牦牛乳酸脱氢酶-1两种遗传变异体的纯化及酶学特性比较

 【目的】从乳酸脱氢酶（LDH）水平上探索牦牛(Bos grunniens)低氧适应性分子机制。【方法】利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析牦牛组织中LDH同工酶谱;用比色法测定牦牛、黄牛和水牛心脏、肝脏和肌肉组织中LDH总活力;采用染料亲和层析和DEAE-Sephadex离子交换层析从牦牛心肌组织中纯化LDH1（由4个H亚基组成）的2种遗传变异体,进行酶学性质的比较。【结果】电泳方法检测发现牦牛LDH1存在2种遗传变异体,根据电泳迁移率分别命名为快型和慢型（LDH1-F和LDH1-S）。获得纯化的牦牛LDH1-F和LDH1-S,比活力分别为21.4 U?mg-1蛋白和17.8 U?mg-1蛋白,在SDS-PAGE和PAGE上均显示1条区带。2种变异体以NADH为底物的米氏常数（Km）值差异不大,均显著高于普通牛的LDH1;以丙酮酸钠为底物的Km值LDH1-F小于LDH1-S。试验进一步比较了携带不同LDH1变异体的牦牛心脏、肝脏和肌肉组织中LDH总活力和各种同工酶谱,未见显著差异,而牦牛心脏、肝脏和肌肉组织中LDH总活力显著或极显著低于黄牛和水牛。【结论】牦牛LDH1 2种遗传变异体的Km值存在差异,且Km(NADH)高于普通牛;牦牛心脏、肝脏和肌肉组织中LDH总活力低于普通牛。     

麦洼牦牛和九龙牦牛乳酸脱氢酶H亚基的遗传变异体

用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，对109头麦洼牦牛和100头九龙牦牛乳中的乳酸脱氢酶（LDH）同工酶进行检测。结果表明：两品种牦牛乳中LDH在凝胶上仅显示出由4个H亚基组成的LDH11条区带。试验共检测到4种LDH1的遗6传变异体，按迁移率由大到小依次为A、B、C、D，其中D型仅存于九龙牦牛中，C型在两品种牦牛中均占明显优势。麦洼牦牛和九龙牦牛LDH1表型频率分布差异极显著。     

麦洼牦牛和九龙牦牛乳酸脱氢酶H亚基的遗传变异体

用聚丙烯酰胺凝胶电泳法 ,对 1 0 9头麦洼牦牛和 1 0 0头九龙牦牛乳中的乳酸脱氢酶 (LDH)同工酶进行检测。结果表明 :两品种牦牛乳中 LDH在凝胶上仅显示出由 4个 H亚基组成的 LDH1 1条区带。试验共检测到 4种 LDH1 的遗传变异体 ,按迁移率由大到小依次为 A、B、C、D,其中 D型仅存在于九龙牦牛中 ,C型在两品种牦牛中均占明显优势。麦洼牦牛和九龙牦牛 LDH1 表型频率分布差异极显著     

2株黑曲霉植酸酶的分离纯化及其酶学性质研究

对黑曲霉A3214及其诱变株N14所产植酸酶进行分离纯化并研究各种酶学性质,表明A3214植酸酶和N14植酸酶的最适pH均为2．5,最适温度均为50℃,60℃保温10min后酶活保留均在80％左右,用胃蛋白酶处理后酶活均保留80％左右,分子量均为47．4KD,等电点均在4．5到5．0之间,K^＋,Na^＋,Ca^2＋,Mg^2＋．Fe^2＋在高浓度时对A3214植酸酶和N14植酸酶都有抑制作用,而Zn^2＋,Cu^2＋,Mn^2＋却几乎没有抑制作用,A3214植酸酶对植酸钠的Km值为0．0005mol／L,N14植酸酶对植酸钠的Km值为0．0004mol／L,A3214植酸酶的比活为135777．5u／mg,N14植酸酶的比活为148447．5u／mg。     

