木薯MeSSSIV基因启动子克隆及序列分析

木薯是热带典型的高淀粉、抗逆、抗旱作物.可溶性淀粉合成酶(SSS)是植物淀粉合成过程中的关键酶之一.根据已发表的拟南芥SSSⅣ基因序列,通过同源比对从木薯AM560、KU50基因组中获得木薯MeSSSⅣ基因的cDNA序列以及该基因部分启动子序列,设计特异引物,从木薯栽培种KU50基因组DNA中克隆了MeSSSⅣ基因系列1068 bp(该序列包含978 bp的启动子调控序列及90 bp的基因编码序列).序列分析表明,启动子调控序中除含有典型的真核生物核心启动子区域外,还含有多个TATA-box、CAAT-box等启动子元件以及多种与脱水、激素和光响应相关的顺式作用元件,特别是发现CGACGOSAMY3、DOFCOREZM、SREATMSD、SURE等与糖信号相关的重要顺式元件,这些元件预示MeSSSⅣ基因的表达可能与糖信号相关.以上结果说明,MeSSSⅣ可能参与木薯多种代谢过程,其表达可能受多种调控因子的调节.     

海马齿SpSCL1基因启动子克隆及序列分析

GRAS蛋白是植物特有的一类蛋白家族,在植物的生长发育方面具有重要作用.根据前期分离的海马齿SpSCL1基因的5'端序列,设计特异引物进行Genome Walking,从海马齿基因组DNA中克隆了SpSCL1基因上游的1 254 bp片段.序列分析表明,该序列包含681 bp的启动子调控序列及573 bp的基因编码序列,启动子调控序中除含有典型的真核生物核心启动子区域(-60～-10bp)外,还含有多个TATA-box、CAAT-box等启动子元件以及多种与脱水、耐盐和光响应相关的顺式作用元件.结果预示海马齿SpSCL1可能在抗旱、耐盐以及光敏色素信号转导途径中发挥重要作用.     

木薯MeCWINV4启动子的克隆及其活性分析

根据木薯细胞壁转化酶基因MeCWINV4已知编码区序列与木薯基因组数据库中预测的MeCWINV4基因序列信息设计引物,从木薯基因组DNA中对该基因的潜在启动子区进行PCR扩增,经测序比对成功获得1 639 bp序列,其中包含74 bp编码区序列和1 565 bp潜在启动子区序列。用Plant CARE和PLACE软件分析该序列的顺式作用元件,发现该启动子包含CAAT box和TATA box保守元件、大量光反应相关元件与应对高低温胁迫和激素响应相关元件。将MeCWINV4启动子片段取代pVKH表达载体中的CaMV 35S启动子与GUS连接,构建成融合表达载体pVKH-CW4-GUS,通过农杆菌真空渗透法在烟草叶片中进行瞬时表达。结果表明,该启动子驱动了GUS基因在烟草叶片中的表达。说明MeCWINV4启动子具有启动子活性,可以启动目的基因的转录,为进一步研究该基因的调控机制奠定了基础。     

巴西橡胶HbERF3启动子的克隆与分析

根据巴西橡胶HbERF3基因序列,利用GenomeWalking技术对其启动子进行克隆和分析,得到了长度为1 572 bp的HbERF3基因的5’端上游启动子区,且分析结果表明,该序列具有典型的真核生物核心启动子区和转录起始位点,除了含有多个TATA-box、CAAT-box等基本顺式元件外,该序列还包含多种与激素应答、逆境胁迫相关的元件.对HbERF3启动子区的克隆和序列分析,为进一步研究HbERF3的表达调控和功能奠定了基础.     

木薯细胞壁酸性转化酶MeCWINCV5基因启动子的克隆和序列分析

[目的]了解MeCWINCV5在植物生长发育、激素调节和逆境胁迫应答中的功能.[方法]采用PCR方法从木薯基因组中分离MeCWINCV5基因启动子序列,考察MeCWINCV5对植物生长发育、激素调节和逆境胁迫应答的影响.[结果]分析显示启动子的长度为1170bp,合有TATA box和CAAT box等多个典型的真核生物启动子基本元件元件,还存在大量逆境胁迫诱导相关的顺式调控元件,如HSE、MBS、SARE、GARE-motif和TATC-box等多个与植物逆境胁迫相关的元件.[结论]MeCWINCV5基因启动子与逆境胁迫有关,在木薯抵御逆境胁迫的生理过程中具有重要作用.     

