巴西橡胶树棒孢霉落叶病病菌蛋白激酶基因突变体△CCK1的互补载体构建及转化

为了明确蛋白激酶CCK1在巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌中的致病相关功能,在前期研究基础上通过PCR扩增,获得了该基因1604 bp的5′端片段（L－C5）和131 bp的3′端片段（L－C3）,同时以pCAMBIA3300质粒为模板扩增获得了552 bp抗性标记基因（L－Bar）,并用In－FusionHD Cloning Kit将L－Bar基因反向插入了L－C5和L－C3序列之间,克隆至pUC19载体上,成功构建了△CCK1突变体的互补载体p△CCK1－C。再从该载体上扩增互补片段,借助PEG介导法转化△CCK1突变体的原生质体,经Basta平板筛选、PCR检测和测序鉴定表明,获得了△CCK1突变体的互补转化子。为进一步明确CCK1基因在巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌中的致病相关功能打下了材料基础。     

hpaXm和hpaXm-IP基因对棉花角斑病菌V8表型及HR的影响

试验前期通过构建相应敲除载体,采用电转化的方法,分别获得Xanthmonas.citri subsp.malvacearum(简称Xcm)菌株的hpaXm基因缺失突变菌株V8ΔhpaXm和hpaXm-IP基因缺失突变菌株V8ΔhpaXm-IP。通过特殊生长平板及烟草接种试验表明,与V8菌株相比,突变菌株胞外多糖产量以及胞外纤维素酶、脂酶活性不变,V8ΔhpaXm菌株的胞外淀粉酶活性显著降低;3种菌株都不能产生胞外蛋白酶;突变菌株在烟草上形成的坏死斑面积变小。表明hpaXm和hpaXm-IP基因与病菌胞外淀粉酶活性及病菌激发烟草过敏反应的能力有关,与胞外多糖、纤维素酶、蛋白酶和脂酶产生无关。同时预示了hpaXm-IP可能具有牵引HpaXm蛋白泌出的能力,且HpaXm蛋白不是V8菌株中唯一激发烟草HR的活性物质,hpaXm及hpaXm-IP可能会影响V8菌株的致病性,但不是必然的。     

谷氨酸棒杆菌信号肽探测载体的构建及强信号肽筛选

强信号肽的使用是提高蛋白分泌效率的关键,筛选强信号肽具有重要的应用价值。本试验以大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌基础穿梭载体pAU2为骨架,以枯草芽孢杆菌的碱性丝氨酸蛋白酶AprE为报告蛋白,分别使用强启动子tac-M和谷氨酸棒杆菌核糖体结合位点一致序列来控制报告基因的转录和翻译,成功构建谷氨酸棒杆菌信号肽探测载体pAU20。分别对来自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、以及谷氨酸棒杆菌中共16种Sec型信号肽编码序列进行PCR扩增,与pAU20连接,转化谷氨酸棒状杆菌,获得重组信号肽探测载体工程菌株。工程菌株摇瓶发酵培养物上清液AprE酶活测定结果表明,C. glutamicum/pAU20-Vpr、C. glutamicum/pAU20-BprA上清液比酶活分别为180.02和167.6U/mg蛋白质,均显著高于C.glutamicum/pAU20-cgr2070上清液比酶活(105.09 U/mg蛋白质);C. glutamicum/pAU20-oppA、C. glutamicum/pAU20-Epr、C. glutamicum/pAU20-cgr2063和C.glutamicum/pAU20-ywaD上清液比酶活分别为96.68、86.18、82.52和80.56U/mg蛋白质,均稍低于C. glutamicum/pAU20-cgr2070上清液比酶活。这些结果表明,信号肽Vpr、BprA、cgr2070、oppA、Epr、cgr2063和ywaD都属于谷氨酸棒杆菌强信号肽。     

