香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种rDNA-ITS的比较

对采自福建省香蕉枯萎病菌(Fusarium.oxysporumf.sp.cubense)3个1号生理小种(Foc1)菌株和17个4号生理小种(Foc4)菌株的ITS区进行PCR扩增,将Foc1代表菌株FOCABB361和Foc4代表菌株FOCAAA315的rDNA-ITS序列提交GenBank,获得的GenBank登录号分别为EU395428和EU332405.序列分析结果表明:Foc4号生理小种的ITS2区长度为151 bp;Foc1号生理小种的ITS2区长度为152 bp;Foc1号和4号生理小种的ITS1区完全一致,长度都为147 bp.Foc1号生理小种与4号生理小种的ITS序列差异不大.表明ITS区对于镰刀菌属内种间差异鉴别具有参考价值,但不能用于Foc生理小种的鉴别.     

香蕉枯萎病菌fgb2基因的克隆与序列分析

为了解fgb2基因在尖孢镰刀菌古巴专化型侵染香蕉过程中的作用,及其与尖孢镰刀菌古巴专化型1号和4号生理小种之间的致病力差异关系,采用PCR和RT—PCR方法扩增了2个生理小种的fgb2基因,并对其扩增产物进行了测序及相似序列搜索和比对,同时还对其基因编码的蛋白进行了氨基酸序列比对和功能分析。结果表明,2个生理小种fgb2基因开放阅读框分别为1466bp和1452bp,基因同源性为96．33％;其编码的氨基酸数量分别为299个和316个;从．詹62基因序列及其编码蛋白的氨基酸序列来看,2个生理小种的致病力差异与詹62基因并无明显对应关系。     

香蕉枯萎病菌4个生理小种核糖体DNA内转录间隔区的RFLP分析

【目的】明确香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense 4个生理小种的系统发育关系。【方法】利用PCR扩增该病菌4个生理小种的核糖体DNA内转录间隔区(Internal transcribed spacer,ITS),利用AIu I、Hpa II和Taq I 3种限制性内切酶对这些小种的ITS产物进行RFLP分析。【结果】PCR扩增结果表明:来自4个生理小种的8个菌株均可扩增得到568 bp的ITS单一片段,但这些生理小种间的片段没有明显的多态性;对这些生理小种ITS产物进行RFLP分析发现,不同生理小种之间的差异很小。【结论】PCR-RFLP技术不适用香蕉枯萎病菌生理小种的分析鉴定。     

香蕉枯萎病菌SNF1基因的克隆及生物信息学分析

为了解SNF1基因在香蕉枯萎病菌致病过程中的作用以及FOC1和FOC4两个生理小种之间的致病力差异关系,采用了PCR、RT-PCR的方法扩增了2个生理小种的SNF1基因,测序并采用生物信息学软件对相似序列进行搜索、比对,并对该基因编码的预测蛋白进行氨基酸序列比对和分析。研究结果显示,2个生理小种的SNF1基因的ORF分别为2 136、2 130 bp,二者相差6个碱基,同源性为99.5%。FOC1和FOC4的SNF1基因分别编码711、709个氨基酸,相差两个氨基酸,为丝氨酸(FOC1)和谷氨酰胺(FOC1)。生物信息学软件预测结果表明该蛋白N端不存在信号肽,但具有两个相同的功能结构域位点,分子量约为79 ku,pI为6.80。     

广西巴马小型猪SLA-DQB基因外显子2的多态性研究

为探讨广西巴马小型猪SLA-DQB基因外显子2的多态性,以其耳组织为试验材料,经PCR扩增获得广西巴马小型猪SLA-DQB外显子2片段,片段大小为273 bp,含有1个RsaI酶切位点和5个HaeIII酶切位点,基因型分别为27bp/246 bp和84 bp/83 bp/7 bp/16 bp/29 bp/54 bp。采用PCR-RFLP对30头广西巴马小型猪SLA-DQB基因外显子2的PCR扩增产物进行多态性分析,发现广西巴马小型猪封闭群内S,LA-DQB基因外显子2无多态性位点;而克隆测序及同源性比较分析表明,广西巴马小型猪SLA-DQB基因外显子2序列与普通猪（Sus Scrofa）、人类（Homo sapiens）的同源性分别为94.1%、79.1%。     

