甘蔗EST-SSR标记的开发和多样性分析

运用生物信息学分析方法对甘蔗(Saccharum spp.)的282 809条表达序列标签(ESTs)进行分析,共获得Unigene 138 590条,发掘出分布于10 086条Unigene的10 505个微卫星(EST-SSR)位点,SSR发生频率为7.26%,平均9.22 kb出现1个SSR。在7个杂交甘蔗品种中,三核苷酸基元的SSR数量最多(74.95个/Mb),其次为二核苷酸基元的SSR(22.95个/Mb),二者占总数的90.27%。以CCG/CGG、AG/CT为重复基元的SSR是最常见的EST-SSR类型,富含G/C的EST-SSR占据极明显的优势。与拟南芥和水稻cDNA序列内SSR的比较表明,富含G/C的SSR可能是禾本科植物SSR的一个共同特点。研究发现,SSR在EST与基因组序列之间以及在不同甘蔗品种之间的分布存在差别,具有丰富的多样性。此外,从EST数据分析获得杂交甘蔗品种的16个保守基因,从中发掘了9个SSR位点。最后,利用Primer3和e-PCR软件设计了一批具有物种特异性和通用性的EST-SSR PCR引物,相关数据可以通过http://59.50.66.49/SSR/sugarcane/sugarcane.EST-SSR.tgz链接从因特网下载。该研究结果可为开展甘蔗遗传多样性分析、种质资源鉴定和分子辅助育种提供参考。     

木荷基因组 SSR 位点开发及初步分析

为开发木荷分子标记,采用高通量测序技术获得木荷基因组原始数据,经生物信息学软件对木荷基因组序列进行序列拼接、组装和对比,共获得 308 418 条 Contig 序列和 459 984 条 Scafford 序列。采用 MISA 软件搜索木荷基因组序列中微卫星（Microsatellite）位点,共得到 334 843 个 SSR 序列,总长度 5 074 708 bp,占木荷基因组大小的 0.98%,木荷基因组 SSR 序列平均长度为 15.2 bp,平均分布频率为 644 个/Mb。木荷 SSR 序列中,单核苷酸序列数量最多,共 188 217 个,占木荷 SSR 序列总数的 56.21%,其次是二核苷酸（23%）>三核苷酸（13%） >四核苷酸（5%）>五核苷酸（2%）>六核苷（1%）。木荷全基因组 SSR 序列中共包括 400 种重复基元,其中单核苷酸重复基元 A 和二核苷酸重复基元 AT 是主要重复基元,分别占总 SSR 的 56%和 11%,SSR 基元的重复次数分布在 4~40 次,主要分布在 4~25 次。本研究丰富了木荷分子标记类型,为进一步群体遗传结构和遗传多样性分析提供了基础数据。     

芝麻EST-SSR引物的开发与应用

为丰富芝麻EST-SSR引物,本研究从实验室构建的高油芝麻品系中芝14号的不同种子发育期cDNA文库中获得45 569条表达序列标签（expressed sequence tags,EST）,通过前处理得到总长17.428Mb的无冗余EST共32 421条。利用MISA和SSR finder软件包工具对EST序列进行SSR位点查找,在这些序列中发现有1 688条Unigene,共有1 949个SSR。共226个序列含2个或2个以上SSR位点。这些SSR中出现频率最高的重复基序类型为三核苷酸(74%)。为开发芝麻EST-SSR引物,探讨EST-SSR用于芝麻品种遗传差异研究的可行性,用12份不同含油量品系材料评价其中34对与油脂代谢相关的基因SSR引物,全部成功扩增,共有3对引物获得多态性条带。结果表明,芝麻EST-SSR 标记开发效率较高,是芝麻SSR标记开发的重要措施,对于芝麻品种的鉴定与遗传多样性分析具有很高的应用价值。       

胡椒EST-SSR标记的开发和应用

通过分析NCBI数据库中胡椒转录组数据,共得到unigene 23 524条,其中618条unigene中检测到643个EST-SSR位点,SSR发生频率为2.63%,平均分布距离为12.86 kb。在643个EST-SSR中,二、三核苷酸重复是主要重复类型,分别占27.84%和69.36%,其中(AG/CT)n、(AAG/CTT)n出现频率最高,(NNN/NNN)5类型占EST-SSR位点的42.90%。利用PRIMER3.0设计358对引物,随机合成45对引物,并选用其中11对扩增较好的多态性引物,对43份胡椒种质的遗传多样性进行初步检测,构建聚类分析树状图。结果说明,胡椒EST-SSR标记的开发是可行的,并能够有效的用于胡椒遗传分析研究,具有较高的应用价值。     