玉米大斑病菌ATMT突变体库的构建及其分析

【目的】利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的遗传转化技术,对玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）进行转化,构建ATMT突变体库,为从分子水平上揭示病菌的致病机理奠定基础。【方法】以带有重组双元载体的农杆菌对玉米大斑病菌进行转化,利用潮霉素B进行筛选,对抗性稳定的转化子进行PCR检测,构建玉米大斑病菌ATMT突变体库;从突变体库中随机选取一定数量的突变体,对其菌落形态、菌丝及分生孢子发育、致病性等进行分析。【结果】获得了1 265株玉米大斑病菌T-DNA插入突变体;从中随机选取36株突变菌株,对其进行抗性筛选和PCR检测,发现潮霉素磷酸转移酶基因已整合进入野生型菌株的基因组中,且能够稳定遗传;与野生型菌株相比,在供试的菌株中,大部分菌株菌落形态和生长速率没有发生明显改变。生长速率明显减慢的菌株占总数的13.8%,明显加快的菌株占16.7%;发现了2株分生孢子形态发生明显改变的菌株,占菌株总数的5.6%;产孢量明显增大的菌株占5.6%,产孢量减少的菌株占13.5%;分生孢子萌发率发生明显改变的菌株占16.6%;发现了1株致病性明显增强的菌株,占菌株总数的2.8%。【结论】构建了玉米大斑病菌ATMT突变体库,并对突变体库进行了初步分析,将为克隆玉米大斑病菌生长发育和致病性相关基因奠定基础。     

新型毕赤酵母分泌表达载体的构建与功能验证

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是目前应用最广泛的外源蛋白表达系统之一。用于毕赤酵母表达系统的表达载体种类繁多,却因需要甲醇诱导表达或者基因转化过程中引入抗生素基因而限制了其在食品行业中的应用。研究设计以毕赤酵母组成型启动子-GAP启动子替换毕赤酵母表达载体pPIC9上的甲醇诱导型启动子AOX,成功构建了毕赤酵母组成型表达载体pGAPHα。并以里氏木霉木聚糖酶基因xyn2为报告基因进行功能验证,结果表明,该载体可实现xyn2基因在毕赤酵母中的高效表达。在此基础上以经密码子优化后的克鲁维酵母菊粉酶基因信号肽INU替换载体上原有的α-Factor信号肽,结果表明,INU信号肽能够有效引导XYNII的分泌。     

茂源链霉菌MTG基因pMA5载体的构建及鉴定

[目的]提高MTG产量并实现简便有效的纯化过程,以枯草芽孢杆菌为宿主构建pMA5_(mtg)重组质粒。[方法]通过提取茂源链霉菌的基因组DNA,扩增mtg基因片段,再将异源信号肽与mtg基因片段进行融合,融合片段和pMA5质粒双酶切后连接,转化到大肠杆菌感受态细胞中,菌落PCR和测序获得阳性单克隆。然后将pMA5_(mtg)重组质粒转入枯草芽孢杆菌感受态中,通过抗性筛选和双酶切鉴定获取重组菌株。[结果]成功扩增出mtg基因片段,构建出重组质粒pMA5_(mtg)。[结论]获得pMA5_(mtg)重组表达菌株,为MTG的纯化及其未来生物工程的改造提供了有效的方法。     

捕获输出蛋白编码基因的小分子量质粒载体的构建与验证

自行设计一对引物,从质粒pUC18上扩增一段无启动子和信号肽的β-内酰胺酶基因(△P△SP Amp),经pGEM-T-EASY载体克隆到pET-28衍生质粒pKan的EcoRⅠ和XbaⅠ间,得到在Kan平板中生长而在Amp和Kan双抗平板中不能生长的转化子pMBL-E质粒.经部分酶切补平自连,筛选得到消除HindⅢ位点端EcoRⅠ位点的质粒,即为用于输出信号基因片段捕获的目的载体pMBL,大小为 3.46 kb.经酶切鉴定和测序分析,表明构建的载体与预期设计的一致,并应用四环素抗性基因(Tetr)对载体的有效性进行了验证,证明构建的载体pMBL能有效捕获含启动子和信号肽序列的输出蛋白编码基因.     

