猪圆环病毒 2型 LAMP 诊断方法 的建立及初步应用

根据 GenBank 中的猪圆环病毒 2 型 ORF2 基因序列,设计合成 2 对引物,通过对环介导等温,LAMP 扩 增条件的优化袁敏感性、特异性试验,成功建立了猪圆环病毒 2 型 LAMP 诊断方法。 敏感性结果显示,建立的 LAMP 诊断方法最低核酸检测量为 0.30 pg/L袁而 PCR 诊断方法最低核酸检测量为 30 pg/L曰特异性结果显示,猪圆环病毒 1 型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒的扩增结果均为阴性。 对 95 份自然感染病猪样 品的检测结果表明,该 LAMP 方法检测结果与 PCR 检测结果符合率为 95.8%。 整个扩增反应可在 30 min 内完成,结 果肉眼可见,为猪圆环病毒 2 型的现场快速诊断提供了一种简便可行的方法,能够满足基层现场快速检疫的需要。     

羊口疮LAMP诊断方法的建立及其初步应用

根据GenBank中的羊口疮B2L基因序列,设计合成2对引物,通过对环介导等温扩增条件的优化,敏感性、特异性试验,成功建立了羊口疮LAMP诊断方法.敏感性结果显示,建立的LAMP诊断方法最低核酸检测量为0.50pg/L,而PCR诊断方法最低核酸检测量为50pg/L,特异性结果显示,羊大肠杆菌、羊沙门氏菌、口蹄疫病毒、山羊痘病毒的扩增结果均为阴性.对195份自然感染病羊样品的检测结果表明,该LAMP方法检测结果与PCR检测结果符合率为96.4％.整个扩增反应可在30min内完成,结果肉眼可见,为羊口疮的现场快速诊断提供了一种简便快速的方法,从而满足基层现场快速检疫需要.     

PRV、PCV-2、PPV多重PCR试剂盒的研制

根据GenBank中的猪伪狂犬病病毒(PRV)gE、猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2、猪细小病毒(PPV)VP2基因序列,设计了3对引物,研制了检测PRV、PCV-2和PPV的多重PCR试剂盒。该试剂盒扩增的阳性条带分别为300bp、420bp、680bp。敏感性、特异性结果显示,该试剂盒对3种病毒的最低核酸检测量分别为PRV45.2pg/L、PCV-235.7pg/L、PPV0.30ng/L,而猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合症(PRRSV)、大肠杆菌、猪支原体的扩增结果均为阴性。对125份自然感染病猪样品的检测结果表明,该试剂盒检测结果与单一PCR检测结果完全符合。结果表明该多重PCR试剂盒具有很好的特异性和敏感性,可用于临床PRV、PCV-2和PPV的检测。     

猪流行性腹泻病毒和猪圆环病毒3型双重PCR检测方法的建立

为建立同时快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重PCR方法。本研究根据GenBank中登录的PEDV和PCV3基因组序列,分别在M基因和Rep基因高度同源保守区设计2对特异性引物,建立了检测PEDV和PCV3双重PCR方法,即可同时扩增225bp(PEDV)和138bp(PCV3)2条特异性片段,而该方法对猪传染性胃肠炎病毒、猪博卡病毒、猪圆环病毒2型、大肠杆菌核酸扩增均为阴性;PEDV和PCV3的最低检出量分别为428和325拷贝/μL,且特异性强、敏感性好,为快速、高效检测PEDV和PCV3提供了技术帮助。     

一种改良的猪圆环病毒2型荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]利用SYBR Green Ⅰ荧光染料建立一种快速、灵敏的用于检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR方法.[方法]根据猪圆环病毒2型ORF2保守区的基因片段,扩增目的基因645 bp插入至PUC57载体,以重组质粒为模板进行荧光定量PCR反应条件优化及灵敏度、特异性等验证.[结果]建立的猪圆环病毒2型绝对定量检测方法与猪圆环病毒1型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪博卡病毒无交叉反应.检测猪圆环病毒2型的灵敏度是5.0×101 copies/μL,建立的标准曲线回归方程的相关系数0.999,扩增效率105.403％.[结论]成功建立一种特异性强、敏感性高、稳定性良好的绝对定量检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR方法,可以用于临床样品猪圆环病毒2型的检测.     

