛋白65-157位氨基酸为Hsp20功能结构域,符合小热激蛋白家族结构特征.该基因在滞育卵和非滞育卵中表达量存在显著差异,在滞育卵中呈上调表达,且在第3 d达到最大值,推测该基因与滞育过程有关,可能在家蚕滞育进入时发挥了重要作用.     

“桑蚕乳酸脱氢酶基因的克隆与表达分析

为了研究野桑蚕乳酸脱氢酶基因的功能,选择野桑蚕5龄3日幼虫的组织及不同发育时期的个体,利用 PCR 技术对野桑蚕乳酸脱氢酶基因进行克隆,得到野桑蚕乳酸脱氢酶基因开放阅读框长度为996 bp,没有内含子,只有1个外显子。该基因编码的蛋白含有331个氨基酸残基,等电点为6·76,分子量为36·35 kD。氨基酸序列分析表明,该蛋白高度保守,亚细胞定位预测分析表明该蛋白主要定位于细胞质中。转录表达分析表明,该基因在野桑蚕5龄3日幼虫的组织（马氏管、中肠、表皮、脂肪体、丝腺、血液、精巢和卵巢）及不同发育时期的个体（卵、幼虫、蛹和蛾）中均有表达,且表达量趋于一致。表明乳酸脱氢酶基因在野桑蚕的生命活动中可能具有重要的生理功能。     

家蚕drk基因的克隆及生物信息学分析

受体下游激酶( downstream of receptor kinases,DRK)是JAK/STAT信号途径的重要组成成员,在信号传导中发挥重要作用.为了研究家蚕的JAK/STAT途径,本研究通过RT - PCR克隆了家蚕的drk基因(Bmdrk)的cDNA,序列测定结果显示:Bmdrk开放读码框为639 bp,编码212个氨基酸残基.结构分析显示:BmDRK由SH3和SH22种结构域形成了SH3 -SH2 -SH3的结构形式.基于SH3 - SH2 -SH3结构域序列的进化分析指出昆虫DRK蛋白序列高度同源,结构与基本功能相似.DRK在进化过程有侧翼1个SH3结构域丢失的事件发生.研究结果为探讨Bmdrk在JAK/STAT信号途径中的作用方式以及drk基因进化提供了新的线索.     

辣椒推定WRKY基因cDNA的生物信息学分析

[研究目的]该研究在利用同源克隆法分离到一个推定的辣椒WRKY转录因子的基础上,采用多种生物信息学方法对该序列进行特征分析和功能预测,以获得该基因及其编码蛋白更多的功能提示.[主要方法]应用Blast、ORF Finder、Wolf Psort、DNAMAN等软件或数据库,进行序列的相似性比较,开放读码框预测、保守域和编码蛋白质的功能等分析.[研究结果]所得到的序列是WRKY基因家族中的一个全长cDNA序列,与其它植物具有较高的同源性,该基因编码的蛋白具有WRKY保守结构域和锌指结构特征,亚细胞定位预测结果显示该蛋白定位于细胞核,具有WRKY转录因子的三维结构特征.[结论]所获得序列为辣椒WRKY基因家族的新成员,具有WRKY转录因子家族的基本特征,进化上有高度保守性.可能在调控植物的生长发育以及干旱、高温、高盐等逆境应答过程中起重要调节作用.因此.这一辣椒WRKY新基因有进一步研究的价值.     

家蚕ga Pdh基因的克隆及分析

从家蚕EST数据中检索到果蝇（Drosophila melanogaster）甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（AAN09371）氨基酸同源序列,用seqMAN延伸,电子克隆家蚕gapdh的cds,用PCR克隆家蚕gapdh基因序列．家蚕甘油醛-3-磷酸脱氢酶（bmga pdh）基因长1485 bp（NO：DQ202316）,包括5′UTR 221 bp,3′UTR 265 bp和完整的999 bp ORF框,编码333个氨基酸残基．用BLASTN进行同源性分析表明与果蝇的同源性为91％,与鹌鹑胚胎纤维细胞序列同源性最差,为71％．bmgapdh基因在家蚕基因组中是单拷贝的,包含3个外显子．3′UTR序列包含AATAA终止信号和Poly（A）．推导的氨基酸序列N端包含与NAD^＋结合的保守结构域：ASCTTNCL．     

