利用CRISPR/Cas9基因编辑技术改良大粒香稻瘟病抗性

优质稻米大粒香是采用粳籼杂交方法育成的香稻品系,多年来是贵州省优质稻米企业开发生产的主推品种.但稻瘟病抗性差,限制了其大规模推广应用.本研究以大粒香为材料,根据CRISPR/Cas 9靶点设计要求设计稻瘟病基因pid3特异性靶点sgRNA序列,构建crispr-pid3双靶点载体,通过农杆菌介导遗传转化大粒香愈伤组织,...     

环境因素对有色米糙米着色程度的影响

不同温度处理中,高温使红米赤糯着色程度加深,而黑米朝紫相反,低温使其糙米着色程度加深,高温不利于着色;遮光处理使红米赤糯着色程度降低,光照强度增加有利于赤糯糙米着色,而遮光处理对朝紫糙米着色影响很小;不同施肥处理对红米红浪漫及黑米奥之紫糙米着色程度影响不明显。 关键词：环境因素;有色米;糙米;着色程度     

聚合R基因Pigm和非R基因bsr-d1改良水稻稻瘟病抗性

综合利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和基因芯片技术,聚合主效R基因Pigm和非R基因bsr-d1,以改良优良食味水稻品种水晶3号的稻瘟病抗性。首先利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,以Bsr-d1为靶基因构建重组表达载体并通过农杆菌介导法转化水晶3号,筛选获得无T-DNA元件的bsr-d1纯合突变体,包括T插入、G插入、GA缺失、CGCA缺失和CGCAGA缺失5种突变类型。以无T-DNA成分的bsr-d1纯合突变体为母本、以携带Pigm基因的金玉1号为父本杂交、回交、自交,并利用分子育种芯片同时进行Pigm基因和背景辅助选择,最终获得抗病基因(同时携带bsr-d1和Pigm基因)纯合,且背景回复率均在96%以上的水晶3号改良株系(SJ3-G1、SJ3-G2、SJ3-G3、SJ3-G4、SJ3-G5)。稻瘟病抗性鉴定结果表明,各改良株系对稻瘟病生理小种GUY11的叶瘟抗性与野生型相比均显著提高;接种稻瘟病菌后,改良株系叶片中POD活性显著低于野生型对照,H₂O₂含量则显著高于野生型对照。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术结合基因芯...     

CRISPR-Cas9系统敲除亚麻FAD2基因表达载体的构建

CRISPR/Cas9系统是一种新型基因编辑工具,准确编辑目标基因,广泛应用于动植物的基因编辑中。本实验构建了油用亚麻品种‘陇亚10号’FAD2基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体,以CRISPR/Cas9基因编辑技术为切入点,根据Gene Bank中公布的FAD2基因序列(DQ222824.1)在FAD2基因外显子部分运用sg RNA在线设计软件CRISPR-P 2.0对亚麻FAD2基因做脱靶分析,在外显子区域选取2个片段作为靶序列进行敲除。以潮霉素作为筛选标记,采用Golden Gate cloning法构建针对‘陇亚10号’FAD2基因的CRISPR/Cas9基因敲除载体,命名为p YLCRISPR/Cas9-FAD2。将pYLCRISPR/Cas9-FAD2载体导入农杆菌并检测其稳定性,保存菌种以便后期利用农杆菌介导法转化‘陇亚10号’,为深入研究亚麻FAD2基因的功能提供参考。     