巴西橡胶树小橡胶粒子蛋白基因5'调控序列的克隆及功能初步鉴定

法尼基焦磷酸合酶是异戊二烯生物合成途径中的一个关键酶,根据NCBI数据库中巴西橡胶树法尼基焦磷酸合酶基因HbFPS序列设计引物,克隆了HbFPS起始密码子上游1066bp的5'调控序列。序列分析表明,该序列A/T含量为77.39%,含有典型的真核生物核心启动子区域,在该序列中发现了一些与真核生物典型的顺式调控元件相似的TATA-box、增强子元件、CAAT-box和GATA-box以及一些与激素、胁迫诱导、转录因子相关的顺式作用元件。构建了含有该序列的植物表达载体并转化烟草,对获得的转基因烟草T0代植株GUS染色发现转基因植株呈现蓝色,表明HbFPS的5'调控序列可以驱动GUS基因的表达,具有启动子的活性。     

甘蔗乙烯受体Sc-ERS启动子的克隆与序列分析

【目的】克隆甘蔗乙烯受体Sc-ERS基因启动子序列,分析Sc-ERS基因启动子序列的作用元件。【方法】采用基于热不对称交错式PCR原理的染色体步移技术,从甘蔗ROC22基因组DNA中克隆Sc-ERS基因启动子序列,利用启动子预测软件PlantCARE和PLACE在线工具对Sc-ERS启动子序列的作用元件进行预测。【结果】克隆获得Sc-ERS启动子序列1410 bp, 该序列与玉米ERS25、ERS14核苷酸同源性分别为82%和80%。PlantCARE 在线分析结果表明,该序列具有启动子基本作用元件TATA-BOX和CAAT-BOX,还含有参与光响应元件、干旱诱导MYB 结合位点、茉莉酸甲酯响应元件、水杨酸响应元件、胚乳表达顺式调控元件、热胁迫响应元件等。【结论】从甘蔗基因组DNA中克隆获得乙烯受体Sc-ERS基因上游1410 bp的启动子序列,该序列含有多个特异性调控元件,推测Sc-ERS基因的表达可能受生理周期、激素、干旱、光照等因素调控。     

库尔勒香梨kfpSPL及其启动子克隆分析

【目的】 研究库尔勒香梨萼片脱落、宿存与kfpSPL基因之间存在的关系,并克隆该基因及其启动子。【方法】以库尔勒香梨花器官作为材料,库尔勒香梨kfpSPL基因的cDNA序列以及梨基因组信息为模板设计引物,通过PCR获得该基因及其启动子,进行上游调控序列顺式作用元件的预测分析(PLACE数据库和PlantCare数据库)。【结果】克隆获得kfpSPL基因的基因组DNA序列长度为3 320 bp和2 332 bp的上游启动子调控序列,kfpSPL基因的基因组DNA与Pyrus bretschneideri 数据库中的一段长度相同的序列具有99%的同源性,E值为0,并发现该基因有三段内含子,将克隆得到的启动子序列在梨全基因组序列数据库中进行相似性搜索,发现克隆得到的上游启动子序列的1~796 nt和1 042~2 332 nt分别与scaffold291.0中290 783~289 988 nt和289 990~288 701 nt的同源性为96%和97%,E值均为0。以生物信息学分析为依据,kfpSPL启动子序列中存在一些相关的调控元件,赤霉素响应元件GARE-motif、P-box,光响应中的顺式作用元件ACE、 Box II、CATT-motif、G-box、TCT-motif、Box 4,防御和应激反应中的顺式作用元件TC-rich repeats, 启动子和增强子区的共同顺式作用元件CAAT-box等,转录起始的核心启动子元件TATA-box等。【结论】kfpSPL基因启动子序列中存在与赤霉素、脱落酸、水杨酸等激素相关的顺式作用元件,不同生长调节剂处理脱萼果和宿萼果的花器官可以调控kfpSPL基因的表达水平。     

甘蔗乙烯受体Sc-ERS启动子的克隆与序列分析

【目的】克隆甘蔗乙烯受体Sc-ERS基因启动子序列,分析Sc-ERS基因启动子序列的作用元件。【方法】采用基于热不对称交错式PCR原理的染色体步移技术,从甘蔗ROC22基因组DNA中克隆Sc-ERS基因启动子序列,利用启动子预测软件PlantCARE和PLACE在线工具对Se-ERS启动子序列的作用元件进行预测。【结果】克隆获得sc．ERS启动子序列1410bp,该序列与玉米ERS25、ERS14核苷酸同源性分别为82％和80％。PlantCARE在线分析结果表明,该序列具有启动子基本作用元件TATA．BOX和CAAT—BOX,还含有参与光响应元件、干旱诱导MYB结合位点、茉莉酸甲酯响应元件、水杨酸响应元件、胚乳表达顺式调控元件、热胁迫响应元件等。【结论】从甘蔗基因组DNA中克隆获得乙烯受体Sc-ERS基因上游1410bp的启动子序列,该序列含有多个特异性调控元件,推测sc．ERS;~因的表达可能受生理周期、激素、干旱、光照等因素调控。     