南极磷虾羧肽酶A的分离纯化及其酶学性质分析

[目的]建立南极磷虾羧肽酶A的分离纯化方法,并研究分析其酶学性质,为南极磷虾羧肽酶A的开发及应用打下基础.[方法]南极磷虾粗酶液经硫酸铵分级沉淀、HiTrap DEAE FF阴离子交换柱层析和SEC 70凝胶过滤柱层析,纯化得到的羧肽酶A,以SDS-PAGE分析其分子量;通过分析酶系反应温度、pH、金属离子、抑制剂对南极磷虾羧肽酶A活力的影响,明确其酶学性质和酶促动力学.[结果]南极磷虾羧肽酶A分子量为75.0 kD,其最适温度30℃,最适pH 8.0.Mg2+、Zn2+、Mn2+和Ni2+对南极磷虾羧肽酶A有显著的激活作用(P<0.05,下同),且金属离子浓度越高,激活效果越明显;Ca2+、Fe3+、Cu2+和Hg2+对南极磷虾羧肽酶A存在不同程度的抑制作用,以Hg2+的抑制作用最强,Fe3+的抑制作用最弱.金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙酸(EDTA)、3-苯基丙酸(3-phenylpropionic acid)和1,10-菲罗啉(1,10-phen-athroline)对南极磷虾羧肽酶A活力有显著的抑制作用,且抑制剂浓度越高,抑制效果越明显.[结论]南极磷虾羧肽酶A具有金属蛋白酶特性,可开发成降解酶制剂在食品工业及医药行业中推广应用.     

2株黑曲霉植酸酶的分离纯化及其酶学性质研究

对黑曲霉A 3214及其诱变株N14所产植酸酶进行分离纯化并研究各种酶学性质,表明A 3214植酸酶和N14植酸酶的最适pH均为2.5,最适温度均为50℃,60℃保温10 min后酶活保留均在80%左右,用胃蛋白酶处理后酶活均保留80%左右,分子量均为47.4 KD,等电点均在4.5到5.0之间,K+,Na+,Ca2+,Mg2+,Fe2+在高浓度时对A3214植酸酶和N 14植酸酶都有抑制作用,而Zn2+,Cu2+,Mn2+却几乎没有抑制作用,A 3214植酸酶对植酸钠的Km值为0.0005 mol/L,N 14植酸酶对植酸钠的Km值为0.0004 mol/L,A 3214植酸酶的比活为135 777.5u/mg,N 14植酸酶的比活为148 447.5u/mg.     

多氯联苯降解酶的分离纯化及酶学性质研究

采用硫酸铵盐析浓缩、透析、Sephdex G-150凝胶过滤层析,对表皮葡萄球菌产生的多氯联苯(PCBs)降解酶进行分离纯化.粗酶经30%～80%饱和度硫酸铵沉淀法纯化后比酶活可提高到442.29 U/mg;经透析后的比酶活可提高到480.75 U/mg;最后经凝胶层析法纯化后的比酶活可提高到6 903.57 U/mg...     

“桑蚕乳酸脱氢酶基因的克隆与表达分析

为了研究野桑蚕乳酸脱氢酶基因的功能,选择野桑蚕5龄3日幼虫的组织及不同发育时期的个体,利用 PCR 技术对野桑蚕乳酸脱氢酶基因进行克隆,得到野桑蚕乳酸脱氢酶基因开放阅读框长度为996 bp,没有内含子,只有1个外显子。该基因编码的蛋白含有331个氨基酸残基,等电点为6·76,分子量为36·35 kD。氨基酸序列分析表明,该蛋白高度保守,亚细胞定位预测分析表明该蛋白主要定位于细胞质中。转录表达分析表明,该基因在野桑蚕5龄3日幼虫的组织（马氏管、中肠、表皮、脂肪体、丝腺、血液、精巢和卵巢）及不同发育时期的个体（卵、幼虫、蛹和蛾）中均有表达,且表达量趋于一致。表明乳酸脱氢酶基因在野桑蚕的生命活动中可能具有重要的生理功能。     

