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1.
大豆锌指转录因子GmDi19-5对高温的响应及互作蛋白的筛选   总被引:1,自引:1,他引:0  
【目的】高温胁迫已经成为威胁作物生长发育的主要非生物胁迫因素之一,转录因子在植物非生物胁迫响应中起着重要作用。通过对大豆锌指转录因子基因Gm Di19-5在高温胁迫下的响应和功能鉴定,以及利用酵母双杂交技术从大豆c DNA文库筛选与其互作的候选蛋白,研究Gm Di19-5对高温胁迫的响应机制。【方法】以大豆c DNA为模板,利用实时荧光定量PCR检测Gm Di19-5在高温处理不同时间段的表达模式;通过Plant CARE和PLACE数据库预测Gm Di19-5启动子元件,并对Gm Di19-5启动子转基因拟南芥在高温处理下进行的组织化学染色,分析Gm Di19-5启动子在高温胁迫下的活性;构建p GBKT7-Gm Di19-5诱饵载体,验证自激活活性;利用酵母双杂交技术,以p GBKT7-Gm Di19-5为诱饵筛选大豆c DNA文库,筛选与其互作的候选蛋白;进一步用酵母双杂交系统验证Gm Di19-5与候选蛋白的互作;利用实时荧光定量PCR检测候选蛋白基因在对高温处理的响应情况;构建融合表达载体,用GFP-Gm Di19-5融合表达载体转化拟南芥原生质体,检测Gm Di19-5蛋白的亚细胞定位情况。【结果】实时荧光定量PCR结果显示,Gm Di19-5在高温胁迫下上调表达;启动子元件分析表明,Gm Di19-5包含多种与胁迫应答相关的顺式作用元件,包括热响应元件HSE;组织化学染色分析发现,经高温处理后,过表达拟南芥幼苗的地上部分和地下部分均有报告基因的表达;亚细胞定位结果表明,Gm Di19-5蛋白定位于拟南芥原生质体的细胞核中;通过酵母双杂交技术筛选到了与Gm Di19-5互作的候选蛋白,试验进一步验证了Gm Di19-5与Gm Dna J在酵母细胞中互作;另外,实时荧光定量PCR结果显示,互作蛋白基因Gm Dna J受高温胁迫诱导表达。【结论】Gm Di19-5受高温诱导表达,Gm Di19-5可能与Gm Dna J互作,表明Gm Di19-5功能的发挥可能需要Gm Dna J的参与。  相似文献   

2.
[目的] 低温和高光均能引起四季秋海棠(Begonia semperflorens)叶片因合成积累花色素苷而变红.本研究从低温和高光处理四季秋海棠的转录组中筛选并克隆得到1个MYB转录因子基因并命名为BsMYB62 ,对其进行生物学信息分析,并从四季秋海棠cDNA文库中筛选出与其互作的蛋白.[方法] 设计BsMYB62...  相似文献   

3.
【目的】确定拟南芥抗逆转录因子AtMYB73的转录活性区域并筛选获得与其互作的蛋白,为进一步阐明AtMYB73调控拟南芥抗逆的分子机制奠定基础。【方法】构建转录因子AtMYB73的酵母诱饵表达载体pAS1-AtMYB73,检测pAS1-AtMYB73的自激活性及其对酵母Y190的细胞毒性。克隆AtMYB73的N端区域(含有R2R3结构域)和C端区域(不含R2R3结构域),检测AtMYB73的N端和C端的转录激活活性,分析AtMYB73自激活结构域的位置。利用酵母双杂交技术,以AtMYB73为诱饵筛选拟南芥的cDNA文库,将阳性克隆进行鉴定、测序;利用TAIR数据库对筛选获得的AtMYB73的候选互作蛋白进行分析。构建AtMYB73和F12F1.4的酵母双杂交载体pGBDT7-AtMYB73和pGADT7-F12F1.4,通过酵母双杂交技术,对其互作关系进行分析。【结果】含pAS1-MYB73的酵母菌在不同浓度的3-AT的SD/-His/-Trp/、SD/-Ade/-Trp培养基上均能生长,表明AtMYB73具有较高的自激活活性。含pAS1-AtMYB73的酵母菌在SD/-Trp/Amp液体培养基中培养24 h的OD600值大于0.8,表明诱饵载体对酵母Y190没有细胞毒性。成功构建了pAS1-AtMYB73-N和pAS1-AtMYB73-C载体,获得了含有pAS1-AtMYB73-N和pAS1-AtMYB73-C的酵母;含pAS1-AtMYB73-N的酵母在含X-a-gal的YPAD培养基上呈现无色,而含pAS1-AtMYB73-C的酵母则呈现蓝色,表明AtMYB73的C端有明显的自激活性,而N端没有自激活性。以AtMYB73为诱饵,筛选拟南芥的cDNA文库,获得了与光合作用、防御反应途径、抗逆等相关的8个蛋白。利用酵母双杂交技术,确定了MYB73与F12F1.4之间存在一定的互作。【结论】拟南芥抗逆转录因子AtMYB73具有较高的转录激活活性,其活性区域位于C端;以AtMYB73为诱饵,筛选获得了与光合作用、防御反应途径、抗逆等相关的8个AtMYB73的候选互作蛋白;利用酵母双杂交技术,确定了AtMYB73与F12F1.4之间的互作关系。  相似文献   

