木薯MeMYB63 基因特性及启动子活性初步分析

为了解木薯干旱相关的MeMYB63基因的基本特性,从木薯中克隆了干旱诱导的调控基因MeMYB63的全长cDNA及起始密码子上游1 500 bp的DNA片段,在转基因拟南芥中对该基因的启动子活性进行了初步分析.利用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)对MeMYB63蛋白进行标记,通过烟草瞬时转化系统观察融合蛋白的亚细胞定位.利用酵母转化试验确认MeMYB63是否具有转录激活功能.结果表明,MeMYB63基因5'上游1543 bp的片段具有明显启动子特征.MeMYB63蛋白的亚细胞定位试验发现MeMYB63与GFP融合的蛋白产物仅在细胞核出现,酵母转录激活试验表明,MeMYB63具有明显的转录激活功能,说明该基因具有转录激活结构域.亚细胞定位及转录激活试验结果表明,MeMYB63可能是一个转录因子,为今后进行该基因功能的研究提供了重要依据.     

木薯锌指转录因子MeDi19-1基因克隆及表达分析

【目的】克隆木薯锌指转录因子基因MeDi19-1,分析其编码蛋白特征、亚细胞定位、转录激活活性及在木薯不同组织中的表达水平,为探究MeDi19-1基因在木薯中的作用机制提供理论参考。【方法】从木薯KU50扩增MeDi19-1基因编码区（CDS）序列,利用生物信息学软件对其进行预测分析,并构建pNC-Green-SubC-MeDi19-1融合表达载体,通过农杆菌介导转染烟草表皮细胞,观察荧光信号以确定蛋白的亚细胞定位情况。利用酵母系统确定其转录激活活性,并基于木薯不同组织转录组数据分析其组织表达特性。【结果】MeDi19-1基因CDS序列（OL620080）长度为618bp,共编码205个氨基酸残基,蛋白分子量为22416.79 Da,理论等电点（pI）为6.10,属于不稳定疏水蛋白,含有Di19蛋白家族典型的锌指结构域zf-Di19。MeDi19-1蛋白的二级结构中含有无规则卷曲（53.66%）、α-螺旋（40.49%）、延伸链（4.39%）和β-转角（1.46%）。MeDi19-1蛋白氨基酸序列与橡胶树（Hevea brasiliensis）Di19蛋白氨基酸序列（XP_021655585.1）相似性最高,为83.50%。MeDi19-1基因启动子元件含有脱落酸（ABA）、赤霉素和茉莉酸等激素响应元件及胁迫响应元件和光响应元件。MeDi19-1蛋白亚细胞定位于细胞膜和细胞核中,具有转录激活活性,且活性区域在C端。MeDi19-1基因在叶、叶中脉和储藏根中相对表达量较高。【结论】MeDi19-1基因属于Di19基因家族成员,具有组织表达特异性,主要在叶、叶中脉和储藏根中发挥调控作用,其编码蛋白在木薯组织中作为转录因子参与调节多项生理活动。     