日本鳗鲡肠道蛋白酶的分离纯化及其酶学性质研究

【目的】从日本鳗鲡(Anguilla japonica)肠道中分离纯化蛋白酶并分析其酶学性质,为日本鳗鲡饲料的科学研制提供理论依据。【方法】通过硫酸铵沉淀分级分离及Sephadex G-100和Sephadex G-75两级凝胶柱层析纯化日本鳗鲡肠道蛋白酶,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和SDS-PAGE鉴定蛋白酶纯度和亚基分子质量,利用凝胶层析法测定酶的分子质量,用等电聚焦电泳法测定酶的等电点,并研究以酪蛋白为底物时蛋白酶催化反应的动力学参数及pH、温度、金属离子和修饰剂对蛋白酶活力的影响。【结果】日本鳗鲡肠道蛋白酶亚基分子质量为65.3ku,酶分子质量为260.3ku,等电点为8.23;该蛋白酶的最适pH为8.2,最适温度为55℃,米氏常数(Km)为4.832mg/mL,最大反应速度(Vmax)为0.269U/min。日本鳗鲡肠道蛋白酶在pH为6.6~9.0时表现稳定,在20~55℃时具有较好的热稳定性,在60℃以上稳定性迅速下降。Mg2+、Ca2+、Co2+、Ba2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+和Hg2+对日本鳗鲡肠道蛋白酶的活力表现出不同程度的抑制作用,其中以Hg2+的抑制作用最强,1 mmol/L Hg2+可使酶活力丧失87.63%;而Fe2+有激活作用,5mmol/L Fe2+可使酶活力提高134.53%。修饰剂EDTA、对氯汞苯甲酸(pCMB)和Cys对酶活力没有影响,苯甲酰基磺酰氟(PMSF)和二硫苏糖醇(DTT)对酶活力则有不同程度的抑制作用。【结论】日本鳗鲡肠道蛋白酶由4条相同肽链组成,属于丝氨酸蛋白酶类,二硫键是维持其活性所必需的,酶活力易受环境中酸碱度、温度和金属离子调控。     

南极磷虾羧肽酶的分离纯化及酶学性质

南极磷虾生活在极寒环境,其体内特殊的蛋白酶系统是其维持正常新陈代谢的关键因素。羧肽酶是南极磷虾蛋白酶系统中一类主要且关键的蛋白酶,酶学性质研究对其后续基础研究开展及商业利用都具有指导意义。本研究以南极磷虾为原料,采用缓冲液提取、硫酸铵分级盐析,DEAE-琼脂糖凝胶FF阴离子层析和Sephadex G-100凝胶层析,从南极磷虾匀浆液中分离纯化出一种羧肽酶,SDS-PAGE结果显示其分子量为30 ku。酶学性质研究结果显示:该酶最适温度为30℃;最适pH为8.0。热稳定性较差,即使在4℃下保温超过2 h酶活性会急剧下降。金属离子Ni~(2+)、Mn~(2+)、Zn~(2+)和Mg~(2+)具有激活作用,且激活作用依次增强;而Ca~(2+)、Fe~(3+)和Cu~(2+)起抑制作用,Cu~(2+)抑制效果最明显。对巯基有修饰作用的抑制剂DTT和β-巯基乙醇对其有抑制作用,推测该酶活性中心存在二硫键;金属蛋白酶抑制剂EDTA和1,10-菲罗啉对该酶活性有明显的抑制作用,说明了其具有金属蛋白酶特性;而丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF对该酶抑制作用并不强烈。以脲酰-L-苯丙氨酸为底物溶液,测得该酶K_m为0.005 9 mg/mL、V_(max)为4.909 1 U/min。     

不同海拔地区牦牛组织线粒体LDH活性测定

[目的]进一步探讨高原动物对高原低氧的适应机制。[方法]测定青海省玛多县(海拔4300 m左右)和刚察县(海拔3 300 m左右)牦牛心肌、骨骼肌线粒体中的乳酸脱氢酶(LDH)活性。[结果]玛多县和刚察县牦牛心肌、骨骼肌线粒体的乳酸脱氢酶(LDH)活性分别为(2472.40±276.58)、(2448.71±494.69)、(3855.07±316.44)、(3882.62±602.87)U/gPro;玛多牦牛的心肌、骨骼肌线粒体中的LDH活性极显著低于刚察牦牛(P<0.01)。[结论]在高原低氧环境下,牦牛随海拔高度升高对无氧代谢的依赖性降低。     

类乌齐牦牛乳酸脱氢酶基因克隆及组织表达

旨在克隆西藏类乌齐牦牛乳酸脱氢酶(LDHB)基因并检测其组织表达情况,为给进一步研究LDHB在高海拔地区的极端低氧适应性及能量代谢中的调控作用提供依据。结果表明,类乌齐牦牛LDHB基因CDS区全长1 004bp,编码334个氨基酸,存在2处碱基突变,导致密码子分别由AAG→GAG(赖氨酸→谷氨酸)、ATC→AGC(异亮氨酸→丝氨酸);编码蛋白分子质量为36.72ku,为疏水稳定性蛋白,功能预测在糖酵解及氧化还原等过程中发挥主要功能;系统进化树表明,西藏类乌齐牦牛与九龙牦牛、黄牛的氨基酸序列相似性最高,亲缘关系最近,其次为山羊、宽吻海豚、猪、马、羊驼和野生双峰骆驼,与鸡、乌鸦、非洲爪蟾和鲤鱼较远;定量分析显示,LDHB基因在牦牛肺脏中的表达水平显著高于心脏和肝脏,推测该基因与牦牛抗缺氧性状相关。     