4.
为深入研究白桦开花抑制因子FLC与SVP的相互作用的分子机理,利用PCR技术从白桦幼叶cD-NA中克隆出BpFLC和BpSVP基因序列,利用NdeⅠ和Eoc RⅠ限制性内切酶将BpFLC和BpSV P分别整合进酵母表达载体pGBKT7和pGADT7中。 pGBKT7-BpFLC及pGBKT7-BpSVP转化酵母Y2Hgold菌株显示无自激活与毒性作用。酵母Y2Hgold [ pGBKT7-BpFLC ×pGADT7-B pSVP]、Y2Hgold [ pGADT7-BpFLC ×pGBKT7-BpSVP]均可在QDO/A/X平板上生长,并显示蓝色,说明能激活报告基因HIS3、ADE2、AUR1-C 、MEL1,由此表明BpFLC与BpS-VP蛋白能够结合,存在互作关系。  相似文献   

5.
为探讨小麦甲基结合域蛋白(TaMBD2)在植物生长发育过程中的调控功能,以TaMBD2基因的全长cDNA为模板,构建诱饵载体pGBKT7-TaMBD2,利用酵母双杂交系统从小麦cDNA文库中筛选TaMBD2互作蛋白。结果共筛选到91个菌斑显蓝色的克隆,对其进行菌液PCR检测并测序,然后在NCBI上进行BLAST比对分析,共获得8个可能与TaMBD2互作的蛋白,分别为二磷酸核苷激酶(NDPK)、ENTH结构域蛋白、SIAN蛋白、Agenet结构域蛋白、C2H2型锌指蛋白、磷酸激酶和2个假定蛋白,其中最有可能的TaMBD2互作蛋白为NDPK。这些候选蛋白主要参与细胞信号传导、抗逆、能量代谢和蛋白质运输等。其中,检测结果中参与植物抗逆胁迫的蛋白质为主要互作蛋白,所占比例为54.9%;参与蛋白质运输的互作蛋白所占比例为25.3%,其余互作蛋白所占比例较小。因此,推测TaMBD2可能主要参与植物对干旱、低温和高盐等非生物胁迫逆境的响应及调控。  相似文献   

6.
[目的]本文旨在鉴定香蕉果实后熟关键调控因子MaMADS2的互作蛋白,深入解析MaMADS2影响香蕉果实后熟过程的分子机制。[方法]以MaMADS2为诱饵利用酵母双杂交文库获得候选互作蛋白,通过克隆候选互作基因编码区进行点对点酵母双杂交试验来验证互作情况;利用转录组学分析互作蛋白相关基因在后熟过程中的表达情况;利用双分子荧光互补试验鉴定重要互作蛋白与MaMADS2的互作;最后用蛋白免疫印迹分析MaMADS2蛋白在香蕉后熟过程中的表达。[结果]成功构建了果实在乙烯利催熟下的cDNA文库,初级和次级文库的库容分别为2.9×106和3.2×106 CFU·mL-1,平均插入片段大小在1 200 bp以上,可满足后续酵母双杂交筛选的要求。最终共鉴定出7个互作蛋白,其中有2个MADS-box转录因子,3个E3泛素连接酶,2个具有转录抑制作用的蛋白。转录组数据表明,乙烯利可抑制2个MADS-box基因的表达,而1-甲基环丙烯(1-MCP)对其表达起诱导作用。双分子荧光互补试验表明,MaMADS2与MADS-box转录因子Ma04_p...  相似文献   