香蕉枯萎镰刀菌的核糖体DNA-ITS区段序列分析

寻找香蕉枯萎镰刀菌1号生理小种(Focr1)和4号生理小种(Focr 4)在rDNA-ITS区段序列上的差异,为香蕉枯萎镰刀菌小种的快速检测提供依据。对来自海南省和广东省的3个Focr 1和5个Focr 4菌株进行rDNA-ITS测序,并与GenBank中的4个尖孢镰刀菌的rD-NA-ITS序列进行比对分析。8个菌株中ITS1和ITS2分别为147和152 bp,与GenBank中的尖孢镰刀菌有97.0%~99.0%的同源性。香蕉枯萎镰刀菌4号生理小种和1号生理小种与GenBank中尖镰孢菌菊花专化型、尖孢镰刀菌黄瓜专化型和一品冠萎凋病菌在rDNA-ITS序列的367与386 bp位点存在两处共性差异:4号生理小种的碱基均为T(胸腺嘧啶),而1号生理小种和GenBank中3个菌株的碱基均为C(胞嘧啶)。尖孢镰刀菌rDNA-ITS区段序列不适于区分种内不同专化型及生理小种。     

香蕉 - 尖孢镰刀菌互作机理及抗病育种研究进展

由土壤真菌 Fusarium oxysporum f. sp. cubense（Foc）引起的香蕉镰刀菌枯萎病是全世界范围内严重威胁香蕉生产的毁灭性病害。目前已发现 Foc 的 4 个生理小种。20 世纪 70 年代,Foc 1 号生理小种造成我国华南地区的龙牙蕉和粉蕉种植园大面积发病;90 年代中后期,在广东省的香牙蕉种植园发现 Foc 4 号生理小种,并且迅速向其他香蕉产区蔓延。目前,国内各香蕉主产区均有报道发生 Foc 4 号生理小种引起的香蕉枯萎病,该病已成为制约我国香蕉生产的最主要因素。对香蕉枯萎病菌侵染过程以及香蕉枯萎病致病机理、抗性机制、抗病品种选育、抗性种质筛选及抗病性鉴定、防治等多个领域取得的研究进展进行了概述,并对今后研究方向进行了展望,主要包括：（1）在继续研究已有抗病品种对 Foc TR4 抗性的同时,要进一步深入研究 Cavendish 对Foc 1 号生理小种的抗性;（2）利用已经建立的香蕉 CRISPR/Cas9 基因编辑技术体系,获得香蕉枯萎病抗病品种,并进一步应用寄主植物诱导的基因沉默技术（HIGS）获得更加持久稳定的抗病性;（3）将已经建立的香蕉试管苗离体水培系统应用于香蕉-Foc 互作研究。     

香蕉枯萎病菌2个生理小种多聚半乳糖醛酸酶活性的比较

用香蕉枯萎病菌4号生理小种(Foc 4)接种巴西香蕉,香蕉枯萎病菌1号生理小种(Foc 1)接种粉蕉,均能检测到PG、PMG、PGTE、PMTE和Cx 5种细胞壁降解酶活性,其中PG活性均最高。在7种不同碳源培养条件下,Foc 4的菌丝干质量都比Foc 1的大,说明Foc 4的生长更快,能更适应多种营养条件。在PG诱导方面,有柑桔果胶或PGA存在时,2个生理小种的PG活性明显加强。在葡萄糖或CMC作为唯一碳源时,2个生理小种的PG活性很低。以香蕉维管束组织培养2个生理小种后发现,Foc 4的PG活性比Foc 1高。以粉蕉维管束组织培养2个生理小种后发现,Foc 1的PG活性比Foc 4高。以柑桔果胶作为碳源,并改变不同的氮源,在7种氮源培养条件下,Foc 1和Foc 4均能产生PG活性,但所产生的PG活性比不加氮源所产生的PG活性低。     

鉴定根肿菌(Plasmodiophora brassicae)4号生理小种的特异基因PBRA 000030和Novel00510

【目的】根肿病已成为我国油菜等十字花科作物的主要病害。芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae)作为专性寄生菌,单孢分离和培养技术要求较高,制约着根肿菌生理小种的分子鉴定,建立一种快速、方便、准确的检测方法,将为田间根肿菌生理小种的监测、预警及综合防控等提供科学依据。【方法】采用转录组测序,筛选根肿菌侵染感病白菜(Brassica rapa)下4号生理小种区别于其他供试小种的差异表达基因,通过常规PCR进行验证。【结果】挖掘获得存在于根肿菌4号生理小种,而供试2、5、7、9、10和11号小种中不存在的2个分子标记基因PBRA_000030和Novel00510,通过降低PCR扩增循环数为25这一优化方式,达到特异鉴定肿根中4号优势生理小种的目的。【结论】针对我国根肿菌优势生理小种4号,建立了一种操作简便、特异性强、适用范围广的方法。     

