鸡胚原代肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离培养与鉴定

[目的]本试验旨在建立一套稳定的鸡肺泡Ⅱ型上皮细胞分离、纯化和培养技术,为深入研究鸡舍空气污染物对鸡肺泡功能影响提供体外研究模型.[方法]采用Ⅰ型胶原酶对16日龄鸡胚的肺组织进行消化,经过差速离心和差速贴壁法分离细胞,采用鸡免疫球蛋白G(IgG)免疫吸附法纯化细胞,再利用免疫荧光检测和碱性磷酸酶进行细胞鉴定.[结果]培...     

鸡胚盲肠上皮细胞体外培养纯化方法的研究

为探讨鸡胚盲肠上皮细胞体外培养的纯化方法,采用低速离心去除单细胞、差速贴壁去除成纤维细胞纯化上皮细胞,并对培养细胞的纯度进行了测定。结果表明:采用1200r.min-1 5min的离心条件,利用贴壁差细胞种植1.5h后倒瓶的方法可去除部分单细胞和大部分纤维细胞,细胞种植第3天～第11天纯度可达72.00%以上。提示低速离心结合差速贴壁法可达到纯化盲肠上皮细胞的目的,可为试验研究提供较为理想的细胞模型。     

兔小肠上皮细胞体外分离培养

选用新生未哺乳仔兔,应用胶原酶Ⅳ消化法对小肠上皮进行分离培养,得到兔小肠上皮细胞后,联合应用相差消化法和相差贴壁法对兔小肠上皮细胞进行纯化。通过形态学观察及细胞免疫组织化学方法对所得到的纯化兔小肠上皮细胞进行鉴定。结果表明：应用胶原酶Ⅳ消化法得到的兔小肠上皮细胞生长状况良好,纯化后得到95％以上纯度的兔小肠上皮细胞,纯...     

仔猪小肠黏膜上皮细胞体外分离培养及鉴定

 【目的】阐明产肠毒素大肠杆菌F18（ETEC F18）引发仔猪腹泻的机理,针对其候选基因FUT1 的CDS区第307位点处的突变（G→A）,建立3个仔猪小肠黏膜上皮细胞系（GG、GA和AA）。【方法】首先以胎鼠和仔猪为试验材料,确定小肠上皮细胞的最佳分离方法。采用XI型胶原酶和I型中性蛋白酶的联酶混合液,将胎鼠小肠组织机械剪碎后用联酶进行消化和直接将联酶灌注到仔猪小肠腔内消化的两种方法进行比较。针对仔猪小肠黏膜上皮细胞体外培养过程中成纤维细胞污染难以消除的问题,本研究采用局部画圈法逐步去除成纤维细胞。最后,用电镜和CK18免疫荧光染色对纯化后的原代仔猪小肠黏膜上皮细胞进行鉴定。【结果】两种小肠上皮细胞分离效率对比表明,后一种消化方式更为有效。进而取出生12 h内未吃初乳的大白仔猪,剖腹剪取其小肠段,使用联酶混合液灌注消化分离得到形态完整、容易贴壁生长的小肠绒毛细胞团。电镜和CK18免疫荧光染色结果均显示,小肠黏膜上皮细胞纯度达90%以上。经纯化处理,最后获得了FUT1基因型为GG和GA的两种小肠黏膜上皮细胞。仔猪原代小肠黏膜上皮细胞培养周期显示,7代前细胞生长状况良好,形态为典型的上皮细胞样,单层细胞呈铺路石排列,培养至第9代,细胞出现生长停滞、胞体空泡化等现象。【结论】最终获得了FUT1基因型为GG和GA的仔猪原代小肠黏膜上皮细胞。建立了仔猪小肠黏膜上皮细胞分离及培养方法,为后续的细胞建系工作奠定了良好的基础。     

牛乳腺上皮细胞的分离培养

比较了几种乳腺细胞分离培养方法的特点。实验证明：胶原酶消化法和组织块种植法均可用于培养牛原代乳腺细胞。其中,胶原酶消化法容易得到均匀的乳腺细胞,且上皮细胞所占比例也比较高;组织块培养法不容易丢失、损伤上皮细胞,但上皮细胞长出较晚,且占比例较低,然而,用于培养小动物乳腺组织具有优势,并且可结合组织块转移、胰蛋白酶消化纯化上皮细胞,用此方法本实验获得了牛乳腺上皮细胞富集的细胞系;同时讨论了乳腺上皮细胞增殖与分化的关系,提出终末分化的腺上皮细胞已不再分裂增殖的观点。     

鸽小肠上皮细胞的分离培养与鉴定

本试验旨在建立鸽小肠上皮细胞体外分离培养和鉴定的方法体系,为研究鸽小肠上皮细胞的营养转运吸收、细胞增殖代谢等机制提供原代细胞模型.采用胶原酶消化法和组织块贴壁法分离鸽小肠上皮细胞,并通过相差消化法对其纯化,最后运用免疫荧光分析和基因表达分析鉴定鸽小肠上皮细胞.结果表明,2种方法均可成功分离培养鸽小肠上皮细胞,细胞呈铺路...     