稻瘟病菌基因组中微卫星序列的频率和分布

 利用已经公布的稻瘟病菌基因组测序结果，对该植物病原真菌基因组中的微卫星（SSR）的类型、大小及分布进行了系统分析。在已经公布的37.89 Mb的基因组序列中，共有16 398个由1~6个核苷酸为基序的SSR序列（匹配值为80％），其总长度占整个基因组碱基数的0.87％，平均2.31 kb碱基中就分布有1个大于15 bp的SSR。其中数量最多的是单碱基重复，达到4 392个，其次为三碱基重复序列 （3 586个），五碱基重复序列（3 442个），这3种SSR总数达11 420个，占SSR的 69.7%。数量最少的是二碱基重复序列，只有680个。在整个基因组中的主要基序有A，AG，AC，ACG，AGC，AAG，GGC，ACCT，ATCC，AAAG，AAAAG，AAAAT，AAAAC，AAAAAG， AAAAAT和AACTAG。有的基序类型则完全没有出现。对不同超级连锁群的分析结果表明，各连锁群之间的SSR分布有一定差异，但总体上仍是较为均衡的。这些结果为稻瘟病菌的基因标记、群体结构研究、非编码区DNA序列的结构及功能研究提供了一个较好的基础。     

一年蓬叶绿体基因组特征及系统进化分析

一年蓬（Erigeron annuus）作为一种入侵植物，对我国农林业发展、本地物种多样性及生态系统具有严重的影响。本研究利用Illumina NovaSeq 6000测定一年蓬的DNA序列，采用SPAdes v3.10.1软件组装一年蓬叶绿体基因组，以小蓬草（Erigeron canadensis, MT806101.1）叶绿体基因组为参考，对一年蓬叶绿体基因组结构、特征、SSR位点、IR边界以及进化树进行分析，结果表明：一年蓬叶绿体基因组全长为153 283 bp,AT、GC含量分别为62.95%、37.05%。包括大单拷贝区（LSC）84 833 bp，小单拷贝区（SSC）18 412 bp，反向重复区（IRa和IRb）25 019 bp，一年蓬叶绿体基因组共编码到132个基因，包括蛋白编码基因88个，转运RNA基因36个，核糖体RNA基因8个。按照功能分类将它们分成四大类：光合作用相关基因共45个、自我复制相关基因共73个、其他基因共6个、未知功能基因共8个。在一年蓬叶绿体基因组中共查找200个符合条件的SSR位点，分布在LSC、SSC、IR区域的SSR数量分别为126、40、...     

基于转录组测序的油梨 EST-SSR 引物开发

利用转录测序技术,开发油梨表达序列标签-简单重复序列（EST-SSRs）,为 SSR 标记在油梨种质资源鉴定、品种选育及遗传连锁图谱构建奠定基础。采用 Illumina 二代测序的技术,共获得 37 639 条无冗余的序列,对其进行 SSR搜索,共获得 6 419 条简单序列重复（SSR）。利用 Primer 3.0 软件设计 SSR 引物,并以 11 份油梨种质筛选多态性引物。基于转录组序列开发出的 EST-SSR 的分布频率为 17.05%。在油梨 EST-SSR 中,单核苷、二核苷和三核苷的重复占主导,占总数的 99.07%。单、二、三核苷酸重复单元分别占总 SSR 的 37.47%、31.80%和 29.80%;出现频率最高的二核苷酸重复基元是 AG/CT,占总数的 29.15%,出现最高的三核苷酸重复基元为 AAG/CTT,占 12.01%。随机选择 315 个SSR 位点合成引物,经 11 份油梨种质筛选鉴定,227 对引物可扩增获得产物,有效扩增率为 72.06%;其中 34 对引物表现出良好多态性,占有效引物的 12.78%,占总引物的 10.79%。在 34 对多态性引物中,每对引物扩增等位基因数 2~12个。利用高通量测序开发 SSR 引物有较好的实性,开发获得的 34 个具有多态性的油梨 SSR 标记可用于研究油梨及其相关近缘物种的遗传变异。     