基于Cas9-Free的拟南芥ALB3基因编辑载体构建及验证

建立一种高效安全的基因定点编辑体系,为研究植物的光合作用途径以及生理代谢过程提供理想材料。针对拟南芥靶基因ALB3设计2个sgRNA,引导Cas9蛋白识别PAM位点,从而实现ALB3基因的大片段敲除;将荧光筛选标记基因mCherry组装到CRISPR/Cas9载体中,构建一种带有荧光筛选标记的CRISPR/Cas9载体;利用农杆菌转化法转化拟南芥,对其后代进行筛选验证,在倒置荧光显微镜下挑选便可获得Cas9-Free的纯合突变种子。测序结果表明,含有可视化筛选标记基因的拟南芥ALB3基因编辑载体序列与预期一致,由此证明载体构建成功;通过倒置荧光显微镜观察,发现阳性转化拟南芥T₀种子含有红色荧光标记,表观观测以及分子鉴定表明T₁植株得到纯合突变后代,条带大小小于野生型,白化突变性状明显。挑选T₁不含荧光的种子进行培育得到的T₂植株,经分子鉴定发现已成功实现Cas9-Free且植株白化。本研究成功构建了一种带有荧光筛选标记且可实现拟南芥ALB3基因敲除的CRISPR/Cas9载体,并获得Cas9-Fre...     

靶向马铃薯StProDH1基因的CRISPR/Cas9 sgRNA表达载体构建

CRISPR/Cas9基因编辑系统已成为许多作物基因功能研究和品种改良的重要工具。脯氨酸(Pro)在植物响应干旱胁迫方面起着重要作用,脯氨酸脱氢酶ProDH是脯氨酸分解途径中的限速酶。为了研究StProDH1在马铃薯脯氨酸代谢中的作用,本研究以StProDH1为靶基因,构建了表达马铃薯脯氨酸脱氢酶g RNA的CRISPR/Cas9基因敲除系统,在StProDH1基因5'端第一个外显子上为靶标区域选择设计sgRNA,以p P1C.4为模板,克隆得到sgRNA克隆框,将得到的sgRNA克隆框通过同源重组技术连接到pP1C.4载体中,获得pP1C.4-Cas9-ProDH1-g RNA载体。通过设计引物特异性扩增以及测序进一步确定sgRNA准确地连入载体,这对马铃薯中脯氨酸累积及其培育抗旱马铃薯新品种具有重要意义。     

转苦瓜几丁质酶基因McCHIT1水稻及其稻瘟病抗性

稻瘟病是危害水稻的最严重病害之一,探索利用外源基因提高水稻抗稻瘟病水平对现代育种具有重要意义。本研究从T₂代起逐代增加抗性选择压,采用苗期人工混合接种和病圃田自然诱发等鉴定方法,对转基因水稻后代进行稻瘟病抗性鉴定和筛选,在T₅代获得了7个稻瘟病抗性极显著增强的转McCHIT1基因水稻稳定株系。通过7个生理群26个生理小种的115个稻瘟病有效单孢菌株苗期抗谱测定,这7个株系的抗病频率为52.2%~61.4%,比受体对照缙恢35 (36.8%)高16个百分点以上,主要增加了对ZE群生理小种的抗性,提高了对ZG群、ZF群和优势种群ZB群生理小种的抗性。C36-2-1、C21-6-2、C21-3-1等3个株系的结实率达80%以上,是丰抗结合较好的转McCHIT1基因株系。McCHIT1基因具有广谱抗性,将其遗传转化水稻,采用“逐代增加选择压,抗中选抗”的方法,可筛选出稻瘟病抗性优良、抗谱明显拓宽、产量性状较好的转基因稳定株系。     

新疆小拟南芥NPR1基因对植物系统获得性抗性的影响

旨在研究小拟南芥NPR1基因的第三内含子对基因表达的影响。克隆出带有第三内含子的小拟南芥NPR1基因,构建诱导型植物表达载体并对拟南芥进行农杆菌遗传转化,经5 mmol/L外源水杨酸12 h诱导,利用Real-time PCR技术检测拟南芥病程相关蛋白的表达量。结果显示野生型拟南芥的NPR1、PR-1、PR-2、PR-5表达量高于转基因拟南芥;相对于野生型拟南芥,转基因拟南芥中SOD、POD酶活显著降低,而CAT酶活增加未达到显著水平。结果表明转入含有第三内含子的Ap.NPR1基因,转基因植株系统获得性抗性途径受到抑制,植株抗病性降低,说明第三内含子使得系统获得性抗性途径的基因表达受到抑制。     