7.
通过 PCR 扩增得到红掌(Ant hur i um andr aeanum)的 M YB 基因全长、将 M YB 基因片段克隆到 pM D18-T 载体上、然后将此基因插入 CaM V35S启动子后构建成表达载体 Cam35S-GFP-M YB。 通过冻融法将带有目的基因的 表达载体导入根癌农杆菌、 并转化热研 2 号柱花草获得转基因植株若干。 抽取 10 株转化的柱花草植株的基因组 DNA 进行 PCR 分子验证、结果表明有 6株阳性、M YB 基因已成功整合到柱花草的基因组中。转基因柱花草植株的获 得为柱花草等豆科牧草的适口性和抗逆性的提高提供了可能、 并且为以后柱花草的遗传转化工作提供了可靠的依 据。  相似文献   

8.
Pik2-H4 是从水稻高抗稻瘟病株系H4 中克隆的广谱型抗稻瘟病基因。Pik2-H4 基因的CDS 全长序列 3066 bp,与日本晴中的等位基因相比,其序列存在较大差异。Pik2-H4 属于NBS-LRR 类基因,其蛋白序列含有NBARC 结构域及富亮氨酸重复序列。采用酵母双杂交系统,以Pik2-H4 蛋白为诱饵从水稻cDNA 表达文库中钓取互作 蛋白质,并成功筛选到3 个与Pik2-H4 有相互作用的蛋白质(LOC-Os08g39300、LOC-Os03g25960、LOC-Os09g29130)。 本研究结果有助于进一步了解由Pik2-H4 介导的水稻抗稻瘟病反应机理。  相似文献   

9.
筛选与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)M蛋白相互作用的宿主蛋白,构建M蛋白的诱饵载体pGBKT7-M.首先利用PCR技术从重组表达载体pFastBacTM-M中扩增得到M基因,定向克隆至载体pMD19-T simple,验证正确后克隆至酵母双杂交系统诱饵表达载体pGBKT7,经双酶切、PCR反应及测序验证其正确插入后,利用PEG/LiAc法将构建好的重组诱饵载体pGBKT7-M及空载体pGBKT7分别转化到酵母Y2HGold感受态细胞中,检测其对酵母菌株是否有毒性作用和自激活活性及诱饵蛋白在酵母细胞内的表达情况.结果表明:扩增得到M基因738bp,成功构建了诱饵表达载体pGBKT7-M,此诱饵载体对酵母细胞无细胞毒性和自激活活性.Western blot检测到5×104左右的蛋白条带,显示诱饵蛋白在酵母细胞内稳定表达.  相似文献   

