枯草芽孢杆菌Snb2原生质体制备和再生研究

研究了青霉素、甘氨酸、溶菌酶浓度、酶解温度、菌龄、再生培养基对生防芽孢杆菌Snb2原生质体的形成与再生的影响。培养液中青霉素和甘氨酸的终含量分别为0.3%和1.0%时,菌株Snb2的生长量最佳;菌株原生质体形成的最佳条件是,溶菌酶浓度为2.0mg·mL-1,酶解温度为35℃,生产原生质体的最佳菌龄为对数生长中期;在最佳再生培养基HCNB培养基上,原生质体再生率为66.0%。     

嘧肽霉素生物合成阻断突变株原生质体制备和再生条件的研究

针对嘧肽霉素的生物合成阻断突变株,研究了其最佳的菌体培养、原生质体制备和再生条件.采用改良的含15%蔗糖、0.5%甘氨酸的YEME液体培养基振荡培养36h,获得细腻丰富的菌丝体;对不同的酶浓度、酶解温度和酶解时间进行3因子4水平的正交试验,筛选最佳酶解条件为:溶菌酶浓度2mg·mL-1,28℃,作用90min,可获得最高的制备率为99%;再生培养基以R2YE为最佳,采取直接涂布方式,25.5℃培养可达48%的再生率.     

苏云金芽孢杆菌原生质体的制备及大质粒转化

研究苏云金芽孢杆菌原生质体制备与再生的最佳条件,为进一步提高原生质体转化率打下基础。通过酶解法对苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种工业生产菌株(Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki)2671原生质体的制备及再生条件进行了研究,考察了菌体生长状态、溶菌酶浓度、处理时间等影响因素,采用PEG法对大质粒进行原生质转化。结果表明,对数生长前期的菌体(培养3 h),以SMML作渗透压稳定剂,溶菌酶浓度7 mg/m L,40℃下酶解40 min,原生质体生成量可达5.7×107个/m L,再生率可达14.1%。在此条件下,采用PEG法可将大质粒p LTV1-ep成功转化宿主菌,转化率为0.3 CFU/μg。     

一种芽胞杆菌生物被膜形成缺陷培养基的研究

为寻找一种不支持芽胞杆菌正常形成生物被膜的培养基,比较枯草芽胞杆菌R31和168菌株在MSgg、NB、LB、BGM固体和液体培养基中形成的生物被膜形态差异,确定R31和168菌株生物被膜形成能力差异;根据R31在MSgg、NB、BGM培养基中振荡培养的生长方式设计出BGM1和BGDM培养基,测定R31在BGM1和BGDM培养基上的生长曲线并比较R31菌株和168菌株在BGM1和BGDM上生物被膜形成的差异,然后测定枯草芽胞杆菌TR21菌株、解淀粉芽胞杆菌R21g9菌株、短芽胞杆菌L1菌株、胶质芽胞杆菌L2菌株在BGM1和BGDM培养基上生物被膜形成情况。结果显示,R31在MSgg、NB、LB、BGM液体培养基表面形成薄皮,在MSgg、LB固体培养基和NA上形成具有褶皱的菌落,在BGM上形成光滑的菌落,R31在这些培养基中形成的生物被膜比168菌株厚实。R31在MSgg和BGM中早期(2 h)以游离状态生长,对数生长期(4 h)菌体黏连出现链状,对数生长中后期(8 h)菌体呈现网状结构,但在NB培养基中主要以游离状态生长,显示营养而非培养条件影响R31的生长方式。于是将BGM培养基中的酵母提取物换为牛肉膏获得BGM1培养基,将BGM1培养基的胰蛋白胨改为细菌学蛋白胨得到BGDM培养基,并发现R31和168菌株可以在BGM1上形成薄皮和菌落,不能在BGDM培养基上形成完整的薄皮和具有褶皱的菌落。待测菌株均能够在BGM1培养基上形成厚薄程度有差异的薄皮和有褶皱的菌落,均不能在BGDM培养基上形成薄皮和具有褶皱的菌落。在BGDM中添加甘油或Mn可以恢复R31形成薄皮和扩散的褶皱菌落。芽胞杆菌在BGDM培养基上不能正常形成薄皮和具有褶皱的菌落,BGDM可以用于筛选促进生物被膜形成的物质。     

龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)原生质体制备与再生条件研究

报道了龟裂链霉菌（ Ｓｔｒｅｐｔｏｍ ｙｃｅｓ ｒｉｍｏｓｕｓ） 原生质体制备与再生最佳条件和该原生质体对抗生素的抗性结果。在 Ｓ生长培养基中加入φ＝ １ ％ 甘氨酸进行菌丝体培养２４ ｈ ,原生质体制备最佳条件为：溶菌酶浓度φ＝ ３ ％ 、酶解温度２８ ℃、酶解时间９０ ｍｉｎ ,其制备的原生质体数达到６ ．０ 亿个／ ｍ Ｌ 以上;原生质体最佳再生培养基为 Ｒ５ 再生培养,其再生率达到４６ ％ 。     

一株木霉菌SWFC1511原生质体形成及再生条件的研究

研究了一株木霉菌SWFC1511菌株原生质体的制备及再生条件,并观察其原生质体释放过程。结果表明:木霉菌SWFC1511原生质体制备的最佳条件为:菌丝培养20 h后,用比例为1∶3的2%溶菌酶与2%蜗牛酶为酶解液,在35℃下酶解3 h后,原生质体的产量较高。所形成的原生质体在再生培养基1上的再生率较高。     

农抗5102产生菌原生质体融合育种的研究——Ⅰ. 影响原生质体形成和再生的因素

本文报道了溶菌酶的浓度,酶解温度、时间,生长培养基成分和上再生培养基成分等因素对农抗5102产生菌两个营养缺陷型菌株的原生质体形成和再生的影响。实验结果表明:溶菌酶用量为4mg/ml时,合适的酶解温度和时间是32℃,1.5小时;生长在PM_1培养基和有机A培养基上的菌丝细胞壁对溶菌酶最敏感;原生质体不仅可以在高渗的RM_2培养基上形成菌落,而且也可以在非高渗的PM_1培养基上形成菌落;补充10%蔗糖的PM_1培养基上生长的菌丝可以增加对溶菌酶的敏感性和原生质体的再生频率;当原生质体在4℃中贮存24小时和48小时后,再生频率可分别下降达76%和和94%。     

产色链霉菌MY02原生质体制备条件的研究

菌株MY02为本实验室自蔬菜保护地土壤中分离获得的一株链霉菌菌株熏该菌株对多种植物病原菌的抑菌活性较好,菌株MY02在菌丝培养液中的对数生长期为50～55h。培养基中加入0.5%～1%的甘氨酸可以提高菌丝体对溶菌酶的敏感度,25%的蔗糖浓度即可保证形成一定量的菌丝,又可使菌丝的分散程度较好,有利于原生质体的释放;对数生长后期的菌丝体形成原生质体的速度与初期、静止期差别不显著。在35℃水浴条件下,菌株MY02最佳溶菌酶浓度为2mg·mL-1,形成每毫升超过107个原生质体的时间30min。     

茂源链霉菌原生质体的制备与再生

【目的】探索制备高纯度茂源链霉菌原生质悬液的条件,为原生质体融合提供支持。【方法】在茂源链霉菌菌丝体一级培养不同时间(4,8,12,16,20,24,28,32,36,40,44,48h)后,称取菌丝体干质量,确定一级培养最佳时间;将一级培养的菌丝体转接培养二级菌丝体,在不同培养时间(13,14.5,16,17.5,19,20.5h)根据原生质体制备率、再生率的综合情况及菌丝体形态显微镜观察结果,确定二级菌丝体的培养时间及培养基中添加甘氨酸的最佳质量浓度(0,2,5,10,20g/L),根据原生质体制备率和再生率确定使用溶菌酶的质量浓度(2,5,8,10,20,50mg/mL)和酶解时间(1,2,3,4,5,6,7,8h),使用不同方法(500r/min离心法与双层18μm和0.45μm滤膜过滤法)分离原生质体,对原生质体分离后的损耗情况进行比较,确定分离条件。【结果】茂源链霉菌一级菌丝体的最佳培养时间为28h;二级菌丝体培养的最佳条件为:在培养基中添加5g/L甘氨酸,培养16h,溶菌酶最适质量浓度为8mg/mL,酶解3~4h;以500r/min离心分离原生质体可以获得较纯净的原生质体悬液;茂源链霉菌原生质体制备率最高达97.82%,再生率最高达9.04%,纯度最高达87.53%。【结论】得到了制备高纯度的茂源链霉菌原生质体悬液的条件。     