血清浓度对鸡胚盲肠上皮细胞原代培养的影响

为探讨细胞培养基中血清浓度对鸡盲肠上皮细胞体外培养的影响,分别用含0%、2.5%、5%和10%胎牛血清(FBS)的细胞培养液培养鸡胚盲肠上皮细胞,检测细胞活性;选择适宜的FBS浓度,并测定了该浓度条件下鸡盲肠上皮细胞的生长特性。结果表明:用含2.5%和5%FBS的培养基培养鸡胚盲肠上皮细胞,第4天细胞贴壁率达最高,分别为84%和80.33%,显著地高于无血清和10%FBS组(P<0.01/0.05),第7天仍均维持在76%以上,两者间除了第2天外,其余差异均不显著;用含2.5%FBS的细胞培养基进行鸡胚盲肠上皮细胞原代培养,第2~3天为适应阶段,第3~5天处于对数生长期,第5~9天细胞进入减速期,第10~11天再次进入对数生长期,第11天以后细胞进入衰退期,整个过程持续14 d左右。鸡胚盲肠上皮细胞培养的血清浓度以2.5%FBS为宜。     

鸡气管上皮细胞分离培养及传支病毒在其培养特性研究

 【目的】探索鸡气管上皮细胞（chicken trachea epithelium,CTE）分离培养技术,并研究传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus,IBV）在CTE中培养特性。【方法】利用气管灌注冷消化法分离培养CTE,对CTE特异性8/18角蛋白作免疫组化鉴定上皮细胞。培养的CTE分别接种IBV M41株和T株,分别在接种后第12～96小时观察接毒细胞形态学变化,应用电镜技术观察CTE细胞病变和病毒粒子结构,利用RT-PCR技术检测CTE中病毒核酸并对CTE中IBV的血凝性和鸡胚致病性进行检测。【结果】利用灌注冷消化法可以获得形态完整并带有纤毛的CTE,细胞活性高,经过3步纯化后的CTE均一性高、生长快。两株IBV感染的CTE分别在接毒72和84 h后产生明显的细胞病变效应（cytopathic effect,CPE）,血凝性和致鸡胚病变检测结果呈阳性。【结论】本研究成功分离培养了CTE,可以为CTE相关研究提供技术支持,并为IBV基础研究和应用奠定基础。     

鸡热应激的研究进展

介绍了鸡热应激的研究进展，包括热应激对鸡采食量、生产性能、内分泌及免疫机能的影响，并阐述了相关调控措施。     

鸡热应激与抗热应激的研究进展

在现代养鸡生产中,环境因素起着重要作用,其中以持续高温造成的影响最为显著。本文在综合文献资料的基础上,对鸡热应激产生的行为、生产性能和生理生化变化以及热应激的预防措施加以论述,并对抗热应激添加剂的发展趋势提出自己的看法。     

鸡小肠上皮细胞表面大豆凝集素受体的标记

以0日龄海蓝褐蛋鸡为材料,用胶原酶结合组织块培养的方法分离培养了鸡小肠上皮细胞,通过抗角蛋白单克隆抗体对分离的细胞进行纯度鉴定,并用荧光标记大豆凝集素对已鉴定的细胞大豆凝集素结合位点进行了标记.结果表明:试验获得了鸡小肠上皮细胞原代培养物纯度＞90%,可用于后续试验,荧光标记表明细胞表面存在大量的大豆凝集素受体.     

第28期鸡胚原始生殖细胞的分离培养

[目的]进一步优化生殖细胞（PGCs）细胞体外培养条件。[方法]从第28期（5．5d）鸡胚生殖嵴分离PGCs,将PGCs与性腺基质细胞共培养进行原代培养,比较2种培养温度和3种培养浓度对PGCs原代培养的影响,以及2种饲养层细胞对PGCs传代培养的影响,并通过倒置显微镜下形态学观察、碱性磷酸酶（AKP）和过碘酸希夫反应（PAS）染色方法鉴定PGCs。[结果]培养浓度为2．5×10^5个／ml和培养温度为37℃时PGCs增殖较多,不易分化,存活能力较强,以第2代鸡胚成纤维细胞作饲养层时传代培养效果较好,获得了PGCs增殖的未分化集落,为后期的细胞标记及移植研究提供了较多数量和较高活力的PGCs。[结论]获得了PGCs原代与传代培养较好的培芥体系,为禽类EG细胞系的建立和转基因研究奠定了基础。     