猪圆环病毒1型LAMP检测方法的建立及初步应用

为建立猪圆环病毒1型(PCV1)环介导等温扩增(LAMP)检测方法,为现场诊断提供技术支持,本试验根据GenBank公布的PCV1全基因组序列,在其保守区设计了4条特异性LAMP引物,并通过反应条件优化、敏感性试验、特异性试验以及临床样本检测,首次建立了PCV1的LAMP检测方法。结果表明,62℃水浴60 min为最佳反应条件;LAMP的检出限为1×10~1 copies/μL,普通PCR最低检测限为1×10~3 copies/μL;对猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)进行扩增,结果显示为阴性;应用该方法对103个临床疑似病料进行检测,阳性率为34.0%(35例),普通PCR阳性率为29.1%(30例),两种检测方法符合率为89.5%。本试验为PCV1临床检测提供了一种特异、快速、成本低廉的方法。     

猪圆环病毒2型与3型双重PCR检测方法的建立

【目的】建立针对猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的一种双重PCR检测方法。【方法】先优化猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的单独PCR检测方法条件,在此基础上优化这2种猪圆环病毒的双重PCR检测方法条件,之后进行其特异性与灵敏度的检测,并进行初步临床应用检测。【结果】建立的猪圆环病毒2型与猪圆环病毒3型双重PCR检测方法对猪圆环病毒1型、猪细小病毒、伪狂犬病病毒等当前常见猪源DNA病毒的检测结果都是阴性,检测猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的灵敏度分别是610、800 copies/μL。该方法对120份仔猪样品的检测结果显示,猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的检出率分别为56.7%和38.3%,虽然稍低于各自单独PCR检出率;但并没有显著差异(P0.05),且与单独PCR检测方法的符合率都达到95%以上。【结论】建立了一种特异性强、敏感性高的猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型双重PCR检测方法,为区分猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型提供了一种快速检测方法。     

猪繁殖与呼吸综合征和猪乙型脑炎双重一步法RT-PCR诊断试剂盒的研制

根据GenBank中的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ORF7N基因、猪乙型脑炎病毒（JEV）NS1基因序列,设计了2对引物,通过反应条件的优化,成功研制了检测PRRSV和JEV的双重一步法RT-PCR诊断试剂盒,扩增产物分别为245、504 bp。敏感性、 特异性结果显示,该RT-PCR诊断试剂盒对2种病毒的最低核酸检测量分别为PRRSV0.2ng/L、JEV 0.4ng/L,而对猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒的扩增结果均为阴性。对52份疑似病猪样品的检测结果表明,该双重一步法RT-PCR诊断试剂盒检测结果与单一PCR检测结果完全符合。结果表明该双重一步法RT-PCR诊断试剂盒具有很好的特异性和敏感性,可用于临床猪繁殖与呼吸综合征和猪乙型脑炎的检测。     

新现猪圆环病毒3型及圆环病毒2型双重PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank数据库中的新现猪圆环病毒3型(PCV-3)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的OFR2基因设计了2对扩增PCV-3和PCV-2的特异性引物,通过优化各反应条件,建立同时检测PCV-3和PCV-2的双重PCR方法。敏感性和特异性结果显示,该方法对PCV-3和PCV-2的最低核酸检测量均为1.0×103拷贝/μL,而对猪伪狂犬病毒(PRV)、猪delta冠状病毒(PDCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)及猪瘟病毒(CSFV)的扩增结果均为阴性。应用所建立的双重PCR检测了临床上256份样品,结果表明,PCV-3和PCV-2感染的阳性率分别为0.78%(2/256)和86.3%(221/256),仅有1份样品为PCV-3和PCV-2混合感染,混合感染阳性率为0.39%(2/256)。试验结果表明,本研究建立的PCR方法敏感、特异,适于临床样品检测,为猪群中PCV-3和PCV-2的临床快速诊断和流行病学调查提供了一种工具。     