甘蓝型油菜种子特异表达油体蛋白启动子P_(BnOA03)的克隆及功能分析

为了改良油菜种子的性状,常常需要研究种子特异表达目的基因的情况。在分析油菜油体蛋白表达模式的基础上,选择种子特异高表达的油体蛋白,根据甘蓝型油菜基因组序列设计引物,利用PCR技术从基因组中克隆到一段715bp的启动子序列。启动子顺式元件分析表明,这一克隆序列具有CAAT-box和TATA-box启动子基本元件,另外含有ABA响应元件等多种顺式元件。进一步利用GUS报告基因在拟南芥中对该启动子的功能进行鉴定,结果表明,在转基因株系的幼苗、根、茎、叶、花和种子发育前期及成熟种子中没有检测到GUS基因明显表达,在种子发育的中后期检测到GUS基因的表达逐渐增强。说明这个启动子的表达调控具有一定的种子特异性。     

花生AhFAD2A基因启动子的克隆与序列分析

利用染色体步移技术,从花生品种鲁花14中克隆到716 bp的AhFAD2A基因启动子片段。序列分析表明,该启动子中含有多种种子特异性表达的元件,如GCN4基序、AGCCCA序列元件、Skn-1基序等,可能与AhFAD2A基因在种子中有较高的表达水平有关。启动子中预测的调控元件的功能还需进一步实验验证。     

银杏MECT基因启动子克隆及序列分析

以前期获得的银杏(Ginkgo biloba L.)MECT基因的c DNA序列为模板,通过设计特异性引物及采用染色体步移的方法从银杏基因组中克隆到Gb MECT翻译起始位点上游982 bp的启动子序列,研究银杏MECT基因启动子的结构及功能特点。生物信息学分析结果表明,该启动子序列中含有多种类型的顺式作用元件,主要有典型的光响应调节元件、激素响应调控元件、抗病虫害响应元件TGTCA序列、抗损伤应答元件ERF3和热激响应元件HSE等。此外,在该启动子片段中还含有氧胁迫和铜离子响应元件、淀粉酶响应元件等其他类型的作用元件,充分体现了启动子对基因表达调控具有转录水平上的高效性和复杂性的特点。     

甘蔗SPSB基因5′侧翼序列的克隆及生物信息学分析

蔗糖磷酸合成酶(SPS)是蔗糖合成途径的关键限速酶,对蔗糖的合成和碳水化合物的分配具有重要的调控作用。采用染色体步移法技术克隆获得了甘蔗SPSB基因5′端侧翼序列,并对其序列进行生物信息学分析。分离获得了4 399 bp的5′侧翼序列,该序列除具有启动子核心序列TATA-box和增强子元件CAAT-box等典型的真核生物启动子基本元件外,还含有多种光应答元件、激素响应元件,以及与缺氧、干旱、低温诱导有关的顺式作用元件和一些组织调控表达有关的顺式调控元件,表明ScSPSB启动子可能具有逆境应答、激素应答及组织特异表达特性,值得开展进一步的功能研究。     

萝卜抽薹开花促进因子RsFPF1基因克隆与功能分析

采用电子克隆与基因组步移策略分离出萝卜RsFPF1基因gDNA和cDNA及启动子序列,并进行表达特征分析及转基因功能验证。序列分析表明,RsFPF1基因长度为330 bp,编码109个氨基酸;蛋白同源分析表明,RsFPF1蛋白与拟南芥及白芥FPF1蛋白间亲缘关系最近。RsFPF1基因5'上游启动子区序列长度为1 845 bp,采用PLACE和PlantCARE软件分析表明,该启动子序列含有典型调控元件及多个光响应顺式元件。半定量RT-PCR表达分析表明,开花前RsFPF1基因在茎尖表达量最高,开花后在花及花蕾中表达量最高。通过农杆菌介导的遗传转化获得转RsFPF1基因的烟草阳性植株,与野生型相比,转入RsFPF1基因的植株出现花期提前现象。结论:RsFPF1基因能够促进萝卜提早开花,其表达可能受光调控,在调控萝卜抽薹开花及花发生相关基因表达方面发挥着重要作用。     

葡萄LEAFY基因启动子的克隆与序列分析

为探明葡萄LEAFY基因的表达调控规律,应用PCR技术从藤稔葡萄中克隆了1个长1 833 bp的DNA片段,该序列含有2个内含子区域,编码402个氨基酸,与葡萄LEAFY同源基因VFL有99%的同源性.应用基因组步移法克隆了LEAFY基因的5′侧翼序列925 bp,拼接后的LEAFY基因及启动子序列共2 692 bp(GenBank登录号EF222286).用PLACE、PlantCARE在线启动子预测工具分析表明:该序列含有启动子的特定结构,如TATA-box,CAAT-box等,另外含有一些顺式作用元件如MYB结合位点、ABA响应元件、光响应元件和一些其他的调控序列,说明葡萄LEAFY基因的表达可能受MYB、ABA和光等的调控.用FootPrinter在线工具对葡萄与拟南芥等其他4种植物的LEAFY同源基因启动子进行比较,发现不同植物的启动子既有保守性,又有多样性,转录因子结合位点的分布相似,但也有区别,暗示了LEAFY基因表达调控的精确性或多样性.     

