抗病和感病泡桐无性系组培苗对嫁接传染植原体的不同反应

用感染了植原体并表现典型丛枝症状的组培苗作接穗或砧木，在无杂菌条件下嫁接７个表现不同田间抗性的无性系健康组培苗，并用ＤＡＰＩ荧光显微镜和１６ＳｒＲＮＡ基因扩增（ＰＣＲ）技术检验嫁接传病效果。Ｃ１２５和ＸｕＨ表现出较强的特异性接种诱发坏死反应，ＺＨ和Ｔ３５０２８坏死反应中等，ＱＬＭ、Ｃ０２０和Ｃ１６１的坏死反应较弱。培养基中添加植物生长调节剂（６ＢＡ或ＮＡＡ）可降低坏死程度，提高嫁接成功率，水杨酸处理或去掉健株砧木叶片和根系皆加重坏死反应程度。用病接穗嫁接抗病的ＱＬＭ无性系时，用ＰＣＲ检测到侵染砧木的植原体，但未表现丛枝症状，而将此无性系健康接穗嫁接到丛枝病砧木上时可诱致典型丛枝症状，从而表现出与根系和成熟叶相关的抗性反应。除Ｃ１２５外，其余６个无性系皆被嫁接传染，其继代培养表现出差异不显著的丛枝症状，其韧皮部金黄色自发荧光随着症状的加重而累积，也与抗病性有一定的联系。     

北京市丰台区主栽枣品种对枣疯病抗性试验

采用以感染枣疯病的枣树作砧木嫁接健康休眠接穗的方式,对丰台区8个主栽枣品种进行了抗病性鉴定,并应用DAPI荧光显微方法和PCR方法对接穗进行了枣疯病植原体检测.结果表明,8个供试品种均能被感染,并表现丛枝症状,对枣疯病植原体均无免疫性,其中金芒果枣和冬枣为易感痛品种,尜尜枣和京枣39为相对抗性品种.     

丛枝病植原体侵染对泡桐组培苗组织内H2O2产生的影响

用保存的不同泡桐无性系染病和健康组培苗为试材,对染病苗、机械损伤、嫁接接种和健康组培苗组织中H2O2及过氧化物酶的变化进行研究.用DAB组织染色方法对H2O2组织定位结果显示,在未损伤情况下多数染病泡桐苗和健康苗H2O2积累皆较少.机械损伤后,病与健苗皆出现H2O2过量积累,其中健苗强于病苗.在维管束部位,重症苗POD活性最强,轻症苗次之,无症和健康苗活性较低;而且所有苗在脉间叶肉组织POD活性都明显低于叶脉组织.用病接穗嫁接健康泡桐砧木的早期(3天以内)似乎与损伤反应类似(包括POD和H2O2产生);6天后损伤反应减弱.嫁接接种成功的组合至20天,在嫁接接口处仍维持高的H2O2释放和强POD活性,并且砧木主茎和部分叶片出现系统性POD活性增强和H2O2积累.采用KI/淀粉试剂对H2O2组织定位结果显示:在健株主茎切片中皮层和髓细胞表面、木质部成熟导管管壁有较强的H2O2释放;而病株的相应部位产生量较少.在健康切片测定液中加入病主茎横切片可诱导健康切片H2O2积累量增加.用不同浓度的H2O2处理染病泡桐丛枝茎段外植体1 h,在25～100 mmol·L-1浓度范围内能明显缓解组培苗丛枝症状.抗坏血酸和低通气环境处理也有减轻病苗丛枝症状的作用.不同泡桐品系在活性氧代谢上的差异与其对植原体的抗性存在密切关系.     

我国部分枣树品种(系)的枣疯病抗性鉴定

收集了我国部分地区的不同枣树品种(系)的休眠期健康接穗材料,于2009年和2010年的4-6月嫁接到枣疯病砧木上,定期检查接穗发病状况,并采用PCR技术检测植原体感染.结果显示,不同枣树品种对枣疯病的抗性差异明显,根据接穗发病早晚、症状轻重、发病率和病情指数,将测定品种分为5个类型,其中高度抗病品系2个、中度抗病品系4个、一般抗病品系15个、感病品系7个、高度感病品系6个.高抗品系(交城骏枣、唐县和太原壶瓶枣)嫁接当年萌生枝条枣疯病无明显症状或嫁接早期无症状,后期症状较轻.嫁接到病树遮阴部位的接穗发病程度要重于向阳部位;存放期长和嫁接时间早的接穗,易诱发抗性品系发病.巢式PCR能检测到无症抗病接穗内低浓度植原体侵染.与以往所采用的昆虫自然传染和病皮或病枝嫁接到待鉴定的砧木品系上鉴定抗性技术相比,该方法具有接种强度大、诱导发病快、测定方法简便等优点,但对一般抗性、整株或成年株抗性、抗介体传毒等类型的抗性鉴定有局限性.     