猪圆环病毒2型LAMP检测方法的建立

基于猪圆环病毒2型(porcine circocirus type 2,PCV-2)的ORF2基因建立了一种便捷、灵敏而又特异的可视化环介导等温核酸扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法。该方法通过针对PCV-2 6个位点的4条特异性引物,在Bst DNA聚合酶的作用下对PCV-2靶序列进行等温核酸扩增。经过对LAMP反应体系和反应条件的优化,所建立方法在61℃反应1 h能够成功的检测出PCV-2基因组DNA,且操作简单,不需要PCR仪等复杂仪器,结果可经电泳检测及肉眼观察;敏感性和特异性试验表明,所建立的方法能特异地检测PCV-2并且其敏感度可以达到0.5 pg的DNA分子;所建立LAMP方法的阳性检出率与国标PCR的阳性检出率符合度为100%。该研究为PCV-2的现场快速检测提供更加简便、快捷的方法,可以满足基层检疫的需要。     

花青素合成转录因子表达载体的构建 及遗传转化油菜研究

通过 PCR 扩增得到红掌（Ant hur i um andr aeanum）的 M YB 基因全长、将 M YB 基因片段克隆到 pM D18-T 载体上、然后将此基因插入 CaM V35S启动子后构建成表达载体 Cam35S-GFP-M YB。 通过冻融法将带有目的基因的 表达载体导入根癌农杆菌、 并转化热研 2 号柱花草获得转基因植株若干。 抽取 10 株转化的柱花草植株的基因组 DNA 进行 PCR 分子验证、结果表明有 6株阳性、M YB 基因已成功整合到柱花草的基因组中。转基因柱花草植株的获 得为柱花草等豆科牧草的适口性和抗逆性的提高提供了可能、 并且为以后柱花草的遗传转化工作提供了可靠的依 据。     

粤选系列匍匐翦股颖新品系 DNA 指纹 图谱构建与遗传多样性分析

采用 SRAP 分子标记方法、对 9 份粤选系列匍匐翦股颖新品系和 4 份国外优良品种进行指纹图谱构建 和遗传多样性分析。 结果表明院（1）32对引物中、有 17对引物扩增带型清晰、共扩增出 184 条带、其中有 131 条具有 多态性、多态率为 71% 。 （2）有 4对引物扩增的带型可以清晰区分 13个品系、利用图示模型构建了 13个品系指纹图 谱、图谱包含 12个位点、能有效区分 13个品系。 （3）13个品系间存在较大的遗传差异、遗传距离在 0. 0285耀0. 7587之 间。 （4）经 UPGM A 聚类分析、在遗传距离 0. 644处、可将 13个供试材料分为 4个同源类群。 研究结果为匍匐翦股颖 新品种的鉴定和推广提供了依据。 关键词院匍匐翦股颖; SRAP; 遗传多样性; 指纹图谱 广东省自然科学基金（S2012040007287）;广东省 科技攻关项目（2005B20901018）;广州市科技攻关项目（2005Z2- E0201、2006C13G0161）;广东省农业标准项目（粤财农[ 2005] 311 号）;珠海市科技攻关项目（PC20061051） 149聂 鑫 1 、 陈国平 2 、 张 利 1 、 李再新 1 、 谢万如 1 、 赵志平 1 ( 1. 四川理工学院化学与制药工程学院、四川 自贡 643000;2. 重庆大学生物工程学院、重庆 400044) 摘 要院花青素是类黄酮化合物的衍生物、具有抗氧化功能。 油菜是全世界广泛种植的油料作物、但其花青素含 量低、抗氧化能力弱。 为了利用金鱼草花青素生物合成转录因子遗传转化油菜提高其花青素含量、通过 PCR 从金鱼 草 cDNA 中扩增了 Roseal 1和 Del i l a基因、并分别克隆到含有 35S 启动子和 35S 终止子的 pDH51 载体。 然后将含有 35S启动子、基因片段和 35S终止子的片段分别连接到 pBI N19载体、获得了含有双 35S 启动子和终止子的表达载体 pBI N-Del i l a-Roseal 1。通过农杆菌介导遗传转化甘蓝型油菜后、获得了紫色的愈伤组织。研究结果为利用基因工程技 术提高油菜花青素的含量奠定了基础。     

