油菜种子蛋白质提取方法研究

通过对比改进的Tris-HCl法、酚提取-甲醇/醋酸铵沉淀法、TCA/丙酮沉淀法和DTT/丙酮法4种方法提取油菜未成熟种子蛋白质,以期找到合适的蛋白质提取方法。结果表明,TCA/丙酮沉淀法和DTT/丙酮法所得蛋白质沉淀较多,颜色亮白,效果较好。进一步通过定量分析及双向电泳图谱的比较分析表明,TCA/丙酮沉淀法在2-DE图谱上蛋白质点较多,分布均匀,图像清晰,而DTT/丙酮法相对于本实验中TCA/丙酮法检测到较少的蛋白质点外,2-DE图谱上有明显的纵条纹。因此TCA/丙酮沉淀法为提取油菜种子中蛋白质的最优方法。     

橡胶草胶乳蛋白双向电泳方法的建立

采用Tris饱和酚法和TCA/丙酮沉淀法提取橡胶草(Taraxacum Kok-saghyz Rodin)胶乳蛋白质,并建立蛋白双向电泳方法.结果表明,TCA/丙酮沉淀法得到的双向电泳图谱横条纹较多,背景模糊,得到约446个蛋白质点;Tris饱和酚法提取样品双向电泳的聚焦效果较好,图谱显示约630个蛋白点,其中包括较丰富的低分子量蛋白.     

茶树总蛋白质提取方法及双向电泳体系的建立

为探索适用于茶树叶片蛋白质组学研究的双向电泳技术体系(2-DE),比较三氯乙酸(TCA)/丙酮沉淀法和改良酚抽法2种不同总蛋白质提取方法、不同蛋白上样量对2-DE的影响。结果表明:改良酚抽法更适合茶树总蛋白质的提取;采用1.5 mg的蛋白质上样量,最终可获得蛋白质点较多、背景清晰、分辨率较高的双向电泳图谱,为进一步深入开展茶树蛋白质组学的研究奠定了基础。     

龙眼胚性愈伤组织γ-ECS基因的克隆及表达分析

为探讨红麻细胞质雄性不育形成的分子遗传机理，以红麻细胞质不育系L23A和保持系L23B开花期叶片为材料，对其红麻蛋白质双向电泳体系进行研究，比较TCA/丙酮和酚抽提法提取红麻叶片总蛋白，同时优化上样量和样品制备方法，建立了红麻蛋白质的双向电泳技术体系和凝胶成像染色法，利用PDquest软件分析双向电泳凝胶的相关差异蛋白。结果表明：（1）TCA/丙酮法比酚抽提法更适合于ISO-DALT电泳系统；（2）TCA/丙酮提取的红麻叶片粗蛋白平均产量为31.67 mg/g，是酚抽提法的1.77倍, 但裂解效率为160 mg/g，是酚抽提法的36％；（3）每根胶条最佳上样量为300 μg；（4）考马斯亮蓝G-250比R-250以及银染色法效果更佳，在17 cm×17 cm的凝胶上平均可获得708个蛋白质点。本研究建立的红麻细胞质雄性不育系与保持系总蛋白提取方法及双向电泳体系，可为揭示红麻雄性不育分子机理奠定基础。     

不同沉淀剂对酚抽法提取植物蛋白质效果比较分析

酚抽法已经逐渐成为植物蛋白质组研究中通用的蛋白质提取方法,但在各种改进酚抽法中,应用到的沉淀试剂各不相同,致使蛋白沉淀得率、纯度和沉淀时间也各异,本研究以热带植物橡胶树叶片、胶乳和海马齿叶片为研究材料,在过饱和硫酸铵甲醇溶液、醋酸氨甲醇溶液和丙酮溶液沉淀剂下对比蛋白提取的效果,通过单向电泳检测、胶图质量分析、质谱鉴定、蛋白沉淀时间和得率比较,发现3种沉淀剂提取的蛋白样品1-DE图谱显示的蛋白条带数量均较多,但醋酸铵沉淀法提取蛋白图谱有条纹不清晰现象。得出结论：丙酮沉淀法对橡胶树叶片和胶乳蛋白质的提取率较高,硫酸铵沉淀法对海马齿叶片蛋白质提取率较高。过饱和硫酸铵甲醇溶液和丙酮沉淀剂提取的蛋白质质量较高,所得蛋白图谱背景清晰,质谱鉴定蛋白质信息量大。研究结果可优化提取高质量植物蛋白质的方法,并有望为顽拗类植物蛋白质组学研究提供参考。     