山羊乳腺特异性表达慢病毒载体的构建与验证

[目的]构建山羊乳腺特异性表达尿激酶原突变体的重组慢病毒载体,证明其表达的有效性。[方法]将劳氏肉瘤病毒增强子／启动子、复制缺陷型艾滋病病毒（HIV-1）的5’端长重复序列（LTR）、HIV-1ψ卫包装信号、HIVRev反应元件、山羊B-casein调控序列、pro—UKM13、△U3／3’LTR依次连接,构建乳腺特异性表达的慢病毒载体;通过体外转染人乳腺癌细胞系（MCF-7）、仓鼠卵巢细胞（CHO）和泌乳山羊乳腺注射证明其表达有效性。[结果]构建的山羊乳腺特异性表达载体酶切鉴定是正确的;利用该载体转染细胞,采用溶圈法和Westernblot检测证实了其表达的有效性;慢病毒载体注射到泌乳山羊的乳腺,在乳汁中也检测到了尿激酶原的表达。[结论]为在转基因动物的乳腺中表达尿激酶原突变体奠定了基础。     

棉花角斑病菌V8高效电转化条件的探索

对去甲基化氮胞苷(5-AZA)的最佳浓度以及影响棉花角斑病菌[Xanthmonas campestris pv.malvacearum(Xcm)]V8电转化效率的诸多因素进行逐一研究,以期获得高效的电转化条件。结果表明,选取100μmol/L的5-AZA驯化处于对数中期的V8制备感受态细胞;保证电压2.1 kV、50μg/mL质粒7μL、4℃预冷复苏培养基SOC、振荡复苏培养4～5 h时,V8的电转化效率高达5×102/μg DNA。     

杀虫基因高效植物表达载体的构建

以质粒pCAMBIA1200、pBI121、pMMAR和pC1300MAR为基础,通过酶切连接,构建植物中间载体pC2MARHyg;再利用pAVAc质粒、载体pGA1611和中间载体pC2MARHyg,构建含有Ubi-1启动子、顺向重复MAR和杀虫基因AVAc的高效植物表达载体pC2MAR-AVAc,然后转化农杆菌EHA105,经筛选鉴定获得阳性克隆,为进一步开展植物抗虫基因工程研究奠定基础。     

鸡卵清蛋白基因调控序列的克隆与载体构建

卵清蛋白（ovalbumin）基因在鸡基因组中只有一对等位基因,却能每天合成分泌多达2 g的蛋白,占据卵白蛋白质的50%以上,是外源基因载体表达调控构件的首选。该研究从输卵管特异性启动子方面着手,通过对卵清蛋白基因启动子的筛选优化,找出启动子增强因子的位置以及组织特异性区域。将卵清蛋白基因上游-922～-2 073和-2 801～-3 100区域平均分成12个长度约为150 bp的序列,分别插入到-921～+38序列的上游,成功构建12个系列表达载体,为进一步筛选短缩版优化启动子提供材料;卵清蛋白基因第一内含子区域截断成300 bp左右的迷你内含子序列,成功构建8个迷你内含子系列载体,为筛选优化的迷你内含子提供必要的材料;成功分离鸡输卵管上皮细胞并优化电转染条件,通过荧光素酶活性检测初步筛选出具有最强活性重组质粒pGL4 UP 1412和内含子重组质粒pGL4 mini intron 3,同时推断出若干包含增强子序列区域。     

csi-miR399响应柑橘溃疡病菌侵染的表达模式及其抗病性分析

【目的】明确csi-miR399响应柑橘溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）侵染的表达模式,筛选其靶基因,进而分析csi-miR399与寄主Xcc抗性的相关性,为柑橘溃疡病抗性种质的创制打下基础。【方法】分别以柑橘溃疡病抗性品种四季橘（Citrus microcarpa）和感病品种纽荷尔脐橙（Citrus sinensis）为试材,通过茎环qPCR方法分析csi-miR399在叶片离体注射Xcc 1、3和5 d时的表达量变化,明确抗/感品种中csi-miR399响应Xcc侵染的表达模式;利用在线软件psRNATarget预测csi-miR399的靶基因,并通过qPCR分析候选靶基因在接种Xcc柑橘叶片和瞬时表达csi-miR399叶片中表达量的变化;克隆csi-miR399前体基因序列,通过同源重组方法构建病毒表达载体pCLBV202-MIR399,根癌农杆菌介导的真空浸润法接种尤力克柠檬（Citrus limon）,通过qPCR分析csi-miR399表达量;进而采用离体叶片针刺法接种Xcc,观察发病症状,统计病情指数,分析csi-miR3...     