近等基因系 Cry1Ac抗性和敏感小菜蛾中肠 蛋白酶的测量及部分生物学参数比较

比较了近等基因系 Cr y1Ac抗性（NI L-R）和敏感（DBM 1Ac-S）小菜蛾（Pl ut el l a xyl ost el l a）幼虫中肠蛋白酶 的活性、测量了 NI L-R 和 DBM 1Ac-S的卵宽、卵长和蛹重、并对其卵的孵化率、化蛹率、雌雄比等参数进行了统计。结 果表明、抗、敏种群中肠类胰凝乳蛋白酶的活力差异不显著、而敏感种群中肠的总蛋白酶、类胰蛋白酶的活力显著高 于抗性品系。 这两个种群卵的大小和孵化率、蛹重和化蛹率、雌雄比在统计上没有显著性差异、说明就以上生物学参 数来看、NI L-R 对 Cr y1Ac的抗性并没有引起抗性的适合度代价。     

贵州喀斯特山区紫穗槐的青贮效果研究

为有效利用喀斯特山区资源、促进贵州生态畜牧业的可持续发展、以该区域紫穗槐（Amor pha f r ut i cosa） 为研究对象、进行单独青贮及乳酸菌、纤维素酶、乳酸菌+纤维素酶、甲酸、蔗糖 5 种添加剂青贮、探讨其可青贮性及 青贮的有效措施。 结果表明院紫穗槐青贮饲料的粗蛋白质含量高、酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维和单宁的含量低、营 养价值高;紫穗槐单独青贮品质一般、添加剂青贮改善了青贮饲料的气味和色泽、降低了 pH 值和氨态氮含量、改善 了青贮品质与营养;综合评定、青贮效果为乳酸菌>甲酸>乳酸菌+纤维素酶>纤维素酶>蔗糖>单独青贮、紫穗槐青贮 是可行的、可为该区域饲用灌木资源的利用提供有效途径。     

牛 TRAF6基因编码区的克隆及序列分析

为了探讨牛 TRAF6基因的结构与功能、采用基因克隆技术分离了牛 TRAF6基因的编码区序列、并采用 生物信息学方法分析了该基因及其所编码的蛋白质的序列特征、结构和功能。结果表明院分离了 TRAF6 基因 1 803 bp 的 cDNA 序列（GenBank 登录号为 DQ471669）、编码区长度为 1 629 bp、编码 542 个氨基酸（GenBank 登录号 为 ABF06558）、位于细胞核、细胞质、线粒体、内质网等多种细胞器上、分子量为 61. 57176 ku、等电点为 6. 09、含有 RI NG-f i nger 、zf -TRAF 和 M ATH_TRAF6结构域。 该蛋白与人、小鼠和大鼠 TRAF6蛋白的同源性分别为 89% 、84% 和 82% 、 其结构域的同源性均达到 95% 以上。 根据各物种间 TRAF6 蛋白的高同源性、 结合人和小鼠 TRAF6 蛋白在 TNF/ TLRs/ TI R 超家族介导的信号转导途径中的重要作用、推测牛 TRAF6 蛋白也可能参与调节多种信号通路、在免 疫反应、炎症反应、细胞分化和凋亡等生物学过程中发挥重要功能。     

南方丘陵地区 “猪 - 沼 - 果 - 鱼” 生产系统 农业面源污染控制技术规范

根据生态农业、循环农业的原则、对东江源头区野猪-沼-果-鱼冶系统开展了以控制农业面源污染为目标 的分析研究、明确了系统各环节控源、减排、净化的技术要求、制定了技术规范、以期为在南方丘陵地区大力推广 野猪-沼-果-鱼冶生产系统控制农业面源污染提供参考。     