玉米ZmWRKY41基因克隆及转录激活验证

[目的]干旱是影响作物生长发育及产量的重要因素。植物WRKY转录因子超家族在植物的生长发育、响应逆境胁迫过程中发挥着重要作用。因此,克隆分析玉米WRKY转录因子的序列特征和功能,为研究玉米耐逆分子育种提供重要抗逆基因资源。[方法]本研究以玉米自交系B73为材料提取玉米总RNA反转录cDNA,克隆、分离获得ZmWRKY41基因编码区全长序列。DNAMAN比对发现,ZmWRKY41蛋白具有保守结构域WRKYGQK和锌指结构域(zinc-finger motif)C2HC,属于第三类WRKY转录因子家族。利用生物信息学方法研究该基因蛋白质理化性质,并对其进行结构分析预测。利用PlantCARE在线工具预测、鉴定ZmWRKY41基因启动子区是否含有响应非生物胁迫的顺式作用元件。将ZmWRKY41基因编码区全长序列构建pGBKT7诱饵载体上,与GAL4DNA结合域融合,转化酵母菌株AH109验证ZmWRKY41转录因子转录激活活性。[结果]玉米ZmWRKY41基因编码区全长774bp,含有长度分别为221bp、126bp、427bp 3个外显子,共编码257个氨基酸序列。蛋白质高级结构预测发现,ZmWRKY41蛋白包含2个α-螺旋结构和5个β-折叠结构,不含跨膜结构和信号肽。ZmWRKY41基因启动子元件预测发现,该启动子中含有干旱胁迫(CGGTCA)、热胁迫(AAAAAATTTC)、低温胁迫(CCGAAA)等非生物逆境胁迫响应相关的顺式作用元件。酵母转录激活验证实验显示,将含有pGBKT7-ZmWRKY41融合表达载体转化酵母AH109菌株,能在单缺、三缺培养基正常生长且能使α-半乳糖苷酶底物分解显蓝色,表明ZmWRKY41基因具有转录激活活性。[结论]玉米ZmWRKY41基因是WRKY转录因子基因家族成员之一,在酵母体内具有转录激活活性,可能参与响应非生物逆境胁迫,为进一步研究该转录因子调控非生物逆境胁迫奠定基础。     

木薯MebZIP2基因克隆及其功能分析

【目的】bZIP转录因子在植物生长发育、淀粉合成和非生物胁迫等方面发挥重要作用。克隆木薯MebZIP2基因并进行亚细胞定位、表达分析和酵母单杂交分析,为进一步研究MebZIP2基因的功能提供参考。【方法】从木薯SC205中扩增MebZIP2基因编码区（CDS）序列,对其进行生物信息学分析,并构建pNC-GreenSubN融合表达载体,通过农杆菌介导转染烟草表皮细胞,观察荧光信号以确定MebZIP2蛋白的亚细胞定位情况。在木薯不同组织和块根不同发育阶段分析MebZIP2基因表达特征,利用酵母单杂交研究其与淀粉合成基因启动子的互作情况。【结果】MebZIP2基因CDS序列长度为465 bp,编码154个氨基酸,蛋白分子量为17 891.35 Da,理论等电点为5.23,属于不稳定亲水性蛋白。MebZIP2含有bZIP保守结构域,其氨基酸序列与橡胶树bZIP蛋白的相似性最高,为74.22%。MebZIP2基因启动子区域含有光响应元件,赤霉素、水杨酸和茉莉酸等激素响应元件,以及胚乳表达和胁迫响应元件。MebZIP2蛋白亚细胞定位于细胞核和细胞膜。MebZIP2基因在根尖分生组织、须根、茎和块根...     

烟草NtGRAS基因的克隆与转录激活及表达特性分析

以烟草品种NC89为试验材料,通过电子克隆获得1个烟草GRAS家族基因NtGRAS。该基因编码区长为1 311 bp,编码436个氨基酸。生物信息学分析结果显示,NtGRAS蛋白的相对分子质量为47 781,等电点为5.16,亚细胞定位于细胞核。进化树分析发现,NtGRAS蛋白与拟南芥At SCL23蛋白高度同源。酵母转录激活结果表明,Nt GRAS蛋白具有转录激活活性。实时荧光定量PCR分析表明,NtGRAS在烟草的根、茎、叶和花中均有表达,其中在根部的表达量最高;低温(4℃)、NaCl(200μmol/L)和干旱均能诱导NtGRAS基因上调表达。     

MlNAC2基因的克隆及其在南荻根部的表达模式分析

本研究中克隆了南荻MINAC2基因的cDNA序列,该序列全长为933bp,编码产物含310个氨基酸残基,该蛋白质理论上的相对分子质量为34,427.8,等电点(pI)为5.85,不稳定系数为34.84,为稳定蛋白,具有保守的NAM基序,无信号肽和跨膜结构域,推测为亲水性蛋白。亚细胞定位试验证明MlNAC2定位于细胞核,它可能在细胞核内行使功能。转录激活试验揭示MlNAC2是一个转录因子蛋白,且转录激活域位于C端。荧光实时定量PCR分析表明,高盐、干旱、脱落酸、茉莉酸甲酯和机械伤害均能诱导MlNAC2基因在南荻根部表达上调,而低温处理时表达下调。     