水稻纹枯病菌原生质体制备与再生条件的优化

为获得进行水稻纹枯病菌遗传转化所需的高质量原生质体,选用该病菌强致病力菌株GD-118,分别从酶种类、菌龄、酶解时间、酶解温度、酶液pH值和渗透压稳定剂及其浓度6个方面优化了原生质体的制备条件,从酶解时间和渗透压稳定剂及其浓度2个方面优化了原生质体的再生条件。结果表明:优化后的水稻纹枯病菌原生质体制备的最佳条件组合是"纤维素酶+溶菌酶+崩溃酶"组合酶、总酶终质量浓度10mg/mL、菌丝菌龄15h、酶解时间3h、酶解温度35℃、酶液pH5.6、以0.6mol/LMgSO4.7H2O为渗透压稳定剂,此最佳条件组合所制备的原生质体产率高达4.00×107/g;原生质体最佳的再生条件是酶解3h的原生质体在含1.0mol/L甘露醇的再生培养基上26℃时进行培养,在此条件下可获得最佳的再生效果,再生率为39%。     

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63原生质体形成 和再生条件的初探

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63在温室及大田试验中都对棉花黄萎病菌表现出很强的拮抗作用,是一株很有应用潜力的生防菌株。不论是菌丝体本身还是其代谢产物都对多种植物病原菌有很强的抑制作用。对该生防菌株进行深入研究,尤其是分子水平的研究尤为重要。笔者通过研究影响链霉菌原生质体形成的多种条件和因素,包括培养基的选择、培养时间、甘氨酸浓度、溶菌酶浓度、酶解时间等,最终成功的制备出了生防菌Men-myco-93-63的原生质体,初步确定了其形成条件:TSB培养基一级培养24h,用SGGP作为二级培养基培养菌丝体40h(补加甘氨酸2%),将菌丝体加入2mg/ml溶菌酶37℃水浴60min后即可得到原生质体,涂在再生培养基R5上再生培养,再生数可达4.8×106个/ml。为该生防菌原生质体的转化、基因表达等研究奠定了重要的基础。     

地衣芽孢杆菌B-1和鞘氨醇单胞菌SC-1原生质体制备与再生条件的研究

以地衣芽孢杆菌B-1和鞘氨醇单胞菌SC-1为出发菌株,研究了其原生质体制备和再生的影响因素,为利用原生质体融合技术选育β-氯氰菊酯高效降解菌奠定了基础。结果表明,菌株B-1原生质体制备的适宜条件为:菌龄13 h,溶菌酶浓度0.1 mg/m L,溶菌酶作用时间15 min,原生质体形成率为93.11%,再生率为7.22%;菌株SC-1原生质体制备的适宜条件为:菌龄12 h,EDTA浓度5 mmol/L,溶菌酶浓度3.33 mg/m L,溶菌酶作用时间15 min,原生质体形成率为95.37%,再生率为27.04%。     

蜗牛酶高效制备白色念珠菌原生质体的研究

为了寻求以蜗牛酶经济高效的白色念珠菌原生质体的制备方法,以白色念珠菌为材料,研究了菌龄、预处理剂、酶浓度、作用时间、高渗稳定剂等因素对原生质体制备率和再生率的影响。结果表明,以蜗牛酶制备白色念珠菌原生质体的最佳菌龄是培养10～14 h的菌体,最佳预处理剂配方为50 mmol/L Tris(pH8.0)、50 mmol/L EDTA和5%巯基乙醇,1%蜗牛酶在37℃酶解1 h原生质体制备率可达90%以上,此原生质体采用夹层平板培养法在0.7 mol/L NaCl高渗培养基中培养,再生率最高可达95%。本研究表明单独用蜗牛酶高效制备高质量的白色念珠菌原生质是可行的。     

克鲁丝假丝酵母原生质体形成与再生条件的研究

研究了菌龄，酶浓度，酶作用时间，脱壁促进剂，渗透压稳定剂对克鲁丝假丝酵母（C.krus)原生质体形成与再生的影响，通过单因子试验，综合考虑形成率与再生率后，确定选用对数生长中期的菌体，以17%蔗糖为渗透压稳定剂，0.1%β-巯基乙醇进行预处理，2%蜗牛酶30℃作用60min为制备克鲁丝假丝酵母原生质体的最佳条件。     