口蹄疫病毒YN株VPI-2A基因的克隆及遗传变异分析

以口蹄疫病毒YN株RNA为模板,用设计的特异引物RT-PCR扩增出大小为1 055 bp的基因片段,并对PCR产物克隆测序进行序列分析。结果表明:供试病毒的VP1-2A基因的核苷酸序列与参考毒株的同源性为77.65%~93.00%,对应的氨基酸序列同源性为87%~97%。     

玫瑰GASA4-like基因的克隆及其序列分析

从大马士革玫瑰(Rosa damascena)中利用同源克隆结合RACE的方法首次获得了一个GASA4-like基因的cDNA和DNA序列全长(GenBank登陆号FJ595792,FJ595793),并利用TAIL-PCR的方法克隆了其部分启动子序列。结果表明,玫瑰GASA4-like基因包含4个外显子,3个内含子,开放阅读框为327bp,编码108个氨基酸序列。对推导的氨基酸序列分析发现,N末端1~26个氨基酸是一信号肽序列,C末端含有12个保守的半胱氨酸残基,具有GASA基因家族共同的一些结构特征。系统进化分析表明,玫瑰GASA4-like与分生组织中表达的GASA蛋白聚为一类。启动子顺式作用调控元件分析表明,GASA4-like基因上游318bp的部分启动子含有诱导表达调控元件和一些转录因子的结合位点;最后,对GASA4-like基因可能的生物学功能进行了预测。     

广西猪瘟流行毒与C-株疫苗毒gp55（E2）主要抗原区DNA序列差异的比较

采用反转录 PCR(RT- PCR)和套式 PCR(nest Polym erase Chain Reaction,n PCR)扩增出 3株广西省近期 (1999～ 2 0 0 0年 )猪瘟流行野毒的 E2 基因 ,将其分别克隆于 PMD- 18T载体上并进行了核苷酸序列测定 ,根据 C株及 Brescia和 Alfort株确定起始氨基酸三联体的正确位置后进行氨基酸序列推导 ,同时进行了同源性比较及 E2 糖蛋白结构的分析。结果表明 ,所测 3株 HCV E2 基因的长度均为 1170 bp,编码的氨基酸序列均包括完整信号肽序列和部分跨膜序列 ,共由 384个氨基酸组成。3株流行毒的 E2 基因核苷酸序列同源性为 90 .10 %～ 98.5 4%,相应的氨基酸序列同源性为 89.5 9%～ 97.92 %。这 3株流行毒与 C-株兔脾组织毒 (疫苗种毒 ) E2 基因的核苷酸序列同源性为 82 .87%～ 83.99%,相应的氨基酸序列同源性为 86 .98%～ 90 .10 %,表明近期猪瘟流行毒与 C-株疫苗毒的 gp5 5蛋白之间存在一定的差异。     

河南省猪瘟流行毒的E2基因序列分析和基因分型

采用 RT- PCR和 n PCR扩增出 3株河南省近期 (1999～ 2 0 0 0年 )猪瘟流行野毒的 E2 基因 ,分别克隆于 PMD- 18T载体 ,对其进行了核苷酸序列测定及氨基酸序列推导 ,同时进行了同源性比较及 E2 糖蛋白结构的分析。结果表明 ,所测 3株 HCV E2 基因的长度均为 116 9bp。编码的氨基酸序列均包括完整信号肽序列和部分跨膜序列 ,共由 384个氨基酸组成。3株流行毒的 E2 基因核苷酸序列同源性在 99%以上 ,相应的氨基酸序列同源性也在 99%以上 ;这 3株流行毒与 C-株兔脾组织毒 (疫苗种毒 ) E2 基因的核苷酸序列同源性在 83.14 %～ 83.2 3% ,相应的氨基酸序列同源性在 88.14 %～ 88.6 8%。经遗传发生关系分析 ,C-株兔组织毒 C-株细胞毒属于组群 1(group 1) ,河南省近期流行猪瘟毒属于组群 2 (group 2 ) ,近期猪瘟流行毒与 C-株疫苗毒的 gp5 5蛋白之间存在一定的差异     

尾叶桉U6 4CL基因cDNA克隆及反义表达载体的构建

[目的]为了获得桉树4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)基因,构建植物反义表达载体,研究4CL基因对木质素的调控机理。[方法]从尾叶桉U6幼茎组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增得到1.4 kb cDNA片段,将其克隆到质粒载体pGEM-T Easy。[结果]测序结果表明,该基因1413 bp,编码471个氨基酸。克隆片段经双酶切消化,反向插入到植物表达载体pBI121上,构建成4CL反义基因表达载体。通过冻融法将携带反义cDNA的植物表达载体质粒导转入根癌农杆菌EHA105,得到完整的Ti质粒表达载体系统。[结论]为该基因转化桉树的主栽品种尾叶桉U6以降低其木质素含量奠定了基础。     