10.
【目的】利用构建的干旱胁迫处理的小麦cDNA文库,通过酵母双杂系统筛选与小麦TaMAPK2互作的蛋白,并对其进行验证分析。【方法】以小麦cDNA为模板克隆得到TaMAPK2,构建pGBKT7-TaMAPK2诱饵载体,将诱饵载体pGBKT7-TaMAPK2质粒以及pGADT7和小麦cDNA文库共转化酵母AH109菌株感受态细胞,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade营养缺陷型培养基上30℃培养3-5 d,挑选单克隆于YPDA培养基中培养,吸取1 μL各候选克隆的菌液点至于SD/Raf/Gal/x-gal平板上培养,筛选蓝色单克隆。将筛出的单克隆经测序、序列比对分析,初步获得与TaMAPK2互作的候选蛋白。采用双酶切的方法构建pGADT7-HSP90以及pSPYNE-TaMAPK2和pSPYCE-HSP90双分子荧光互补表达载体,将重组载体质粒pGADT7-HSP90和pGBKT7-TaMAPK2共转化AH109酵母感受态细胞,利用酵母双杂交的方法验证TaMAPK2与候选蛋白HSP90的相互作用;采用PEG-Ca2+介导法将双分子荧光互补表达载体pSPYNE-TaMAPK2和pSPYCE-HSP90共转化小麦原生质体细胞,激光共聚焦显微镜下观察相互作用产生的YFP荧光信号。根据HSP90的保守序列设计特异引物,在SYBR Green Ⅰ的检测模式基础上,构建HSP90的实时荧光定量PCR检测体系,检测HSP90在不同胁迫处理以及不同组织的小麦植株中的表达量。【结果】通过对候选蛋白的初步分析表明这些候选蛋白主要参与植物体的信号转导或免疫过程,表明TaMAPK2在植物的逆境信号转导、基因转录调控过程中发挥着重要作用。通过酵母双杂交显蓝系统和双分子荧光互补技术(BiFc)进一步确认HSP90与TaMAPK2的互作关系。HSP90定位在细胞核、细胞膜以及细胞质中,且在植物的根茎叶中均有表达,在根中的表达量最高。通过实时荧光定量PCR分析显示,HSP90基因受到高温、低温、高盐和ABA胁迫后表达量上调。【结论】HSP90作为分子伴侣,在降解这些受损或异常蛋白以及调控抗逆相关转录因子表达的过程中发挥着重要的作用。非生物胁迫会引起植物体内一些受损或异常蛋白聚合物的积累,HSP90能通过折叠已损坏的蛋白底物以及构象的维持来保持细胞的完整性。表明在植物逆境信号转导过程中,TaMAPK2功能的发挥可能需要HSP90蛋白的参与。  相似文献   

11.
根据 GenBank中的猪圆环病毒 2 型 ORF2 基因序列、设计合成 2对引物、通过对环介导等温(LAM P)扩 增条件的优化、敏感性、特异性试验、成功建立了猪圆环病毒 2 型 LAM P 诊断方法。 敏感性结果显示、建立的 LAM P 诊断方法最低核酸检测量为 0. 30 pg/ L、而 PCR 诊断方法最低核酸检测量为 30 pg/ L;特异性结果显示、猪圆环病毒 1 型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒的扩增结果均为阴性。 对 95份自然感染病猪样 品的检测结果表明、该 LAM P 方法检测结果与 PCR 检测结果符合率为 95. 8% 。 整个扩增反应可在 30 mi n内完成、结 果肉眼可见、为猪圆环病毒 2型的现场快速诊断提供了一种简便可行的方法、能够满足基层现场快速检疫的需要。  相似文献   

12.
以罗汉果生根组培苗为试验材料,研究基质种类、瓶苗质量、温湿度及施肥浓度对组培苗移栽成活率和 生长的影响。 结果表明院基质种类、瓶苗质量、温湿度是影响组培苗成活的关键因子,塘泥颐育苗土颐蛭石=1颐1颐1 的基质 组合效果最好,炼苗成活率最高达 93. 56% ,且长势好;合适的环境条件为温度 25耀30益、湿度 80% 耀90% ;施肥浓度以 0. 5% 为好,移栽苗生长较快且无肥害发生,最适于移栽大田。  相似文献   

13.
发酵床养殖技术的核心在于发酵垫料的配比和管理。 为筛选获得生物发酵床最优垫料,替代传统原料 稻壳和锯末,进行了以土著微生物为菌种,稻壳、锯末、玉米秸秆、玉米芯不同添加比例为垫料的发酵床模拟试验。 按 照总重量相同原则,试验设 8个处理。 试验期 60 d,每 5 d对垫料发酵过程中温度、全氮、有机质进行测定并分析。 结 果表明院所有处理发酵最高温度均超过 35益,全氮、有机质含量均为降低趋势。 其中添加 30% 玉米秸秆+30% 玉米芯+ 40% 对照的 AB 处理发酵效果较好, 高温期和降温期的温度值均超过其他处理, 其全氮、 有机质含量分别下降了 44. 27% 尧19. 87% 遥 结合成本投入综合计算筛选出最优垫料为 AB 处理袁建议在西北地区发酵床养殖中推广利用遥  相似文献   

