利用绿色荧光蛋白优化辣椒遗传转化体系

【目的】农杆菌介导的辣椒遗传转化较为困难,至今仍未建立高效转化体系。绿色荧光蛋白(GFP)基因是植物遗传转化中常用的报告基因,以GFP为报告基因,优化农杆菌介导的辣椒遗传转化体系。【方法】利用GFP表达系统,统计3个辣椒品种(‘HP’‘8214’和‘L55’)中3种不同外植体(子叶、下胚轴和Flamingo-bill外植体)的不定芽分化率、不定根分化率与荧光阳性率,探究农杆菌侵染浓度、侵染时间、预培养时间和共培养时间等因素对不定芽、不定根分化率及荧光阳性率的影响。【结果】3个辣椒品种的Flamingo-bill外植体不定芽分化率均显著高于下胚轴与子叶外植体,其中‘L55’ Flamingo-bill外植体的不定芽分化率最高、达77.59%,故选用‘L55’ Flamingo-bill外植体进行后续研究。4种农杆菌不同侵染浓度和时间组合下,‘L55’Flamingo-bill外植体均可产生不定芽、不定根及表达GFP的愈伤组织,当农杆菌侵染浓度为OD₆₀₀=0.05,侵染时间为30 min时,不定芽分化率和荧光阳性率最高,分别达48.39%、4.84%。在6种不同预培...     

黄瓜高效遗传转化体系的建立及银杏抗菌肽转化

建立黄瓜的高效再生和遗传转化体系,并进行银杏抗菌肽GK-2的遗传转化。研究结果表明,MS6(MS+0.005 mg/L TDZ+0.20 mg/L IAA)培养基适于黄瓜愈伤组织的形成和不定芽分化,7 d即可分化出不定芽,出愈率和分化率分别高达100%和86.67%。进一步用带有银杏抗菌肽GK-2目的基因的农杆菌转化黄瓜,筛选出了侵染时间20 min、共培养时间3 d以及卡那霉素抗性筛选质量浓度为100 mg/L的最佳转化体系。利用该体系转化黄瓜,获得的转化植株阳性率高达17.9%,并对黄瓜枯萎病表现出明显的抗性。     

农杆菌介导的三月茄遗传转化体系的优化研究

以普通三月茄为材料,利用农杆菌介导法对茄子进行遗传转化.通过设置一系列对照组,筛选出最佳诱导分化培养基及高效的抗生素组合、对比茄子子叶与下胚轴的诱导分化效果,从而对茄子的遗传转化体系进行优化和改良.结果表明:最佳诱导培养基为MS+6-BA 2 mg/L+ZT 1 mg/L;使用子叶作为外植体时,农杆菌介导的茄子遗传转化率达到了11.02%,其愈伤组织和不定芽的诱导率均显著高于下胚轴;当采用Carb 250 mg/L+Kan 100 mg/L的组合时,可以得到最佳的诱导效果,且在一定范围内,适当降低Carb与Kan浓度的比值,可以提高出愈率.     

天等1号辣椒遗传转化再生体系的研究

对天等1号辣椒的子叶、带柄子叶、带柄真叶和F lam ingo-b ill外植体进行了遗传转化,比较不同激素及其水平对不同外植体芽分化的影响,以及外植体对卡那霉素的敏感性。结果表明,仅有以F lam ingo-b ill为外植体所形成的愈伤组织,能在培养基M S ZT 1.0m g/L IAA 0.2m g/L A gNO32.0m g/L上诱导芽的分化(63%的分化率),在培养基M S ZT 1.0m g/L IAA 0.2m g/L A gNO32.0m g/L GA32.0m g/L上使诱导芽伸长(15%的芽伸长率)。抗性筛选最适卡那霉素浓度为50m g/L。通过根癌农杆菌介导法转化,共获得33株抗性再生苗。PCR和PCR-Sou thern杂交检测结果表明,94%的抗性植株检测到报告基因nptII片段。     

洋桔梗Double Mariachi Rink高效遗传转化体系的建立

以洋桔梗品种Double Mariachi Pink为供试材料,探讨影响根癌农杆菌介导法遗传转化的一些因素,包括Cb(羧苄青霉素)脱菌浓度、Km(卡那霉素)筛选浓度、农杆菌的侵染浓度和预培养时间等.研究结果表明:脱菌培养基中Cb的浓度为200mg/L时,抑制农杆菌生长但不显著影响叶片不定芽分化;不定芽分化阶段和生根阶段的适宜Km筛选浓度分别为30mg/L和15mg/L;外植体预培养3d,在D600nm≈0.5的农杆菌菌液中侵染10 min后,Km筛选得到的抗性植株GUS染色蓝斑率最高,达到86.7%.     