基于转录组测序的油梨 EST-SSR 引物开发

利用转录测序技术,开发油梨表达序列标签-简单重复序列（EST-SSRs）,为 SSR 标记在油梨种质资源鉴定、 品种选育及遗传连锁图谱构建奠定基础。采用 Illumina 二代测序的技术,共获得 37 639 条无冗余的序列,对其进行 SSR 搜索,共获得 6 419 条简单序列重复（SSR）。利用 Primer 3.0 软件设计 SSR 引物,并以 11 份油梨种质筛选多态性引物。 基于转录组序列开发出的 EST-SSR 的分布频率为 17.05%。在油梨 EST-SSR 中,单核苷、二核苷和三核苷的重复占主 导,占总数的 99.07%。单、二、三核苷酸重复单元分别占总 SSR 的 37.47%、31.80%和 29.80%;出现频率最高的二核 苷酸重复基元是 AG/CT,占总数的 29.15%,出现最高的三核苷酸重复基元为 AAG/CTT,占 12.01%。随机选择 315 个 SSR 位点合成引物,经 11 份油梨种质筛选鉴定,227 对引物可扩增获得产物,有效扩增率为 72.06%;其中 34 对引物 表现出良好多态性,占有效引物的 12.78%,占总引物的 10.79%。在 34 对多态性引物中,每对引物扩增等位基因数 2~12 个。利用高通量测序开发 SSR 引物有较好的实用性,开发获得的 34 个具有多态性的油梨 SSR 标记可用于研究油梨及 其相关近缘物种的遗传变异。     

牛樟 EST-SSR 标记的开发及遗传多态性分析

本研究通过测序牛樟叶片 cDNA 获得 17 046 条 Uni-EST，从中检测出 1 316 个 SSR 位点，平均每 25.7 kb EST 含 1 个 SSR 位点。功能注释发现 1 242 条 SSR-EST 中有 690 条可被划分为 3 大功能类、18 个功能亚类。牛樟 EST-SSR 二核苷酸重复类型出现频率最高，三核苷酸次之。184 类重复基序中 AG/CT 出现频率最高（32.4%），其次为 AAG/CTT（9.3%）。从 1 242 条 SSR-EST 设计 SSR 引物 537 对，随机选取 150 对检测牛樟的多态性及在香樟、大叶樟和沉水樟中的可转移性。结果表明，有 44 对引物在牛樟中得到特异性扩增，其中 17 对具有多态性，检测出的等位基因数 2~7 个，平均 3.02 个。牛樟 SSR 标记在香樟、沉水樟和大叶樟的可转移率分别为 97.7%、97.7%和 95.3%。聚类分析表明，在遗传相似系数为 0.76 处，14 个樟属植物能被划分为 5 类，聚类结果与植物学分类结果基本吻合。     

大豆EST序列长度与SSR特性的关系

为了分析大豆EST-SSR的特征和比较其不同长度EST序列中的SSR特性,从NCBI下载了大豆EST序列,应用SSRIT搜索SSR,分析了20 183个无冗余的EST序列,发现了1747个EST序列(8.66%)含有SSR,长度超过400 bp的EST序列含SSR的比例为10.05%,而长度在400 bp以下的EST序列SSR的比例为4.74%.二核苷酸和三核苷酸SSR是大豆EST-SSR的主要类型,分别的60.45%和37.04%,最常见的SSR基元是:AT、AG、AAT、AC、AAG、ACG.在1798个EST-SSR中,51.45%的长度大于12 hp,13.35%长度大于20 hp.推断NCBI大豆EST数据库中含有12 3527个SSR,大豆EST-SSR可用于大豆分子标记,具有重要的开发价值,为有针对性设计EST-SSR引物奠定基础.     