抗菌肽Lactoferricin基因的PCR合成及克隆载体T-Lfn的构建

Lactoferricin是一种天然抗菌肽。试验进行了Lactoferricin基因的PCR合成,将其引入质粒,转化E.coliJM-109,并进行PCR鉴定、酶切鉴定及测序,成功构建了Lactoferricin基因克隆载体T-Lfn。     

瓜类细菌性果斑病菌tvrR基因的克隆及其对致病性的影响

根据丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)DC3000中新的毒性基因tvrR(TetR-like viru-lence regulator)的氨基酸序列,从瓜类细菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli,Aac)的全基因组中发现并克隆了tvrR基因的同源物。通过同源重组的方法,构建了tvrR基因的插入突变体,并且经过PCR及Southern杂交验证确认。突变体和野生型一样可以激发烟草过敏反应。致病性试验结果显示:突变体比野生型的病程延长,但最终致病情况与野生型无差异。接种的寄主组织中菌体生长能力检测发现,突变体的繁殖速度慢于野生型,但最终其菌体数量也能达到野生型菌株的最大值。在营养丰富的LB培养基和营养贫乏的MMX基本培养基中生长测定均发现,突变体生长速度慢于野生型,但最终也能达到野生型的最大生长量。瓜类细菌性果斑病菌tvrR基因突变体致病性的改变与其生长能力变化的一致性表明,其致病性的变化是由于其生长能力的改变引起的。     

waxy Locus and Its Mutant Types in Maize Zea mays L.

The waxy （wx） locus of Zea mays L. encodes a granule-bound starch synthase （GBSS I = waxy protein） required for the synthesis of amylose in endosperm and pollen grain. This review covers recent advances in understanding the waxy locus in maize, focusing particularly on the new information on mutant type and mutation mechanisms. The results showed that the insertion and deletion played an important role in the generation of spontaneous wx-mutations. The current status of utilizing waxy locus has been summarized and the perspectives of the further studies on this locus have also been proposed.     

拟南芥缺铜敏感突变体的鉴定分析

为进一步探明植物缺铜响应机制,利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变、体视显微形态观察和ICP-MS技术对拟南芥(Col)缺铜敏感突变体cds-1进行鉴定分析。结果表明:在缺铜条件下,cds-1的根伸长发育受到抑制,而高浓度铜处理则可使得cds-1根长部分恢复至野生型。除根伸长发育受到抑制外,cds-1根部形态(根毛长度和根直径)与野生型相比也有较大差异。cds-1与野生型植株体内铜含量无显著差异。遗传分析该突变体性状由2对隐性等位基因控制。     

NTE基因ShRNA慢病毒载体的构建与鉴定

【目的】构建神经病靶酯酶(NTE)蛋白低表达的ShRNA重组慢病毒表达系统。【方法】依照ShRNA序列设计原则设计带酶切位点的NTE ShRNA序列,与表达载体pLL3.7连接构建NTE ShRNA重组表达质粒,转染DH5α菌观察重组表达状况,与pCVM-VSV-G包膜质粒和pCMV-dr8.2dvpr表达质粒共转染293T细胞,包装得到重组慢病毒。用病毒稀释法以绿色荧光蛋白(GFP)为标记,确定转染效率及病毒含量。【结果】经酶切及测序鉴定结果显示成功构建pLL3.7-NTE ShRNA慢病毒载体。重组慢病毒质粒与辅助质粒共转染293T细胞后获得高表达的细胞,共转染48h后,收集病毒液检测病毒滴度达4.5×10~4/mL。【结论】成功构建NTE ShRNA慢病毒重组表达系统。     

Bt基因的克隆及植物表达载体的构建

试验将从质粒pB110上克隆得到的Bt基因的片段,连接到高效的植物表达载体质粒pBI121上,此重组质粒经过限制性内切酶酶切分析和PCR鉴定,证明含有抗虫基因的植物表达重组质粒已构建成功。