野桑蚕和家蚕para型钠离子通道蛋白基因结构域Ⅱ的克隆与突变

根据家蚕钠离子通道蛋白基因部分序列(GenBank登录号:EF521818)设计特异引物,通过RT-PCR方法,克隆了编码吴江野桑蚕(YWJ)和家蚕品种大造的钠离子通道蛋白结构域Ⅱ 的cDNA 片段,2个片段长均为1 135 bp,编码378个氨基酸,没有发现与击倒抗性(knock down resistance,kdr)相关的点突变,但发现2个点突变I164L和V196A,推测可能这2个突变与野桑蚕对溴氰菊酯的抗性有关.     

陆地棉GhWOX4转录因子的克隆与生物信息学分析

采用反转录PCR(简称RT-PCR)技术从陆地棉(Gossypium hirsutum L.)中克隆获得1个WOX基因,命名为Gh WOX4(NCBI登录号:KX900572)。序列分析显示,Gh WOX4的开放阅读框为657 bp,编码含218个氨基酸残基的蛋白,具有典型高度保守的同源异型HD结构域,属于WOX转录因子家族。生物信息学分析表明,该基因蛋白相对分子量为25.19 ku,等电点为10.04,为不稳定蛋白。二级结构以无规则卷曲为蛋白最大量的结构元件。与其他植物同源基因序列比对显示,其同源区域主要集中在同源异型HD结构域。系统进化树分析表明,Gh WOX4属于Ⅰ类家族成员,与陆地棉Gh_D01G1055、拟南芥At WOX4和可可树Tc WOX4等亲缘关系最近,处于同一个进化分支,推测其可能与之前报道的拟南芥WOX基因类似,参与植物维管束及花器官发育。     

高羊茅光敏色素A基因FaPHYA的克隆与分析（英文）

以高羊茅转录组学测序获得的PHYA序列为模板,同时结合3’RACE和5’RACE方法从高羊茅中扩增出PHYA基因的全长c DNA序列,命名为Fa PHYA。该序列c DNA全长3 983 bp,具有完整的开放阅读框(ORF,293~3 682 bp),编码蛋白为1 129个氨基酸,Fa PHYA的N端由GAF和Phytochrome结构域组成;C端包括2个重复的PAS结构域,1个组氨酸激酶A结构域,1个类似组氨酸激酶的ATP酶结构域。对编码蛋白氨基酸序列的同源性分析表明,Fa PHYA与单子叶植物PHYA蛋白的氨基酸序列一致性较高,同源一致性水平达85%以上,亲缘关系较近。与双子叶植物的PHYA蛋白的氨基酸序列一致性较低,亲缘关系相对较远。     

小菜蛾PxALP1基因的克隆与生物信息学分析

小菜蛾是一种世界性分布的重要农业害虫,也是最早对无公害生物农药Bt毒素产生抗性的种群之一。已有研究显示,在多种昆虫体内碱性磷酸酶是Bt毒素蛋白的直接受体,但在小菜蛾中,碱性磷酸酶的编码基因及其生物学功能尚极少有人研究。本研究克隆了小菜蛾PxALP1基因的开放阅读框(ORF),并推导出其氨基酸序列。经SMART网站分析,发现该蛋白质在第79~513位氨基酸残基区域存在典型的alk PPc(alkaline phosphatase homologues)结构域;经SWISS-MODEL同源模建预测蛋白质三级结构,发现该蛋白质具有典型的跨膜结构域,说明它是一个潜在的膜结合碱性磷酸酶。通过进化树分析,发现小菜蛾PxALP1与鳞翅目昆虫家蚕膜结合碱性磷酸酶的亲缘关系最近,BLAST比对发现PxALP1与家蚕Bm Alpm在氨基酸序列上的一致性(identity)为36.3%,相似性(similarity)为50.3%,说明二者之间具有较好的进化保守性。