14.
采用 SRAP 分子标记方法、对 9 份粤选系列匍匐翦股颖新品系和 4 份国外优良品种进行指纹图谱构建 和遗传多样性分析。 结果表明院(1)32对引物中、有 17对引物扩增带型清晰、共扩增出 184 条带、其中有 131 条具有 多态性、多态率为 71% 。 (2)有 4对引物扩增的带型可以清晰区分 13个品系、利用图示模型构建了 13个品系指纹图 谱、图谱包含 12个位点、能有效区分 13个品系。 (3)13个品系间存在较大的遗传差异、遗传距离在 0. 0285耀0. 7587之 间。 (4)经 UPGM A 聚类分析、在遗传距离 0. 644处、可将 13个供试材料分为 4个同源类群。 研究结果为匍匐翦股颖 新品种的鉴定和推广提供了依据。 关键词院匍匐翦股颖; SRAP; 遗传多样性; 指纹图谱 广东省自然科学基金(S2012040007287);广东省 科技攻关项目(2005B20901018);广州市科技攻关项目(2005Z2- E0201、2006C13G0161);广东省农业标准项目(粤财农[ 2005] 311 号);珠海市科技攻关项目(PC20061051) 149聂 鑫 1 、 陈国平 2 、 张 利 1 、 李再新 1 、 谢万如 1 、 赵志平 1 ( 1. 四川理工学院化学与制药工程学院、四川 自贡 643000;2. 重庆大学生物工程学院、重庆 400044) 摘 要院花青素是类黄酮化合物的衍生物、具有抗氧化功能。 油菜是全世界广泛种植的油料作物、但其花青素含 量低、抗氧化能力弱。 为了利用金鱼草花青素生物合成转录因子遗传转化油菜提高其花青素含量、通过 PCR 从金鱼 草 cDNA 中扩增了 Roseal 1和 Del i l a基因、并分别克隆到含有 35S 启动子和 35S 终止子的 pDH51 载体。 然后将含有 35S启动子、基因片段和 35S终止子的片段分别连接到 pBI N19载体、获得了含有双 35S 启动子和终止子的表达载体 pBI N-Del i l a-Roseal 1。通过农杆菌介导遗传转化甘蓝型油菜后、获得了紫色的愈伤组织。研究结果为利用基因工程技 术提高油菜花青素的含量奠定了基础。  相似文献   

15.
3 种生防细菌短短芽孢杆菌(Br evi baci l l us br evi s)HAB-5、枯草芽孢杆菌(Baci l l ussubt i l i s)A178、萎缩芽 孢杆菌(Baci l l usat r ophaeus )HAB-1、对多种植物病原菌具有较好的拮抗作用。通过优化条件培养、将 3种生防细菌制 备成胶悬剂(SC)和微胶囊(CS)两种剂型、以芒果炭疽病菌(Col l et ot r i chum gl oeospor i oi desPenz. )C7-2 菌株为靶标病 菌、测试两种剂型对 3种菌拮抗能力的影响。 结果表明、在制备的 3 种生防菌的胶悬剂中、只有 A178 胶悬剂在稀释 10倍和 800倍时抑菌效果好于原始菌株、 其他的均弱于原始菌株、HAB-1 胶悬剂甚至失去了抑菌能力曰3种生防菌 微胶囊剂型中、A178 的 100~800 倍稀释浓度下抑菌效果好于原始菌株、 抑菌能力分别提高 0. 49% 、0. 29% 、3. 04% 曰 HAB-5的微胶囊剂型 10、100、400、800、1 000倍的稀释度下、 抑菌效果都高于原始菌株、 分别提高 5. 00% 、3. 30% 、 5. 11% 、2. 22% 、1. 74% 、4. 25% 、但 HAB-1 微胶囊剂型抑菌效果较其原始菌株减弱、说明微胶囊剂型能够增强 HAB-5 和 A178菌株对病原菌的抑菌作用。  相似文献   