根癌农杆菌介导欧美杨108遗传转化体系的优化

[目的]优化根癌农杆菌介导的欧美杨108遗传转化体系。[方法]以欧美杨108无菌苗的叶片为外植体,通过农杆菌介导法对其遗传转化体系进行优化研究。[结果]试验获得的优化转化体系如下:农杆菌介导欧美杨108遗传转化的潮霉素最佳叶片分化浓度为2mg/L,生根浓度为1 mg/L。优化筛选的最适转化条件为:预培养48 h,菌液浓度OD600为0.4,侵染15 min,共培养48 h。试验共获得18个抗性愈伤和抗性芽,转化频率为4.3%;经PCR检测初步证明TCS基因已整合至欧美杨108再生植株中。[结论]该研究建立了高效欧美杨108叶片农杆菌介导的遗传转化体系。     

野生白芨再生体系的建立及抗性筛选

建立白芨的再生体系和优化抗性筛选的最佳条件,为野生白芨高效遗传转化体系的建立奠定基础。以野生白芨种子为外植体,研究野生白芨种子在萌发、愈伤组织诱导、丛生芽分化和增殖以及不定根诱导的最佳培养基,并利用梯度筛选出其对卡那霉素(Kan)和氨苄青霉素(Amp)的抗性。种子萌发最佳培养基为1/2MS+0.8 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+100 g/L马铃薯;不定芽分化最佳培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+8 mg/L硝酸银+50 g/L马铃薯,诱导率高达95%;诱导生根最佳培养基为1/2MS+0.8 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+100g/L马铃薯。100 mg/L Kan和100 mg/L Amp为野生白芨遗传转化的最佳筛选压;培养过程中添加外源有机物可以有效地促进愈伤组织和不定芽的分化与增殖。建立了野生白芨种子的再生体系,发现了野生白芨种子的第3条发育途径——愈伤组织分化途径,并筛选出了适宜于野生白芨遗传转化体系的Kan和Amp筛选压。     

花生上胚轴为外植体的植株再生及转化研究

以8 d龄花生无菌苗的上胚轴为外植体,进行植株再生和农杆菌介导遗传转化研究.结果表明,上胚轴能高效诱导花生植株再生,外植体在MS 3 mg/L TDZ 6 mg/L 6-BA 1.5 mg/L NAA培养基上能高效诱导不定芽分化,10 d时诱芽率达100%;不定芽接种到MS盐 B5维生素 3mg/L TDZ 0.01%酵母粉培养基中15 d诱导出大量丛生芽;MS 0.5 mg/L NAA培养基较适合诱导丛生芽生根,25 d时生根率达82%.筛选确定35 mg/L潮霉素浓度为转化筛选压,以含AtRD29Ap::GUS融合基因的根癌农杆菌侵染8 d龄上胚轴10 min,共培养3 d,经上述再生体系,以潮霉素筛选获得1株拟转化再生植株.     

保加利亚尖椒遗传转化体系的建立

以保加利亚尖椒子叶为外植体,通过农杆菌介导法将抗真菌三价载体（GCR）遗传转化至辣椒,建立了适合辣椒转化的高效再生体系,结果表明：在侵染液pH：值5．2、预培养2d、侵染时间7～8min、无AS、共培养2d的条件下,抗性不定芽的诱导分化率达到89％,转基因植株经PCR、Dot blotting检测证明外源基因已整合至辣椒基因组DNA中。     