蓖麻EST资源的SSR信息分析与功能注释

将NCBI公共数据库62 592条蓖麻EST序列进行拼接,得到无冗余Unigene 11 708条,总长度921 kb.在无冗余序列中发现含有SSR的EST序列2471条,共3 271个位点.SSR发生频率为27.94％,平均分布距离为2.81 kb.在1～6 bp的重复基元中,单核苷酸重复基元出现频率最高(37.51％),其次是三核苷酸重复基元(34.63％)、二核苷酸重复基元(25.61％).出现较多的重复基元是A/T(36.32％),其次是AG/CT(18.28％).蓖麻的EST-SSR出现频率较高、类型较丰富、多态性潜能较高,具有较高的利用价值.对蓖麻的EST-SSR功能注释(COG,SwissProt,KEGG),有9条序列注释到脂肪酸合成与代谢相关的基因,为后续有针对性开发EST-SSR标记提供重要依据,也为进一步开发蓖麻EST-SSR标记奠定基础.     

茶树EST-SSR的信息分析与标记建立

在1589条茶树EST中,共发掘出了281个EST-SSR,分布于246条EST中,出现频率是17.68%,平均长度为33.06βbp,平均分布频率是1/2.61βkb。在茶树EST-SSR中,二核苷酸重复是主要的重复类型,出现最多的重复基元类型是AG/CT重复。设计了19对SSR引物,在对引物、dNTP、MgCl₂的浓度及退火温度等参数进行测试后,建立了合适的PCR反应体系。以衍生绝大多数EST-SSR的龙井43βDNA为模板,对引物进行了筛选,有16对引物显示扩增,可用率为84.2%; 进一步在10个茶树品种中进行多态性测试,显现出多态性的引物占可扩增引物的62.5%。本文研究结果证明了根据茶树EST建立SSR标记是有效、可行的。     

油菜EST资源的SSR信息分析

从NCBI公共数据库获得63334条油菜EST，通过前处理得到全长为12165.38kb的无冗余EST 17987 条。共在这些序列中搜索出2803个SSR，分布于2443条EST中，出现频率是15.58%。这些EST-SSR的平均长度为18.84bp，平均分布频率是1/4.34kb。二核苷酸重复和三核苷酸重复是主要的类型，二者出现的频率基本相近，占总SSR的近89.05%。AG/CT和AAG/CTT是二、三核苷酸中的优势重复类型，分别占二、三核苷酸重复的84.04%和35.71%，同时对这些SSR的可用性进行了评价。     

花生EST资源的SSR信息分析

微卫星或简单重复序列(simple sequence repeats,SSR)存在于表达序列标签(expressedsequence tags,ESTs)中。为了在花生中开发EST-SSR功能性标记,利用生物信息学对NCBI公共数据库中的41501条花生ESTs序列进行EST-SSRs特征分析。剔除冗余序列,得到全长为5125.94kb的无冗余EST8391条。在这些序列中搜索出1109个SSR,分布于946条EST中,出现频率是11.27%。这些EST-SSR的平均长度为18.16bp,平均分布频率1/4.62kb。在1～6bp的重复基元中,三核苷酸重复基元的SSRs出现频率最高(49.23%),其次是二核苷酸(32.83%)、单核苷酸(14.88%)。AG/CT和AAG/CTT是二、三核苷酸中的优势重复基元,分别占二、三核苷酸重复的71.43%和31.50%。本研究为开发多态性花生微卫星标记提供了候选序列。     

小麦EST-SSRs分子标记的特性及其遗传作图

为了解普通小麦EST来源的微卫星的多样性,从大约1 000个包含微卫星的ESTs中设计了300对引物,研究和评估了它们的多态性水平,并且将多态性标记加入到现有的遗传图谱中.在五种不同类型的重复单元中,三个碱基的重复单元出现最多,占到77%.几乎所有的EST SSRs标记(99.3%)的重复单元都含有G-C碱基对.37.4%的微卫星都是四次重复.对于扩增和多态性,300对引物中有60对没有扩增,21.3%的扩增引物没能产生预期的扩增片断.58%的标记至少在所用8个材料的一个中显示出多态性.W7984和Opata组合表现出最高的多态性水平.大多数普通小麦EST-SSRs标记的重复次数小于10,并且4次重复是最为普遍的.81个新的EST-SSR位点被添加到两个已有的参照遗传图谱中(62个加到ITMI,19个加到CTCS).研究结果表明小麦EST-SSRs标记展示了一些不同于基因组微卫星的特异特征,在标记发展和其他遗传应用中,这就使得它们能够成为一种非常有价值的资源.