MlNAC2基因的克隆及其在南荻根部的表达模式

克隆南荻MINAC2基因的c DNA序列,该序列全长为933 bp,编码产物含310个氨基酸残基,其蛋白质理论相对分子质量为34 427.8,等电点(p I)为5.85,不稳定系数为34.84,为稳定蛋白,具有保守的NAM基序,无信号肽和跨膜结构域,可推测其为亲水性蛋白。亚细胞定位试验结果表明,Ml NAC2定位于细胞核,可能在细胞核内行使功能。转录激活试验结果表明,Ml NAC2是一个转录因子蛋白,且转录激活域位于C端。荧光实时定量PCR分析结果表明,高盐、干旱、脱落酸、茉莉酸甲酯和机械伤害均能诱导Ml NAC2基因在南荻根部的表达上调,而低温处理时表达下调。     

南荻MlNAC13基因功能的初步探究

对南荻MINAC13基因进行了克隆、亚细胞定位和转录激活试验,并用实时荧光定量PCR方法,检测了在盐胁迫、干旱胁迫、低温和脱落酸、茉莉酸甲酯、水杨酸处理下的MlNAC13基因在南荻根部的表达模式。结果：1)获得了南荻MINAC13的全基因序列;2)用N端融合YFP进行亚细胞定位试验的结果证明,MlNAC13位于细胞核,MlNAC13可能在细胞核内行使功能;3) MlNAC13的C端及全长具有转录激活活性,N端没有转录激活活性,说明它是转录因子,且转录激活域位于C端;4)除水杨酸外,脱落酸、茉莉酸甲酯均能诱导MlNAC13基因的表达,说明MlNAC13基因可能参与南荻的多种逆境胁迫响应。     

烟草转录因子NtWRKY-R1的转录激活域鉴定

为确定烟草转录因子Nt WRKY-R1的转录激活域,本研究将Nt WRKY-R1的编码区分为7个不同片段,分别构建到酵母表达载体p GBKT7中与GAL4的DNA结合域融合,通过酵母双杂交试验确定,Nt WRKY-R1本身具有能够激活GAL4 BD转录起始的激活结构域,并将转录激活区定位于该转录因子蛋白肽链的N端75个氨基酸残基和C端80个氨基酸残基中。     