鸡胚破骨细胞的分离培养与鉴定

从18日龄鸡胚长骨（股骨和胫骨）中机械分离破骨细胞于盖玻片和骨片上培养,以建立鸡胚破骨细胞体外培养方法。结合倒置相差显微镜、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色、甲苯胺蓝染色及透射电镜（TEM）和扫描电镜（SEM）对其形态和功能进行观察鉴定。结果表明,直接分离的细胞具有典型的破骨细胞的形态特点：属多核大细胞,TRAP染色阳性,能在骨片表面形成吸收陷窝。结论：鸡胚长骨机械分离法可获得一定数量并具有骨吸收活性的破骨细胞。     

鸡胚破骨细胞的分离培养与鉴定

从18日龄鸡胚长骨(股骨和胫骨)中机械分离破骨细胞于盖玻片和骨片上培养,以建立鸡胚破骨细胞体外培养方法.结合倒置相差显微镜、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、甲苯胺蓝染色及透射电镜(TEM)和扫描电镜(sEM)对其形态和功能进行观察鉴定.结果表明,直接分离的细胞具有典型的破骨细胞的形态特点:属多核大细胞,TRAP染色阳性,能在骨片表面形成吸收陷窝.结论:鸡胚长骨机械分离法可获得一定数量并具有骨吸收活性的破骨细胞.     

氟化物对体外培养猪小肠上皮细胞的影响

[目的]研究氟对体外小肠上皮细胞的影响。[方法]以小肠上皮细胞为研究对象,对猪小肠上皮细胞进行分离后,添加2.5、5.0、10.02、0.0μg/ml的氟进行培养,测定小肠上皮细胞的增殖率和碱性磷酸酶的活性。[结果]当氟添加量<10.0μg/ml时,细胞的增殖、碱性磷酸酶活性与对照组之间无显著差异;而高氟组(20.0μg/ml)小肠上皮细胞的增殖、碱性磷酸酶活性则受到显著抑制,并且小肠上皮细胞的形态由多角形变为圆形,细胞核溶解,大部分细胞死亡。[结论]该研究为进一步研究氟对体外小肠上皮细胞的危害机理奠定了基础。     

不同浓度胰岛素对鸡胚盲肠上皮细胞生长的影响

为了探讨不同浓度的胰岛素对体外培养的鸡胚盲肠上皮细胞生长和增殖的影响,试验选用16日龄SPF鸡胚,采用嗜热菌蛋白酶消化法无菌分离鸡胚盲肠组织,以含不同质量浓度胰岛素(0、5、10、15、20μg/m L)的培养基对盲肠上皮进行体外培养,对细胞克隆形成率、生长曲线和上皮细胞角蛋白18进行测定。结果表明,培养基中添加10μg/m L胰岛素时,鸡胚盲肠上皮细胞的增殖差异极显著,胰岛素质量浓度为15、20μg/m L时,鸡胚盲肠上皮细胞增殖略有升高,但与胰岛素10μg/m L组相比,细胞增殖差异不显著;角蛋白18鉴定结果为阳性。表明在体外鸡胚盲肠上皮细胞培养中,10μg/m L胰岛素能促进鸡胚盲肠上皮细胞分裂、生长和增殖。胰岛素作为一个体外细胞生长的关键因子,可促进鸡胚盲肠上皮细胞的生长和增殖。     

鸡的热应激诊断及预防措施

鸡的皮肤无汗腺、体温高、代谢旺盛且覆盖着较厚的羽毛,因此,高温导致的热应激在诸多的致应激因素中就显得尤为突出。高温能引起鸡新陈代谢和生理机能的改变,导致鸡生长发育缓慢、产蛋率下降,蛋重变小;蛋壳变薄、易碎,饲料利用率下降,母鸡死亡增多,给养鸡业带来严重的损失。本文重点介绍鸡热应激的诊断及其预防措施,为养鸡场夏季克服热应激提供参考。     

4种小鼠肠上皮细胞分离培养方法的比较

【目的】比较4种小鼠肠黏膜上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IECs)分离方法的分离效果,建立小鼠IECs的有效分离培养方法,获得小鼠IECs原代细胞,为后续研究做准备。【方法】分别采用组织块培养法、嗜热菌蛋白酶消化法、胶原酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ联合消化法以及胶原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ联合消化法共4种方法分离小鼠IECs并培养,通过细胞免疫组织化学法和细胞免疫荧光法对分离的IECs进行细胞特异性鉴定,比较4种方法的分离效果。【结果】组织块培养法所获IECs活力好,增殖能力强,但成纤维细胞污染较严重,细胞纯度低;胶原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ分离法获得的IECs数量少且细胞增殖能力弱;嗜热菌蛋白酶消化法及胶原酶Ⅺ与中性蛋白酶Ⅰ联合消化法所获得的小鼠IECs纯度较高,原代培养时增殖能力稍弱于组织块培养法,但传代后增殖能力趋于稳定。通过细胞免疫组织化学法和细胞免疫荧光法对分离的细胞进行鉴定,结果表明,分离的细胞多数为小鼠IECs。【结论】嗜热菌蛋白酶消化法及胶原酶Ⅺ与中性蛋白酶Ⅰ联合消化法均适合肠道上皮细胞的分离和培养。