芥蓝种质资源的营养品质分析

对 56 个不同芥蓝品种营养成分进行了分析和评价,测定了不同品种芥蓝的可溶性固形物（TSS）、还原 糖、Vc、蛋白质、粗纤维含量。 结果表明院56个不同芥蓝材料的 5 个营养指标的标准差分别为 0. 89、0. 47、16. 32、0. 46、 0. 33,其变异系数分别为 14. 83、35. 28、15. 83、21. 43、29. 64,说明其还原糖含量的差异最大,TSS 含量差异最小,为进一 步的种质资源利用提供参考依据。     

桂两优 2号对水分胁迫及复水的生态生理响应

为探究水稻孕穗期和灌浆期对水分胁迫响应的差异,以桂两优 2 号为试验材料,通过盆栽试验,在孕穗 期和灌浆期进行水分胁迫及复水处理,研究其对水稻根系形态特征,叶片 SOD、POD、CAT 活性,成熟期株高,干物质 积累的影响。 结果表明,水分胁迫及复水后,水稻根长、根数、根鲜重发生明显变化,影响成熟期株高及干物质的积 累,使叶片抗氧化酶活性升高。 水分胁迫对水稻生长生理的影响与水分胁迫程度及生育时期有关,适当水分胁迫不 会影响水稻的生长生理。 孕穗期对水分胁迫的敏感性比灌浆期大。     

光照强度对褐牙鲆血浆皮质醇、 渗透压 和生化指标的影响

将褐牙鲆（Par al i cht hysol i vaceus）在 0、10、100、1 000 l x等 4 个不同光照强度下分别处理 30 mi n 和 7 d、 探讨不同光照强度对褐牙鲆血浆皮质醇、渗透压、血浆中总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、 谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）和碱性磷酸酶（ALP）等指标的影响。 结果显示、改变光照强度 30 mi n会影响皮 质醇的变化、10 l x组皮质醇水平最低、且随着时间延长至 7 d、整体水平皆有所降低但趋势保持一致。 不同光照强度 处理对褐牙鲆血浆渗透压及血浆中 TP、ALB 含量无显著影响;不同光照强度处理后 30 mi n、100 l x处理 TG 含量最低 且与 0 l x处理差异显著、 但在处理后 7 d 100 l x处理 TG 含量最高;TC 含量变化与 TG 相似、 即随着处理时间的延 长、100 l x处理 TC 含量呈升高的趋势、 但 10 l x处理无明显变化。 不同光照强度下处理后 30 mi n、10 l x处理 AST、 ALT 活性最低、且与 1 000 l x处理差异显著、处理后 7 d、仍维持此变化趋势;在短期光强刺激下、各处理 ALP 活性无 显著差异、但在长期光强刺激下、0 l x处理显著低于 10 l x处理和 100 l x处理。 结果表明、褐牙鲆适宜的光强范围为 10 l x左右、褐牙鲆通过积极的生理调节以适应不同的光照强度变化、这对其适应环境变化具有重要的意义。     

M YB 基因表达载体的构建及转化 热研 2 号柱花草的研究

M YB 转录因子在次生细胞壁合成转录调控过程中发挥重要的作用。 为了深入研究杨树 Subgr oup 4 M YB 转录因子的作用机制、 应用酵母双杂交的方法、 以杨树 Subgr oup 4 M YB 基因 Popt r _0004s18020. 1（M YB221）、 Popt r _0009s13640. 1（M YB156）和 Popt r _0019s00750. 1（M YB057）为诱饵蛋白、从毛白杨次生维管组织均一 cDNA 文库 中筛选互作蛋白、获得了 9个与 Subgr oup 4 M YB 互作的蛋白质、并通过生物信息学方法分析候选蛋白可能的生物学 功能。 为进一步研究杨树 Subgr oup 4 M YB 转录因子的作用机制奠定了基础。