基于转录组分析苹果水杨酸特异响应基因MdWRKY40的启动子鉴定

【目的】探明水杨酸(SA)对苹果叶片基因转录调控的影响,鉴定SA信号途径及其调控基因,为研究SA介导的抗病分子机制提供理论依据。【方法】生长30 d的‘嘎啦’组培苗叶片用2 mmol·L-1水杨酸(SA)处理12 h,以CTRL(0.2%乙醇)处理作为对照,利用Illumina Hi Seq TM 2000进行转录组测序,通过综合的生物信息学分析(差异基因筛选、条件特异性分析、GO分类及KEGG富集分析等)筛选SA信号途径的调控基因。克隆受SA特异性诱导表达基因的启动子,利用苹果细胞原生质体转化技术,进行启动子活性鉴定,确定对SA进行特异性响应的核苷酸序列。【结果】CTRL和SA处理分别获得750 439 459 bp和751 596 153 bp的原始数据,分别有44.77%和43.88%与‘金冠’苹果基因组完全匹配。获得3 329个显著性差异基因,包括苯丙烷类、类黄酮等次生代谢物生物合成途径的相关基因(如木质素合成关键酶CAD、细胞色素P450、真菌抗性相关的β-1,3-葡聚糖酶等),调控植物病原菌互作途径重要功能基因(钙调蛋白Ca M、抗病蛋白RPM1、热激蛋白HSP90、WRKY转录因子等)以及33个条件特异性诱导表达基因(NAC转录因子、NIMIN1、WRKY40、ERF转录因子等)。其中1 085个基因上调,2 244个基因下调。差异基因主要涉及细胞过程、代谢过程和基因绑定、催化活性等;根据转录组学的结果,将SA响应基因Md WRKY40的启动子序列克隆到含有荧光素酶基因的表达载体中,置于荧光素酶基因的上游,转化苹果原生质体细胞。SA处理的原生质体细胞,荧光素酶的活性为未经SA处理的20.6倍,而脱落酸(ABA)、茉莉酸(JA)、1-氨基环丙烷羧酸(ACC)对荧光素酶的活性没有影响,说明该启动子为苹果中对SA进行特异性响应的启动子序列。不同区段的启动子片段对SA响应能力不同,从Md WRKY40翻译起始位点ATG向上游500—1 000 bp只能响应高浓度SA,而对低浓度SA不具有响应能力,1 500 bp片段对高浓度SA响应能力进一步显著增强,对低浓度SA响应也有微弱提高;而长度为2 000 bp的核苷酸片段无论对高浓度SA还是对低浓度SA都具有显著响应能力,且达到最强。与2 000 bp片段相比,2 500 bp的核苷酸片段没有进一步增强启动子片段对SA的响应能力。超表达Md WRKY40蛋白对其自身的转录具有抑制作用。【结论】2 mmol·L-1 SA处理所影响的基因主要参与了苯丙烷类、类黄酮的生物合成,植物病原菌互作及植物激素信号转导途径。位于Md WRKY40开放阅读框上游的2 500 bp核苷酸序列,为对SA进行特异性响应的核苷酸启动子序列。在1 000—1 500 bp及1 500—2 000 bp具有显著提高启动子对SA敏感性的未知核苷酸序列,另外,Md WRKY40转录调控存在反馈抑制机制。     

盐穗木HcGKR基因亚细胞定位表达载体的构建及定位分析

[目的]以GFP基因为报告基因,构建HcGKR基因的亚细胞定位表达载体.[方法]采用PCR方法和基因枪法.[结果]用PCR法,以pGEM- T- HcGKR质粒为模板,获得HcGKR基因的目的片段.然后将其克隆到亚细胞定位表达载体35S:GFP中,获得由CaMV35S启动子调控目的基因的35S - GFP - HcGKR融合表达载体,使目的基因能够和GFP融合同时表达.采用基因枪法将35S - GFP - HcGKR转化到洋葱表皮细胞中,暗培养24 h后,经共聚焦显微镜观察确定发出绿色荧光的位置,对HcGKR基因进行亚细胞定位.[结论]构建的亚细胞定位表达载体可在植物细胞中表达,通过洋葱细胞中绿色荧光的位置确定目的基因定位在细胞膜上,为进一步盐穗木HcGKR基因的功能奠定了理论基础.     

高尔基体驻膜糖蛋白GP73启动子克隆

[目的]寻找并克隆有活性的高尔基体膜蛋白GP73的启动子。[方法]对GP73基因转录起始位点上游1 000 bp至下游400 bp序列进行软件分析预测,以肝癌细胞系Huh7基因组DNA为模板,扩增目标片段,构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的重组质粒,转染细胞后在荧光显微镜下观察EGFP的表达,并采用流式细胞仪定量检测转染细胞的荧光强度。[结果]发现GP73转录起始位点上游980到下游330 bp长1 310 bp的序列具有启动子功能。该区域可能具有两个核心启动子序列和多个保守序列,包括TATA box和NF-κB、AP1、GC-SP1等DNA结合序列。[结论]该研究为探讨GP73的转录机制提供了参考。     