稻瘟病新抗性基因Pi39候选基因CRISPR/Cas9敲除载体的构建

Pi39是位于水稻第12染色体上的稻瘟病新抗性基因,为了明确其功能,本研究利用CRISPR/Cas9系统构建候选基因的敲除载体。通过对候选基因序列分析,将合成的靶位点序列插入入门载体pENTR-sgRNA,再与表达载体Cas9发生重组。本研究首先在候选基因的第一个外显子区域找到了2个带有PAM序列的靶位点,将2个目的小片段依次克隆到pENTR-sgRNA载体上。通过菌落PCR检测及测序,结果表明目的小片段插入位置正确。将入门载体与表达载体进行重组反应后,阳性克隆经菌落PCR和质粒DNA酶切鉴定并测序,结果表明重组载体构建成功。本研究利用CRISPR/Cas9系统构建敲除载体操作简单,耗时短,为进一步开展Pi39候选基因的功能研究奠定了基础。     

分子标记辅助选育聚合抗稻瘟病基因Pi5及Pita的水稻新品系

稻瘟病是对水稻生产具有严重威胁的真菌病害,选育并推广聚合多个抗稻瘟病基因的抗病品种是防控该病最为经济有效的途径.本研究以携带不同抗稻瘟病基因的'吉粳105'(Pita)和'T639'(Pi5)为亲本杂交衍生的后代群体为试材,利用分子标记辅助育种技术,筛选到3个聚合抗稻瘟病基因Pita.和Pi5的后代.并以其中一个株系'...     

空间诱变水稻品系T2的稻瘟病抗性分析及抗病基因定位

为了弄清水稻空间诱变稻瘟病抗性变异遗传机理,以一个空间诱变抗稻瘟病突变体T2为研究对象,采取抗谱测定,遗传分析及基因定位等方法,结果发现:2013年晚造T2抗谱达到90.6%,高于部分广东主栽品种;遗传分析表明,其对GD0193的抗性由1个显性主效基因控制,暂命名为PiTH;并通过SSR和InDel标记将该基因定位于水稻11号染色体SSR标记T5与InDel标记K10之间约1.63cM的遗传区域内。目前,该位点包含Pik抗病基因簇,因抗性差异,PiTH可能为该位点一新基因。     

稻瘟病抗性基因Pita在中日韩粳稻中的分布

为了解2 350份来源中国、日本和韩国粳稻品种(系)稻瘟病抗性基因Pita的分布,利用2个KASP分子标记对该基因进行了检测,605份材料表现有利,1 732份不利,7份为杂合,6份不确定。在有利、不利和杂合三个群体中分别随机选取316份、101份和7份材料,对Pita基因功能片段进行了测序分析,结果显示有利群体中KASP检测结果准确率为95.89%,不利群体100%,2个KASP分子标记可以用来联合检测水稻种质资源的Pita抗性基因。根据KASP分子标记检测结果,在中国北方地方稻种中仅0.69%品种携带Pita抗性基因,在中国13个省区市育成品种(系)和日本韩国外来稻种中均有一定的分布,频率7.02%~55.81%,表明Pita基因在东亚地区范围内均得到了一定的应用,但各地区应用程度相差较大,其中中国吉林、辽宁、宁夏、浙江四省地区较高。通过415份材料Pita基因功能片段609个碱基序列的比较,仅发现3个变异位点(第2 388位,第2 752位,第2 766位)和4种基因单倍型,其中抗性基因仅一种单倍型(H1),感病基因有三种单倍型(H2, H3, H4),H2为优势单倍型(84.84%)。本研究结果为开发和利用中日韩地区稻种资源和品种布局提供了依据。     