槟榔黄化病叶片差异表达蛋白筛选与鉴定

以相同品种,树龄、长势一致的黄化病槟榔和健康槟榔叶片为试材,采用TCA(三氯乙酸)/丙酮法制备蛋白质样品,结合双向电泳-质谱结合技术,分析病原菌-槟榔互作后差异表达蛋白。结果表明,双向电泳SDS-PAGE胶中黄化病槟榔叶片与健康叶片平均蛋白质点数分别为1081个和960个,其中差异明显的点34个。选择5个差异蛋白点进行质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定,并进行数据库查询,结果鉴定了2个蛋白质,分别为核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶和蕈状支原体高同源蛋白,这些蛋白质可能参与了槟榔黄化病发生和发展过程。另外3个蛋白点在数据库中未检索到同源性和匹配率较高的蛋白质,认为是未知蛋白。     

几种不同提取方法对小麦叶片总蛋白双向电泳的影响

为探索小麦叶片蛋白质提取的最优方法,以普通小麦品种石4185的叶片为材料,研究了三氯乙酸/丙酮法、裂解液法、尿素/硫脲法、KCl-醋酸铵甲醇法等四种不同蛋白质提取方法对小麦叶片蛋白双向电泳图谱的影响.结果表明,三氯乙酸/丙酮法获得的蛋白点形状规则、清晰,且重复性好;裂解液法拖尾现象较轻,但蛋白点数少且欠清晰,重复性也不如前者;尿素/硫脲法的蛋白点数很少,也较为弥散,且有明显的拖尾现象;KCl-醋酸铵甲醇法使大量蛋白丢失,蛋白点数非常少,且上部竖纹干扰较重.因此,三氯乙酸/丙酮法是提取小麦叶片蛋白的较优方法.     

适用于大豆叶片蛋白质组分析的双向电泳最佳条件研究

针对大豆叶片中蛋白含量较低,含有大量色素、酚类、醌类等次生代谢产物干扰蛋白质双向电泳分离效果的问题,以大豆叶片为材料,对样品制备、蛋白质裂解液组分、等电聚焦(IEF)参数等条件进行研究.结果表明:采用TCA/丙酮法提取大豆叶片总蛋白,裂解缓冲液为9 mol·L-1尿素,2 mol·L-1硫脲,4%CHAPS.100 mmol·L-1DTT,0.5%Bio-Lyte,IEF等电聚焦条件为24 000Vh时,2-DE图谱分离到的蛋白点效果最好.初步建立了一套适用于大豆叶片蛋白质组分析的双向电泳(2-DE)体系.     

基于多反应监测质谱技术的水稻叶片蛋白绝对定量方法

【目的】建立水稻叶片蛋白的多反应监测(MRM)质谱绝对定量方法。【方法】水稻叶片蛋白经含1.0%十二烷基硫酸钠(SDS)的磷酸盐(PBS)缓冲液提取,丙酮沉淀除杂纯化、胰蛋白酶消化,酶解液经液相色谱分离,MRM质谱监测,外标法定量。【结果】向提取缓冲液中加入1.0%SDS可增强水稻叶片中16种靶蛋白和总蛋白质的提取效果;不同有机试剂处理,总蛋白质沉淀量存在显著差异(P<0.05),沉淀能力从强到弱依次为乙腈>丙酮>异丙醇>甲醇>乙醇;对于16种目标蛋白,总体以丙酮沉淀效果最好,其次是异丙醇和乙腈,甲醇和乙醇效果较差。该方法线性范围均达到3个数量级,定量限为0.1~2.5 nmol/L,灌浆期16种水稻叶片蛋白质含量为6.0~2818.1μg/g,相对标准偏差均小于14%。【结论】SDS可显著提高水稻叶片蛋白提取效果,采用丙酮或乙腈可获得较好的蛋白沉淀效果,但不同蛋白质略有差异。结合MRM质谱监测技术可实现水稻叶片蛋白的绝对定量,方法线性范围宽、敏度高、重复性好。     

甘蓝型油菜叶片蛋白质双向电泳体系优化

比较了甘蓝型油菜叶片总蛋白质提取的2种不同方法,探讨了叶片蛋白质分离的双向凝胶电泳技术优化方案.结果表明:采用TCA/丙酮法较Tris-Cl法更适合蛋白质提取,选择pH为4～7的固相胶条和分离胶浓度为12％的聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)能够使蛋白质得到充分分离,采用考马斯亮蓝G250染色剂进行2次染色,可提高2-DE分辨率和实验解析度,优化后的双向电泳体系能够分离出2000个以上的蛋白点,并且重复稳定性好.     

茶树蛋白质双向电泳样品制备技术研究

为探索一种适用于茶树蛋白质双向电泳的样品制备方法,研究比较了TCA/丙酮沉淀法、改良的Tris-HCl抽提法,以及酚-甲醇/醋酸铵沉淀法3种植物蛋白质样品制备方法。结果表明,改良的Tris-HCl抽提法较适合于茶树蛋白质双向电泳的样品制备。该改良方法制备的茶树蛋白质样品经双向电泳分离,可获得1117±9.89个蛋白质点,其中大部分蛋白质的等电点集中在pI5~7之间,相对分子质量集中在15.00~95.00kD之间,背景清晰且蛋白质得率较高,能满足茶树蛋白质组学研究的需要。     