以tuf基因为靶标的5种16SrⅠ组植原体环介导恒温扩增技术

【目的】建立一种能够特异性检测和鉴定16SrⅠ组植原体的环介导恒温扩增技术,实现16SrⅠ组植原体的快速检测。【方法】以植原体tuf基因作为靶标,通过序列比对,设计多组具有特异性的LAMP引物组,筛选出一套适用于16SrⅠ组植原体的特异性检测体系。以16SrⅡ组、16SrⅤ组、16SrⅩⅨ组植原体样品按照此检测体系进行反应,来验证其特异性;同时将稀释后的感病组织样品同步进行PCR和LAMP检测,以确定其检测灵敏度。对来自不同省市的6份田间样品以及9份组培样品进行检测,以验证其检测的稳定性。【结果】16SrⅠ-LAMP在恒温63℃条件下40 min内完成扩增,能检测5种分别引起泡桐丛枝、苦楝丛枝、桑树萎缩、莴苣黄化和长春花绿变病的16SrⅠ组植原体,不能检测其他组植原体包括16SrⅡ组的花生丛枝、甘薯丛枝、臭矢菜丛枝、16SrⅤ组的枣疯病、红花槐丛枝、樱桃致死黄化和16SrⅩⅨ组的板栗黄化皱缩植原体。通过在反应液中加入钙黄绿素肉眼判断绿色为阳性结果,褐色为阴性结果,与用荧光定量设备进行判读扩增曲线的结果一致。相比于PCR检测,16SrⅠ-LAMP检测的灵敏度提高了8倍;16SrⅠ-LAMP能够快速检测出来自不同区域的田间泡桐发病样品、感病泡桐组培苗和嫁接传病脱毒苗。【结论】以tuf基因作为靶标,建立能同时检测5种16SrⅠ组植原体的环介导恒温扩增技术,具有高效、特异、操作简便、检测时间短及成本较低等优点,适合于基层和现场检测。     

根癌农杆菌对感染植原体的泡桐组培苗症状的影响

采用含有激素合成相关基因的根癌农杆菌，伤口接种已感染植原体的泡桐丛植组培苗和健康组培苗，结果发现对丛植苗的致瘤能力明显低于健康对照苗，且被接种病苗的丛枝症状缓解，从健苗获得的T-DNA转化泡桐瘤组织细胞能在无激素培养基上稳定生长和连续继代培养2年以上，说明瘤组织细胞自身已获得了细胞分裂素和生长素合成能力，根据已报道的根癌农杆菌株系pTil5955T-DNA的异戊烯基转移酶基因（ipt)的保守序列，设计了一对引物（CYT和CYT′），用多聚酶链式反应（PCR）扩增了我国杨树致瘤农杆菌ipt基因部分序列（427bp片段），也从遗传转化的两个泡桐无性系瘤组织At-ZH和At-T35扩增出此特异片估，从而进一步肯定了T-DNA已被整合到泡桐的染色体上表明泡桐易于通过Ti质粒载体途径进行基因转移操作，但用此引物未能从泡桐、甘薯健株和感染植原体的组培病苗扩增出相应的427bp特异片段，当用此遗传转化瘤组织嫁接病苗时，可减轻从枝症状的严重度，延长病苗的存活时间和诱导病株生根，这进一步证实了泡桐在与植原体相互作用过程中激素代谢发生了变化。     