水稻稻瘟病抗性基因研究综述

In this paPer，authors gave the review of research progress in rice blast resistance genes．Number of genes conferring rice blast，widely used resistant materials to blast and method of rice blast identification have been summaried in details．The strategies of rice blast resistance breeding are also discussed．     

水稻抗稻瘟病基因Pi47的精细定位和候选基因分析

不断挖掘和克隆抗稻瘟病新基因, 是解析水稻抗病分子遗传机制和培育抗稻瘟病新品种的重要基础。Pi47是笔者从广谱、持久抗稻瘟病湖南地方品种湘资3150中鉴定的稻瘟病抗性基因, 前期研究将其初步定位于第11染色体标记RM224和RM5926间。本研究利用3个Pi47单基因系与感病亲本CO39杂交F₂群体1687个感病单株对Pi47精细定位, 利用6个STS标记对3个单基因系进行背景分析, 采用生物信息学方法进行了候选基因分析。结果表明, Pi47被精细定位于CAPS标记S32与K33间0.24 cM区域的171.2 kb物理区间内, 背景分析将Pi47进一步缩小至SC12和K33间67.8 kb的区间内; 该区间含有8个结构基因, 其中2个编码NBS-LRR抗病类似蛋白, 为Pi47的候选功能基因。稻瘟菌抗谱比较分析发现, Pi47单基因系与其定位区间内4个Pik位点的等位基因Pik、Pikm、Pikh和Pikp的近等基因系抗谱不同。这些结果为进一步克隆Pi47和利用其进行分子标记辅助选择培育抗稻瘟病水稻新品种奠定了基础。     

基于CRISPR/Cas9技术对水稻ALOG家族成员的基因敲除突变体的构建

ALOG (Arabidopsis LSH1 and Oryza G1)基因家族成员广泛存在陆生植物中,并在其生长发育的过程中起到关键作用。在水稻ALOG基因家族中总共有10个成员(G1, G1L1～G1L9),G1、G1L5和G1L6已经被证明是影响水稻花发育的关键基因,然而其余7个基因成员的功能还未知。本研究使用CRISPR/Cas9基因编辑系统对水稻ALOG基因家族功能未知的7个成员进行基因敲除,得到它们的突变株系,借此研究它们的基因功能并观察植株表型。在得到的所有T0代突变体植株中,G1L1、G1L2、G1L3、G1L8和G1L9经过测序和解码已经检测到各自纯合的突变株,经过对纯合突变株基因型和氨基酸序列的分析发现,它们各自的序列都发生移码并且编码的氨基酸序列都存在不同程度的突变,说明基因敲除成功。通过对T0代纯合植株的表型观测,我们在G1L1和G1L2的纯合突变株中发现了穗发育缺陷的表型,即主穗轴变长,且上面的小穗变少。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对水稻ALOG基因家族成员进行敲除,为进一步研究水稻发育尤其是水稻花发育调控分子机制提供了重要的遗传材料。     

二倍体马铃薯基因编辑载体快速验证体系的建立

基于马铃薯熟性基因StCDF1的序列,构建了含有绿色荧光蛋白CRISPR/Cas9-StCDF1载体,并建立了农杆菌介导二倍体马铃薯遗传转化快速验证基因编辑载体的实验体系。结果表明,在发根农杆菌介导的遗传转化过程中,在生根培养基中添加2mg·L^-1的抗生素特美汀,能有效抑制发根农杆菌且不影响发状根的生长。利用荧光检测可实现对转化再生的阳性发状根进行快速筛选。结合对阳性根中拟编辑靶标序列的测序分析,发现所筛选出的阳性发状根中出现多种缺失类型,证明所构建的基因编辑载体和荧光筛选方法的可靠性。进一步利用根癌农杆菌介导转化马铃薯茎段,通过稳定的遗传转化最终获得1株StCDF1缺失5bp的杂合突变体。本研究在二倍体马铃薯中建立了快速验证基因编辑载体的方法,并获得了1株基因编辑植株,为后续研究StCDF1基因的调控网络提供了材料。