冬小麦叶片抗旱蛋白质组双向电泳技术体系的优化

为给小麦抗旱蛋白质组学研究提供技术支撑,以两个抗旱性不同的冬小麦品种周麦18和晋麦47三叶期幼苗为材料,比较分析了PEG胁迫处理后两种不同蛋白质提取方法TCA/丙酮法和磷酸钠缓冲液研磨法对IEF/SDSPAGE双向电泳的影响,并在IPG胶条pH范围、蛋白质上样量和SDSPAGE胶浓度等方面进行了探索与优化。结果表明,采用TCA/丙酮法提取叶片全蛋白,选用17 cm、pH 4~7的IPG线性胶条,在上样量为150 μg·胶条_-1,以及12%SDSPAGE胶浓度下进行双向凝胶电泳,蛋白质能够更好地被分离,2DE图谱上可分辨出约400个蛋白点。利用该体系比较了PEG胁迫后两个品种双向电泳图谱的差异,周麦18有9个蛋白点存在差异,其中5个下调表达,4个上调表达(3个新诱导表达);晋麦47有5个蛋白点存在差异,均上调表达(1个新诱导表达)。     

油茶雌蕊蛋白双向电泳分离体系的建立

通过比较不同的蛋白提取方法、裂解液成分、离心速率、等电聚焦程序,以及不同浓度的SDS-PAGE凝胶,建立最适于油茶雌蕊总蛋白的双向电泳体系。结果显示:TCA/丙酮+SDS/酚抽法提取蛋白,裂解液[7 mol/L尿素,2 mol/L硫脲,80 mmol/L DTT,4%(W/V)CHAPS,2%(V/V),IPG buffer(p H 3-10L)]复溶蛋白干粉,20 000 r/min离心;等电聚焦程序为:100 V 1 h,200 V 2 h,500 V 3 h,1 000 V 2 h,8 000 V 2 h,8 000 V62 000 Vh,500 V 10 h;10%SDS-PAGE凝胶浓度,为适合油茶雌蕊蛋白的双向电泳体系。这些结果为油茶雌蕊蛋白组学的研究奠定了技术基础。     

大豆种子蛋白质组样品制备方法研究

以中黄13大豆成熟种子为材料,采用苯酚甲醇醋酸铵法、三氯乙酸丙酮法和尿素硫脲法进行了蛋白质初提与复提,并利用纳升级液相色谱串联质谱技术(Nano LC-MS/MS)分析比较了尿素硫脲法初提和尿素硫脲法初提后苯酚甲醇醋酸铵法复提的样品,以及一维电泳预分离的尿素硫脲法初提样品,旨在构建能有效提高蛋白质提取率和鉴定率的样品制备方法。结果表明:尿素硫脲法初提结合苯酚甲醇醋酸铵法复提的蛋白得率最高,分别达到29.18%与4.08%;尿素硫脲法初提与尿素硫脲法初提后苯酚甲醇醋酸铵法复提样品中共鉴定到2 246个蛋白质组,初提和复提样品之间差异十分明显;每次独立制备的尿素硫脲法初提样品平均可鉴定到1 167个蛋白质组,经一维电泳预分离后平均可鉴定到1 868个蛋白质组。研究表明,采用适当的蛋白质样品制备和预分离方法,能有效提高大豆种子蛋白质的提取率和鉴定率。     

一种测定巴西橡胶树树皮中过氧化氢含量的方法

研究植物体内 H2O2 的含量变化有助于确认植物提高非生物胁迫耐性的生物技术策略。Ti(Ⅳ)-PAR-H2O2 比色法灵敏度高、特异性强、稳定性好,广泛用于植物 H2O2 测定,但不同研究所用的反应条件不一致。在本研究中,系统优化了 Ti(Ⅳ)-PAR-H2O2 比色法的反应条件,并比较了丙酮提取法和 TCA 提取法对橡胶树萌条韧皮部 H2O2 的提取效果。结果表明,丙酮提取法稳定性差,TCA 提取法稳定性好。本研究报道了一种简单、快速的测定橡胶树树皮 H2O2 的方法,为进一步研究橡胶树中 H2O2 的生理功能打下良好基础。     

一种测定巴西橡胶树树皮中过氧化氢含量的方法

研究植物体内 H2O2 的含量变化有助于确认植物提高非生物胁迫耐性的生物技术策略。Ti(Ⅳ)-PAR-H2O2 比色 法灵敏度高、特异性强、稳定性好，广泛用于植物 H2O2 测定，但不同研究所用的反应条件不一致。在本研究中，系统 优化了 Ti(Ⅳ)-PAR-H2O2 比色法的反应条件，并比较了丙酮提取法和 TCA 提取法对橡胶树萌条韧皮部 H2O2 的提取效果。 结果表明，丙酮提取法稳定性差，TCA 提取法稳定性好。本研究报道了一种简单、快速的测定橡胶树树皮 H2O2 的方法， 为进一步研究橡胶树中 H2O2 的生理功能打下良好基础。