寡核苷酸管芯片技术检测和鉴别我国不同组植原体

[目的]不同组植原体检测和鉴别的特异性探针已有报道,为了筛选出适合于我国不同组植原体检测和鉴别的特异性探针,建立管芯片检测和鉴别植原体技术,并对我国发生的疑似植原体病害进行鉴别。[方法]通过PCR扩增结合管芯片杂交技术,对收集到的15种植原体侵染的植物样品及其健康对照进行检测和鉴别。[结果]建立了管芯片检测和鉴别植原体技术体系。15种病害样品中,13种获得显著的阳性杂交信号,并且所有的健康对照都呈现为阴性。13种植原体病害依16Sr DNA直接测序可分为16SrⅠ、Ⅱ、Ⅴ、XIX四组植原体。在所有探针中,植原体的通用探针(Pp-502)可以检测到所有确定的植原体样品。16SrⅠ组特异性探针(PpⅠ-465)可以确定16SrⅠ组的泡桐丛枝、苦楝丛枝、桑树萎缩和莴苣黄化4种植原体样品。16Sr II组特异性探针(PpⅡ-629)仅可以确定16Sr II组的花生丛枝、甘薯丛枝和臭矢菜丛枝3种植原体样品。但16Sr V组的枣疯病、樱桃致死黄化和重阳木丛枝及16Sr XIX组的板栗黄化皱缩植原体与其他组专化性探针皆有明显的交叉杂交信号。相比于PCR扩增的凝胶电泳检测,管芯片检测的灵敏度提高了1 000倍。对疑似植原体病害的诊断结果显示河南濮阳的红花槐丛枝的病原应为16Sr V组植原体,福建福州的长春花黄化丛枝应为16SrⅠ组植原体;而北京戒台寺牡丹黄化皱叶和内蒙古包头柳树丛枝未出现任何植原体专化的杂交信号。[结论]管芯片杂交技术作为一种检测和鉴别植原体的方法,可应用于我国植原体病害调查和诊断,并为植原体的鉴别和分类提供可靠的依据。     

中华金叶榆硬枝低接和扦插繁殖试验

对中华金叶榆进行嫁接和扦插繁殖试验。结果表明:采用插皮接及劈接和腹接、0.8 cm粗的接穗、涂刷果树专用保湿剂、原地砧苗嫁接或植砧后第40 d嫁接、白榆砧木,嫁接效果良好,成活率均达到92%以上。用质量浓度为100 mg.L-1的IBA溶液处理硬枝,插穗的生根率只有13%,其它激素处理生根效果更差。     

圆齿野鸦椿嫁接愈合过程的显微观察及嫁接体酶活性的变化分析

【目的】观察圆齿野鸦椿接穗在嫁接愈合过程中的显微结构,分析嫁接体酶活性的变化情况,为圆齿野鸦椿优良无性系苗木的嫁接繁育提供理论依据与实践指导。【方法】2020年7月底,以野鸦椿为砧木、以圆齿野鸦椿为接穗进行嵌芽接。于嫁接后不同时间剪取嫁接体1.5 cm左右的茎段,对其进行细胞学观察,并测定其酶活性。【结果】圆齿野鸦椿嫁接愈合过程可分为3个时期：嫁接后第0～10天,为砧穗切口隔离层及愈伤组织形成期;嫁接后第11～20天,为砧穗结合部愈伤组织分裂增殖与连接期;嫁接后第21～26天,为砧穗结合部愈伤组织分化形成维管组织期。嫁接后第0～10天,砧木切口处隔离层与愈伤组织开始形成的时间分别为嫁接后第3天和第5天,比接穗切口处隔离层与愈伤组织开始形成的时间分别提早3和5 d;嫁接后第14天时,砧穗结合部形成愈伤组织桥,隔离层消失;嫁接后第20天时,砧穗结合部构成形成层环;嫁接后第26天时,可见砧穗结合部位形成层细胞分化出新的导管和筛管,标志着嫁接体成活。此后,新分化出的维管束进一步分化,形成维管束混合群体。嫁接愈合过程中嫁接体酶活性的变化趋势为：嫁接后第0～10天,过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶...     

温度处理和茎尖培养结合脱除泡桐丛枝病类菌原体（MLO）

将患有丛枝病的泡桐组培苗进行温度处理，结合茎尖培养用来脱除病原ＭＬＯ。结果表明，在４５℃下，病茎段２４—４８小时内脱水枯死；在４０℃下３周内病苗黄化枯萎；但在３０℃和２５℃处理的茎段萌发新枝条仍表现典型丛枝症状。而在３５℃下处理的茎段，１周后，新生长茎叶外观恢复正常，继续处理至８０天，植株仍能正常生长。组织经ＤＡＰＩ染色后荧光显微镜检查显示出在３５－４０℃下处理的病苗体内ＭＬＯ４周之内的变化和降解情况。分别剪取３５℃下处理２９、３３、５５和８０天的组培苗０．５ｃｍ的茎尖，转入ＭＳ培养基或改良的ＭＳ培养基上，在２５℃下培养，长成的组培苗一直生长正常。荧光显微镜和电镜检察结果均显示病原ＭＬＯ已被脱除。     

Seasonal variation of paulownia witches’-broom phytoplasma in paulownia trees and distribution of the disease in the Tohoku district of Japan

Seasonal variation of paulownia witches’-broom (PWB) phytoplasma within different organs (leaves, branch and trunk bark and roots) in paulownia trees was investigated by the amplification of a PWB-specific DNA fragment by the polymerase chain reaction (PCR). In leaf samples, PWB phytoplasma was first detected in June and the incidence gradually increased. On the other hand, the PWB was detected at relatively low incidence in branch bark, trunk bark and roots and the incidence did not change among seasons. A survey of PWB in 27 fields in the Tohoku district of Japan showed that malformed flower buds were observed in paulownia trees in almost all of the fields. PWB-phytoplasma was also detected by PCR from paulownia trees in almost all of the fields in Iwate and Fukushima Prefectures. The frequencies of trees in which phytoplasma was detected by PCR were higher than those in which symptoms were observed. These results indicated that PCR amplification of a PWB-specific DNA fragment is an effective tool for practical diagnose and that PWB is widely distributed in the Tohoku district of Japan.     