葡萄LEAFY基因启动子的克隆与序列分析

为探明葡萄LEAFY基因的表达调控规律,应用PCR技术从藤稔葡萄中克隆了1个长1 833 bp的DNA片段,该序列含有2个内含子区域,编码402个氨基酸,与葡萄LEAFY同源基因VFL有99%的同源性.应用基因组步移法克隆了LEAFY基因的5′侧翼序列925 bp,拼接后的LEAFY基因及启动子序列共2 692 bp(GenBank登录号EF222286).用PLACE、PlantCARE在线启动子预测工具分析表明:该序列含有启动子的特定结构,如TATA-box,CAAT-box等,另外含有一些顺式作用元件如MYB结合位点、ABA响应元件、光响应元件和一些其他的调控序列,说明葡萄LEAFY基因的表达可能受MYB、ABA和光等的调控.用FootPrinter在线工具对葡萄与拟南芥等其他4种植物的LEAFY同源基因启动子进行比较,发现不同植物的启动子既有保守性,又有多样性,转录因子结合位点的分布相似,但也有区别,暗示了LEAFY基因表达调控的精确性或多样性.     

中华蜜蜂气味受体AcerOr1基因启动子克隆及序列分析

为获取中华蜜蜂气味受体AcerOr1基因启动子并分析调控元件,以前期获得的中华蜜蜂AcerOr1基因的cDNA序列为模板,设计特异性引物并采用染色体步移的方法,从中华蜜蜂基因组中克隆到AcerOr1基因部分序列及其5'侧翼区,并分析其调控元件组成。生物信息学分析结果表明,克隆产物长1 831 bp,3′侧翼序列与Gen Bank中AcerOr1基因序列的5'端序列同源性为92%;在1 100～1 139 bp处存在基础启动子,其序列为:5′-ATTATATAAATATTGCTCGTGGCAAAATGATTCATAAGT-3′,转录起始位点可能位于翻译起始密码子ATG上游621 bp处的碱基T,其可能性为0.98。除含有基本启动子元件(TATA-Box、CAAT-Box等)外,还存在与胚胎发育或组织发育相关的元件CF2-Ⅱ、NIT2、CdxA和与环境应激相关的元件HSF,表明AcerOr1基因在中华蜜蜂体内的转录和表达可能受到胚胎、组织及外界环境的调控。     

木薯DBE和SBE基因的序列分析及其茉莉酸甲酯诱导表达特性

为研究木薯中调控支链淀粉合成的DBE和SBE基因如何被茉莉酸信号调控,首先对木薯基因组数据库中的Me DBE和Me SBE2.1基因进行序列分析,二者都具有α淀粉酶催化结构域且启动子区都具有茉莉酸响应元件等多种响应元件。以木薯品种‘华南八号’悬浮培养细胞为材料,利用q RT-PCR检测木薯Me DBE和Me SBE2.1基因在茉莉酸甲酯处理后的表达特性。结果显示:Me DBE基因的表达在最初短暂上调后持续下调,而Me SBE2.1则持续上调后又恢复最初水平,说明Me DBE和Me SBE2.1基因可被茉莉酸信号调控,进一步推测表明,其受到不同激素信号整合后的综合调控,以影响支链淀粉的生物合成。     

水稻病程相关蛋白基因OsPR-4b启动子的克隆及缺失体构建

用一对根据已克隆的水稻OsPR-4b基因序列和水稻基因组序列数据库相应序列设计的引物扩增到OsPR-4b基因上游2257 bp的启动子序列.用PLACE软件分析顺式作用元件,发现OsPR-4b基因起始密码子上游1.5kb的区域内存在几个可能与PR蛋白基因表达调控相关顺式作用元件,如W盒、PAL-boxA、GT-1结合序列、Dof结合序列和MybSt1元件等.将OsPR-4b基因启动子区域及其5'部分缺失构件与gus报道基因相连,并克隆进pCAMBIA1391z载体中,用于分析启动子活性以及顺式作用元件在调控OsPR-4b基因表达中的功能.