白桦BpGT14基因启动子克隆及表达活性分析

本文利用SiteFinding-PCR方法克隆了白桦BpGT14基因起始密码子ATG上游2 169 bp序列,并通过PLACE启动子预测工具对其进行元件分析。结果表明,该启动子片段含有启动子核心元件及多种逆境及激素响应元件,同时具有植物苯丙烷及木质素生物合成的MYB类转录因子的重要结合基序。研究选取了其中含有启动子核心元件的1 156 bp片段构建了pBpGT14∷GUS植物表达载体,利用农杆菌侵染的方法将pBpGT14∷GUS报告基因瞬时转化烟草植株,鉴定该启动子在烟草中的表达活性及对非生物胁迫和激素的响应模式。对转基因烟草植株进行GUS染色,结果表明该启动子具有启动活性,且在茎段处活性较高;进一步分析非生物胁迫对烟草中GUS酶活性的影响,表明该启动子对ABA、NaCl、PEG及高温处理均有明显响应,且对于NaCl及PEG处理响应迅速。为了更好的鉴定白桦BpGT14基因启动子在白桦细胞中的启动活性及响应模式,本文构建了pBpGT14∷GFP载体并瞬时转化白桦茎段悬浮细胞,进行研究。GFP转录水平分析结果与GUS酶活性结果基本一致,但其中部分时间点仍存在差异。选取PEG处理3、6、12及24 h的转GFP基因白桦茎段悬浮细胞,在显微镜下观察其绿色荧光蛋白,以此揭示该启动子对干旱的响应模式。结果表明,该启动子在白桦茎段悬浮细胞中启动了GFP的表达,在处理初期(3 h),荧光效果明显;随着处理时间的增加,细胞脱水明显,且在细胞壁表现高亮度荧光。      

Isolation and Characterization of E11 Gene Promoter from Tomato

A fragment of 2 000 bp upstream sequence of E11 clone was amplified from genomic DNA of the tomato cultivar Zhongshu5. Sequence analysis showed that the upstream contains the regulatory elements: TATA box (-29 - -22), CAAT box (-193- -189), wound, and drought response elements. Expression vectors of E11 promoter gus fusion were constructed with the promoters of 1 200 and 2 000 bp regions, respectively. Transgenic tomato plants were obtained through Agrobacteriummediated transformation. Histochemical analysis of GUS activity in various tissues showed that the two promoters were able to direct fruit-specific gene expression. The expression driven by promoter of 2 000 bp upstream fragment could increase GUS activity with the maturation of tomato fruits. The promoter of -1 200 bp fragment could direct gus gene expression in fruits with the inductions of drought and wounding. The regulatory region for fruit-specificity was probably located in the region of 1200 bp of 5'-flanking sequence and some positive regulatory elements or enhancers may exist in the region from -1200 to -2000 bp.     

苹果U6启动子的克隆及功能分析

【目的】U6启动子是CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统中驱动sgRNA转录的重要元件,其可能存在物种特异性因子,且长度不同转录活性存在差异。迄今在苹果（Malus×domestica）上对U6启动子尚缺乏研究。因此,筛选出转录活性高且片段大小合适的苹果U6启动子,可以优化苹果CRISPR/Cas9基因编辑体系。【方法】利用软件DNAMAN以及启动子元件在线分析网站PLACE和plant CARE对苹果U6启动子进行比对分析;克隆并构建U6启动子驱动萤火虫荧光素酶基因（Firefly luciferase,LUC）的融合表达载体,利用农杆菌介导的瞬时转化法分别转染苹果愈伤组织和本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片;通过检测荧光素酶活性对各U6启动子进行转录活性比较。【结果】苹果基因组中共检索到6条U6 snRNA（E-value<3e ^-40）,分别位于第6、7、9、10、15和17号染色体上,取5′端27 bp snRNA及其上游1 500 bp作为候选U6启动子。序列比对结果显示,苹果U6启动子与拟南芥相同,均具有两个保守的元件,包括上游序列元件（Upstream sequence element,USE）和TATA-Like box。瞬时转化后荧光素酶活性检测结果显示,10号染色体上的U6启动子转录活性最高,10号染色体上5′端截短的U6启动子（长度分别为1 500、959、275和116 bp）中275 bp的启动子活性最强。另外,在苹果愈伤组织中,苹果U6启动子的转录活性要显著高于拟南芥U6启动子。【结论】从苹果基因组克隆6条U6启动子,并筛选出一条转录活性高且片段长度较短的U6启动子。