马铃薯疮痂病新致病种Streptomyces galilaeus CPS-2转化体系的建立

为建立马铃薯疮痂病新致病种Streptomyces galilaeus典型菌株CPS-2的转化体系,对该菌的原生质体制备和再生条件进行了筛选。结果表明,菌株CPS-2原生质体制备的最适条件为:TSB培养基一级培养24h,改良YEME培养基(含10%蔗糖和1.0%甘氨酸)二级培养60h,溶菌酶用量为3.0g/L,37℃酶解90 min,原生质体形成量可达4.4×109个/mL;在R2YE培养基上再生率可达22.71%。采用含25%PEG1000的Tbuffer介导转化质粒pIJ702,24h后覆盖含有硫链丝菌素的营养软琼脂,4d后可筛选到转化子,每微克质粒DNA可获得102~103个转化子。     

龟裂链霉菌（Streptomycesrimosus）原生质体制导与再生条？…

报道了龟裂链霉菌原生质体制备与再生最佳条件和该原生质体对抗生素的抗性结果。在Ｓ生长培养其中加入φ＝１％甘氨酸进行菌丝体培养２４ｈ,原生质体制制备最佳条件为：溶菌酶浓度φ＝３％、     

绿色木霉原生质体制备与再生条件的探索

研究菌丝体培养时间、酶组合、酶浓度、酶解时间、酶解温度、稳渗剂类型、再生培养方式等对绿色木霉原生质体制备及再生的影响。结果表明,绿色木霉原生质体制备的优化条件为：菌丝体培养60h,用1.5%溶菌酶＋0.5%蜗牛酶的混合酶液,在pH值6.0～6.5,30～35℃,酶解4h,以0.7mol/L甘露醇为稳渗剂,原生质体的产量可达1.68×107个/ml;原生质体再生的优化条件为：PDA为再生培养基,以0.5mol/L蔗糖为稳渗剂进行双层固体培养,原生质体的再生率为6.05%～6.12%。     

动物肠道优势需氧菌原生质体制备与再生研究

从动物肠道优势需氧菌中筛选适于原生质体制备和再生的菌株,确定其原生质体制备与再生的最佳条件,为今后作为与厌氧菌原生质体融合的亲本奠定基础。研究发现,供试20株不同动物肠道优势需氧菌中,只有来自ICR小鼠肠道的M3,M4,M5和M6以及来自猪肠道的Z5对溶菌酶较为敏感。进一步研究发现,5株溶菌酶敏感菌株以来自ICR小鼠肠道的M6(即弗氏埃希氏菌株Escherichia fergusonii M6)原生质体制备率和再生率均最高。进而以菌株M6为试材,研究不同菌龄、酶浓度、酶解时间、渗透压稳定剂以及添加不同化学组分等对菌株M6原生质体制备与再生的影响。通过本研究确定的菌株M6原生质体制备与再生的最佳条件为:菌龄5h,溶菌酶浓度20mg/mL,脱壁时间45min,渗透压稳定剂为0.7mol/L山梨醇,向再生培养基中同时添加0.8%牛血清蛋白和0.1mol/L N-乙酰氨基葡萄糖,此时原生质体平均制备率与再生率分别为87.80%和85.42%。     

蛹虫草原生质体的制备和再生研究

研究了不同渗透压稳定剂、酶的种类及浓度、温度、pH、β-巯基乙醇预处理等条件对蛹虫草原生质体制备的影响,以及不同培养基对原生质体再生的影响。结果显示蛹虫草菌株原生质体的最佳制备和再生条件为:0.7 mol/L氯化钠作为渗透压稳定剂,纤维素酶5 mg/dL、蜗牛酶5 mg/dL、溶菌酶5 mg/dL、溶壁酶10μL混合酶解6 h,酶解温度为30℃,最佳pH 5,再生培养基为PDA(添加0.7 mol/L氯化钠)。     

1株降酚菌的原生质体制备和再生研究

为了优化组合降酚菌原生质体制备与再生的条件。以从合肥钢厂焦化废水处理池的活性污泥中驯化筛选得到1株高效降酚假单胞菌为材料,通过正交实验,探讨蔗糖浓度、溶菌酶浓度E、DTA浓度和酶解时间对该菌原生质体制备与再生的影响。原生质体制备与再生的最优条件:蔗糖浓度20%,溶菌酶浓度0.5 mg/ml,EDTA浓度0.2%,酶解时间40 min。在此条件下,它的菌株形成率为75.3%,再生率为7.8%。影响降酚假单胞菌原生质体形成率的因素顺序为蔗糖浓度>溶菌酶浓度>作用时间>EDTA浓度。