我国不同地区枣疯病发生动态和主导因子分析

对我国陕西清涧、佳县 ,河南濮阳 ,山西临县、太原枣品种圃 ,安徽 ,浙江和北京等部分枣树传统分布区的枣疯病进行了典型调查研究。通过不同地区枣疯病发生历史和危害现状的比较分析 ,初步摸清了各地区枣疯病发生的不同特点和为害状况 ;发现根蘖苗繁殖方式仍是目前多数枣产区病园内苗期和幼树发病以及病害从病区传入无病区的主要原因。不同枣树品种对枣疯病的田间抗性存在明显差异 ;局部空气污染以及施肥等枣树管理措施不当会导致枣树的抗病性降低。用DAPI荧光显微镜和PCR技术检测植原体结果显示 ,病园内存在比例不等的无症带菌树 ;由此判断 ,高比例的无症带菌苗的人为传病及不利于枣树生长的环境应力是导致许多地区病害加重和爆发流行的主导因素     

从我国20种感病植物中扩增植原体16S rDNA片段及其RFLP分析

本研究收集了２０种感染植原体的植物材料,从患病材料和相应健康植物组织中提取总ＤＮＡ用作ＰＣＲ模板,选择两对通用引物进行巢式ＰＣＲ,扩增植原体的１６ＳｒＤＮＡ片段,回收扩增产物,通过限制性酶切片段长度多态性（ＲＦＬＰ）分析进行分类。２０种患病植物材料中的植原体有１３种属于翠菊化种,２种属于白对黄化种,３种属于花生丛枝种,２种属于三叶草丛生种。     

陕西清涧县枣疯病发生和危害调查及防治建议

根据对陕西清涧县枣疯病发生特点和危害状况进行调查和分析,提出了把好种苗带菌关、积极预防介体叶蝉传病、稳步地开展枣疯病治疗试验和示范、坚持因地适时清除病株或修除病枝,正确处理好枣果产量与枣疯病防治的关系等具体病害防治措施,以及黄土高原地区枣疯病综合治理原则。     

Molecular characterization of a phytoplasma associated with Euonymus bungeanus witches’ broom in China

Euonymus bungeanus plants exhibiting symptoms of abnormal branches, small leaves and phyllody, which is indicative of E. bungeanus witches’ broom (EbWB) disease, have recently been found in Beijing, China. A phytoplasma from symptomatic E. bungeanus plants was identified by 16S rRNA polymerase chain reaction (PCR) using the phytoplasma‐specific universal primer pair R16mF2/R16mR1. Inoculation of healthy E. bungeanus plants by grafting with diseased scions was also performed. The rp and secY genes of the EbWB phytoplasma were cloned and sequenced as was the 16S rRNA gene. Sequence and phylogenetic analyses of 16S rRNA, rp and secY genes indicated that the phytoplasma associated with E. bungeanus belongs to the 16SrV‐B, rpV‐C and secY‐C subgroup, the same subgroup as the jujube witches’ broom (JWB) phytoplasma that is widely distributed among jujube trees in China. Comparative analyses based on virtual restriction fragment length polymorphism (RFLP) showed that the EbWB phytoplasma is more closely related to another 16SrV‐B subgroup strain: RPWB (Robinia pseudoacacia witches’ broom). To the best of our knowledge, this is the first report of a witches’ broom phytoplasma in E. bungeanus in China, and the findings add a new cultivated plant species to the already broad natural host range of 16SrV‐B subgroup phytoplasmas.     

泡桐丛枝病类菌原体(MLO)病原传染长春花研究初报

菟丝子(Cuscuta spp.)是一种寄生植物,利用菟丝子为介体可以将植物病毒或类菌原体(mycoplasma like organism)从一株植物传染到另一株植物上。杨一朗陈景耀分别用大豆菟丝子和南方菟丝子为媒介成功地将甘薯丛枝病从甘薯传到长春花上,产生花器叶化、侧枝丛生病状。