网纹蟒非入侵式采样和线粒体基因组分析

采用非入侵式采样,提取网纹蟒Python reticulatus粪便和新鲜蛇蜕的基因组,探讨非入侵式采样在蛇类研究中的可能性。利用聚合酶链式反应（PCR）测定和拼接网纹蟒线粒体基因组全序列,结合GenBank中蟒科Pythonidae线粒体基因组全序列,对蟒科物种进行比较分析。结果发现:蛇蜕中提取的DNA优于粪便,液氮处理能提高DNA质量浓度。网纹蟒线粒体基因组全长17 641 bp,基因排布和结构同蟒科物种一致,但部分基因起始密码子和终止密码子存在差异。根据系统发育树分析推测,与蚺科Boidae相比,蟒科和闪鳞蛇科Xenopeltidae进化关系更接近。对蛇类物种进化过程的分析发现:热点区域存在2个相似度非常高的控制区,系统树上的拓扑结构呈簇状排列,推测2个控制区的结构来源于一个祖先。这种种内进化的模式为协同进化。     

禽传染性支气管炎病毒纤突蛋白S_1基因的RFLP与序列比较分析

利用反转录一套式聚合酶链式反应技术从北京地区禽传染性支气管炎病毒(IBV)分离株 BJ_1、BJ_2、BJ_3株中成功扩增出1054bp 纤突蛋白高变区。利用限制性内切酶 Sin Ⅰ和 Pst Ⅰ的酶切分析证实了RT-nested PCR 的特异性,结合计算机酶切位点分析图谱进行理论 RFLP 分析。将三段 S_1基因分别克隆到pUC19质粒中,获得重组质粒 pUC IBV S_1-BJ_1、pUC IBV S_1-BJ_2、pUC IBV S_1-BJ_3。利用双脱氧链终止法对三个重组质粒进行双向测序,获得三株分离株 S_1基因高变区的序列。将得到的三个序列与标准株 M_(41),Beaudette 株和疫苗株 H_(120)及广东地方分离株 D_(41)株进行核酸序列同源性比较分析。结果表明,三株分离株核酸碱基序列和氨基酸序列与 M_(41)株的同源性比与 H_(120)株和 Beandette 株的同源性高。本研究对于进一步深入探讨禽传染性支气管炎病毒(IBV)分子变异机制研究奠定了良好的基础。     

奶牛布鲁氏菌病病原PCR检测方法的建立

为了弥补血清学和细菌学方法检测和诊断奶牛布鲁氏菌病存在的不足,根据编码牛种布鲁氏菌31KDa外膜蛋白基因的核苷酸序列设计了1对PCR引物,通过对影响PCR扩增条件的优化,建立了快速检测奶牛布鲁氏菌病病原的PCR方法。特异性检测表明,在同一反应条件下,该引物对引起奶牛布鲁氏菌病的牛种、羊种、猪种布鲁氏菌制备的模板DNA均能扩增出384bp目的基因片段,而对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、马流产沙门氏杆菌、溶血性链球菌、嗜肺巴氏杆菌制备的模板分别进行扩增均呈阴性。敏感性检测显示,最低可检出1.5pg的模板DNA。结果表明:本试验所建立的奶牛布鲁氏菌病病原PCR检测方法具有较高的特异性和敏感性。     

益生地衣芽孢杆菌天门冬氨酸激酶Ⅱ基因的PCR扩增及序列分析

通过聚合酶链反应（ＰＣＲ） 扩增得到了益生地衣芽孢杆菌Ｈ８８ － ３ 株天门冬氨酸激酶（Ａｓｐａｒ ｔｏｋｉｎａｓｅ,ＡＫ） Ⅱ基因,并用ＡＢＩＰＲＩＳＭＴＭ ３７７ ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅｒ 进行序列测定,所得核苷酸序列及推导的氨基酸序列与枯草芽孢杆菌ＶＢ２１７ 株进行了比较,结果它们的同源性非常高。     

拟南芥2A6基因正义、反义植物表达载体的构建

利用PCR技术从番茄基因组中扩增了长约1.1kb的E8基因启动子,构建了中间表达载体pCAMBI-AE8;利用RT-PCR方法从拟南芥中扩增了长约1 197bp的2A6基因全长cDNA编码区,将其定向插入pCAMBI-AE8,构建了正义植物表达载体pCAMBIAE8-2A6;同时扩增了长约500bp的cDNA片段,定向插入pCAMBI-AE8,构建了反义植物表达载体pCAMBIAE8-2A6anti.以此为基础,可以进一步研究2A6基因的差异表达对转基因拟南芥角果发育的影响,达到揭示2A6基因功能的目的.