16.
为了探讨牛 TRAF6基因的结构与功能、采用基因克隆技术分离了牛 TRAF6基因的编码区序列、并采用 生物信息学方法分析了该基因及其所编码的蛋白质的序列特征、结构和功能。结果表明院分离了 TRAF6 基因 1 803 bp 的 cDNA 序列(GenBank 登录号为 DQ471669)、编码区长度为 1 629 bp、编码 542 个氨基酸(GenBank 登录号 为 ABF06558)、位于细胞核、细胞质、线粒体、内质网等多种细胞器上、分子量为 61. 57176 ku、等电点为 6. 09、含有 RI NG-f i nger 、zf -TRAF 和 M ATH_TRAF6结构域。 该蛋白与人、小鼠和大鼠 TRAF6蛋白的同源性分别为 89% 、84% 和 82% 、 其结构域的同源性均达到 95% 以上。 根据各物种间 TRAF6 蛋白的高同源性、 结合人和小鼠 TRAF6 蛋白在 TNF/ TLRs/ TI R 超家族介导的信号转导途径中的重要作用、推测牛 TRAF6 蛋白也可能参与调节多种信号通路、在免 疫反应、炎症反应、细胞分化和凋亡等生物学过程中发挥重要功能。  相似文献   

17.
通过对白莱航鸡受精蛋和无精蛋进行试验、分析孵化 0~4 d 受精蛋和无精蛋品质变化规律、比较两种蛋 的品质差异。 结果表明、受精蛋与无精蛋平均日失重率不同、受精蛋为 0. 71% 、无精蛋为 1. 00% 。 受精蛋蛋白 pH 在孵 化早期有一个先上升后下降的过程、在孵化第 2 d达到最高值(9. 44)、而无精蛋蛋白 pH 则一直缓慢上升。 孵化开始 后、受精蛋蛋白高度先下降后上升、孵化第 2 d 达到最低值(7. 0 mm)、无精蛋蛋白高度则一直下降。 受精蛋与无精蛋 哈夫单位在孵化第 0~3 d没有显著性差异、第 4 d 差异显著。 受精蛋与无精蛋蛋黄颜色均随着孵化的进行发生波动 变化。 受精蛋在孵化 0~4 d 中、蛋壳逐渐变薄、气孔数增加、而无精蛋蛋壳厚度与气孔数均变化不显著。  相似文献   

18.
筛选获得高效生防枯草芽胞杆菌(Baci l l ussubt i l i s)BLG01 和 BDF11,并通过小区试验测定施用 BLG01 和 BDF11 与有机液肥对香蕉生长、枯萎病病情指数、枯萎病病原菌(Fusar i um oxyspor um f .sp.cubense,FOC)与可培 养细菌数量的影响。 室内试验结果表明,BLG01和 BDF11对香蕉枯萎病病原菌的抑制率分别达 70. 4% 和 77. 2% 。 小 区试验结果表明,在香蕉移栽 100 d 时,各试验处理均能能促进香蕉生长和提高控病作用,其中以 BLG01 和 BDF11 与有机液肥同时施用也LOF( BL1+BDF11) 页的防病作用最显著,香蕉株高、茎围、地上部、地下部鲜和防效显著提高,联 合处理病情指数下降了 45. 39% ~65. 87% , 根际 FOC 的 l ogCFU 降低 40. 5% ~50. 1% , 可培养细菌数量的 l ogCFU 增加 25. 8% ~32. 8% ;FOC 与根际可培养细菌数量呈极显著负相关关系,与病情指数呈极显著正相关关系。 结果表明,枯草 芽胞杆菌配施有机液肥可促进香蕉生长,降低枯萎病病原菌数量,提高根际可培养细菌数量,增加对香蕉枯萎病的 防治效果,具有较大的应用前景。  相似文献   

19.
为有效利用喀斯特山区资源、促进贵州生态畜牧业的可持续发展、以该区域紫穗槐(Amor pha f r ut i cosa) 为研究对象、进行单独青贮及乳酸菌、纤维素酶、乳酸菌+纤维素酶、甲酸、蔗糖 5 种添加剂青贮、探讨其可青贮性及 青贮的有效措施。 结果表明院紫穗槐青贮饲料的粗蛋白质含量高、酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维和单宁的含量低、营 养价值高;紫穗槐单独青贮品质一般、添加剂青贮改善了青贮饲料的气味和色泽、降低了 pH 值和氨态氮含量、改善 了青贮品质与营养;综合评定、青贮效果为乳酸菌>甲酸>乳酸菌+纤维素酶>纤维素酶>蔗糖>单独青贮、紫穗槐青贮 是可行的、可为该区域饲用灌木资源的利用提供有效途径。  相似文献   

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