秦烟遗传转化体系的优化

【目的】优化烟草的高效遗传转化体系。【方法】以陕西地区广泛种植的烟草品种秦烟98为试材,采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,LBA4404)介导法,将从酿酒酵母细胞中克隆到的具有较强耐盐表型的HAL1基因进行遗传转化,对农杆菌介导的遗传转化条件及其影响因素进行研究。【结果】用50 mg/L卡那霉素(Kan)筛选转化外植体用800 mg/L羧苄青霉素(Cb)除菌可以获得理想的筛选和除菌效果。以优化的农杆菌介导烟草叶片的遗传转化条件为:将未经过预培养(预培养0 d)的外植体用稀释150倍的农杆菌菌液(OD600=0.5)浸泡1min,转至MS1培养基上共培养48 h,用无菌水冲洗后于体积分数2%NaClO中浸泡15 min,用无菌水冲洗4~5次,置800 mg/L Cb+质量分数0.1%的甘露醇中浸泡约12 h除菌。【结论】获得了农杆菌介导烟草叶片遗传转化的最佳优化条件,有效地减少了外植体的污染率,提高了抗性芽分化率。     

提高金柑实生态离体再生效率的研究

金柑童期短,1年可多次开花结果,有利于通过遗传转化开展花、果性状和相关基因在花、果实中表达的研究,但目前金柑实生苗再生率还有待提高。以广西阳朔的金弹金柑实生苗节间茎段为材料,发现以35 d苗龄(暗培养25 d,光照10 d)的实生苗节间茎段为外植体材料,培养于再生培养基(MS+3 mg/L 6-BA)上50 d左右,可达到80%以上的不定芽再生率。而经过农杆菌侵染后,以MS+2 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA+1 mg/L KT为共培养基,MS+3 mg/L 6-BA为筛选培养基时,并在50 mg/L卡那浓度筛选下,仍可获得13.3%的抗性芽再生率。不定芽切下放置于生根培养基(1/2MS+3 mg/L IBA+1 g/L活性炭)中获得86%左右的生根率。通过对影响不定芽和抗性芽再生频率的各种因素进行研究,最终建立了一套有效的金柑实生苗节间茎段离体再生体系。     

钟冠唇柱苣苔组织培养研究

为了筛选出适合钟冠唇柱苣苔[Chirita swinglei (Merr.) W.T.Wang]不定芽诱导、分化和生根的培养体系,以其嫩叶为材料,在不同培养条件下进行了组织培养研究.结果表明,用体积分数为75％的乙醇灭菌20 s,再用1g/L HgCl2浸泡7 min为最佳的外植体灭菌方法;MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L为不定芽诱导的最适培养基;MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L为不定芽分化的最适培养基;1/2MS+NAA 0.1 mg/L+活性炭1 g/L为最适的生根培养基.     

杂种枫香组织培养再生研究

目的枫香具有适应性强、生长速度快、观赏价值高等特点,既可以作为用材树种又可以作为优良的园林绿化树种。北美枫香能够与中国枫香杂交并可产生有杂种优势的后代,但是杂种枫香的快速繁殖技术和遗传转化体系还有待完善。方法本研究以北美枫香为母本,中国枫香为父本进行杂交,选用子一代杂种枫香的子叶、子叶节以及下胚轴为外植体材料建立高效的组培再生体系,并对3种外植体的分化能力进行比较。结果(1) 子叶和子叶节外植体最佳芽诱导培养基为0.2 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA的WPM培养基,而下胚轴外植体最佳芽诱导培养基为0.1 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA的WPM培养基。(2)3种外植体在0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.8 mg/L GA不加琼脂的WPM芽伸长液体培养基中获得最高的平均不定芽诱导数。(3)不定芽在2.0 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA的WPM培养基中生根,生根率达到100%。(4)不定芽生根培养2个月后长为完整植株,移栽成活率在90%以上。结论(1) 杂种枫香3种外植体的分化能力依次为:子叶节>子叶>下胚轴,其中子叶节的分化能力显著高于子叶和下胚轴。(2)TDZ能够有效促进不定芽的诱导,GA对不定芽的伸长具有显著的影响。(3)杂种枫香外植体在固体培养基中获得了最高的不定芽诱导率,在液体培养基中获得了最高不定芽平均数量,而且液体培养中未出现玻璃化。本研究为杂种枫香新品种的快速繁育以及遗传转化体系的建立奠定了良好的基础。      

农杆菌介导的NPKI基因转化辣椒的研究

以3个辣椒(Capsicum annuum L.)品种为试材,探讨了通过农杆菌介导法将烟草NPKI(参与细胞周期调控的MAPKKK激酶)基因转化辣椒的适宜条件.结果表明,切取14d苗龄子叶外植体,在MS无机盐成分 B5有机成分 0.5mg/L IAA(吲哚乙酸) 5.0 mg/L 6-BA(苄基氨基腺嘌呤)的琼脂培养基上预培养2d后,浸没于农杆菌菌液中侵染8～10min,共培养于MB(MS无机盐成分 B5有机成分) 0.5mg/L IAA 5.0 mg/L 6-BA上2d后转移至延迟培养基MB 0.5 mg/L IAA 5.0 mg/L 6-BA 250mg/L Cef(头孢霉素)延迟选择2d,随后转移至MB 0.5mg/L IAA 5.0mg/L 6-BA 250mg/L Cef 50mg/L Km(卡那霉素)进行选择培养是适宜的方法.将选择得到的抗性芽再生成苗.共获得抗性植株48株,PCR检测阳性植株17株,RT-PCR检测阳性植株14株.     

中黑防杨叶片不定芽再生体系的研究

[目的]研究6-BA与NAA不同质量浓度组合,不同的材料来源及不同的取材方法对中黑防杨叶片不定芽分化的影响。[方法]以中黑防杨试管苗叶片为外植体,以MS为基本培养基。[结果]中黑防杨叶片不定芽诱导的最佳6-BA与NAA质量浓度组合为,0.5mg/L的6-BA与0.05mg/L的NAA,其叶片不定芽诱导率为97.91%;最佳材料来源为生根试管苗,其叶片不定芽诱导率达96.66%;最佳取材方法为选取植株上部0.5cm左右幼嫩叶片,其叶片不定芽诱导率98.33%。[结论]建立了稳定的不定芽再生体系,为农杆菌介导的叶盘转化法奠定了基础。     

金合欢组织培养技术研究

以金合欢的种子为外植体进行离体培养,初步建立了金合欢离体培养再生体系。结果表明:最适宜诱导愈伤组织和不定芽的培养基是MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L;最适宜的增殖培养基是MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L;最适宜诱导生根的培养基是1/2MS+IBA 0.4 mg/L。     

野生紫斑百合高效离体再生体系的建立

 采用丽江野生紫斑百合鳞片为外植体,以MS为基本培养基,附加不同浓度激素,进行鳞片分化诱导、增殖和生根培养,筛选适宜激素浓度配比。结果表明：鳞片可以通过愈伤诱导发生途径再生,从愈伤组织上直接形成不定芽,最佳愈伤诱导培养基为MS+0.5mg/L TDZ+0.5mg/L NAA,诱导率为45.00%;不定芽增殖最佳培养基为MS+1.0mg/L 6BA+0.5mg/L NAA,增殖率为72.58%;最佳生根培养基为1/2MS + 1.5mg/L IBA,生根率达到93.33%。     

红茄子叶的不定芽诱导及植株再生

【目的】研究不同激素浓度和组合对红茄不定芽及根诱导的影响,建立红茄的高频再生体系,为开展茄子的遗传转化研究奠定基础。【方法】以红茄子叶为外植体,采用0.5~2.0 mg/L 6-BA、0.1~0.5 mg/L IAA激素组合对不定芽进行诱导,采用0~0.5 mg/L IAA对根进行诱导,筛选出最佳的分化培养基和生根培养基。【结果】在不定芽诱导培养基中,当6-BA浓度在0.5~2.0 mg/L时,随着浓度增加,不定芽分化率逐渐升高;当 IAA浓度在0.1~0.5 mg/L 时,随着IAA浓度的增加,不定芽萌发率呈先增加后降低趋势,其中以添加6-BA 2.0 mg/L、IAA 0.3 mg/L的诱导效果最好,分化率高达86%。在根诱导培养基中,随着IAA浓度的增加,根诱导率呈先降低后升高趋势,诱导率可达100.0%。【结论】红茄子叶不定芽诱导最佳培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IAA;不定芽生根最佳培养基为MS+0.1 mg/L IAA。     

天门冬组织培养条件的优化

以天门冬(Asparagus cochinchinensis)幼嫩茎段为外植体,考察1 g/L HgCl2灭菌时间对外植体的消毒效果,以及激素浓度组合对外植体愈伤组织、不定芽的诱导和不定芽生根的影响.结果表明,1 g/L HgCl2处理7 min,外植体褐化率和污染率较低;MS+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+0.2 mg/L KT培养基中的愈伤组织诱导率最高,且生长势最强,MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT培养基中的出芽率最高;1/2MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA培养基中生根率最高,可达76％.