牦牛心脏脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因的克隆及序列分析

【目的】对牦牛H-FABP基因进行克隆和序列分析，以期为进一步开展牦牛该基因与其肉质性状的相关分析，进行分子标记辅助选择以及基因定位、表达等研究提供理论基础。【方法】用特定引物对牦牛H-FABP基因进行PCR扩增并进行T-A克隆和测序，在此基础上使用RepeatMasker、DNAMAN4.0、BioEdit4.8.10、Clustal W1.81等生物信息学软件进行序列分析。【结果】牦牛H-FABP基因(已在NCBI上登录，登录号为DQ026674)由4个外显子和3个内含子组成，CDS序列全长为402 bp，前体氨基酸数为133个。4个外显子大小分别为73 bp、173 bp、102 bp和54 bp；3个内含子大小分别为3 460 bp、1 892 bp和1 495 bp；外显子与内含子的连接区序列遵循通常的基因组成规律。外显子和内含子个数与普通牛、绵羊、山羊、猪、人、大鼠、小鼠、鸡、斑马鱼各物种相同。牦牛H-FABP基因序列中，重复序列所占比率为13.07%。内含子Ⅰ含有5个重复元件，包括1个SINE/Artiodactyls元件、1个SINE/MIR3元件、1个SINE/Bov-tA1元件和2个SINE/MIR元件；内含子Ⅱ无重复元件；内含子Ⅲ有3个重复元件，其中SINE/MIR元件、LINE/L2元件、SINE/Artiodactyls元件各1个。SINEs短重复序列所占比率为11.85%，哺乳动物分散性重复序列MIRs比率为6.44%。LINEs所占比率为1.22%，小于SINEs元件。其中，LINE1、BovB/Art2、L3/CR1重复元件以及LTR类反转录元件和DNA转座子元件在牦牛该基因区域中不存在。不同物种间在该基因编码区核苷酸序列和氨基酸序列上有较高的保守性。牦牛与普通牛、绵羊、山羊、猪、人、大鼠、小鼠、鸡、斑马鱼各物种在H-FABP基因编码区核苷酸序列上同源性大小分别为99.8%、97.8%、97.0%、92.8%、88.8%、83.3%、83.1%、76.4%、68.7%；相应的氨基酸序列间同源性大小为100%、96.9%、96.9%、92.4%、88.7%、85.7%、85.7%、77.4%、69.9%。【结论】牦牛H-FABP基因由4个外显子和3个内含子组成，其中外显子I、外显子Ⅱ、 外显子Ⅲ 和外显子Ⅳ大小分别为73 bp、173 bp、102 bp和54 bp，内含子I、内含子Ⅱ和内含子Ⅲ大小分别为3 460 bp、1 892 bp和1 495 bp。牦牛该基因区域含有较为丰富的重复序列元件且外显子与内含子的连接区序列遵循通常的基因组成规律。牦牛与普通牛、绵羊、山羊、猪、人、大鼠、小鼠、鸡、斑马鱼9个物种在H-FABP基因编码区核苷酸及氨基酸序列上具有较高的保守性。     

南方根结线虫乳酸脱氢酶基因克隆及其沉默效应分析

【目的】对南方根结线虫乳酸脱氢酶基因（mildh）进行克隆分析,并探索mildh沉默对南方根结线虫（Meloidogyne incognita）病害的抑制作用。【方法】在前期研究中,利用生物信息学方法在线虫全基因组中预测了一些线虫RNA干扰（RNAi）表型基因。本研究以预测的线虫ldh设计特异引物克隆南方根结线虫中mildh。对克隆到的mildh序列进行了特征分析后,利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术,将其导入番茄植株,并接种南方根结线虫,研究mildh基因沉默对根结线虫根结数量影响。【结果】克隆到的mildh包含1个完整的编码框序列,编码315个氨基酸。该基因与预测到的mildh核苷酸序列一致性高达94.9%,所编码的氨基酸一致性高达95.5%。构建烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）介导的沉默载体pTV-mildhi,并用该沉默载体对番茄植株进行处理后,接种南方根结线虫。60 d后统计发现,pTV-mildhi处理的番茄植株上根结数分别比空载体对照减少48.6%,比清水对照降低48.4%。【结论】mildh基因沉默对南方根结线虫具有显著的抑制作用,也说明mildh可能参与根结线虫的致病性,该研究对线虫的病理学研究及线虫病害防控研究提供了新的理论基础。     

牦牛EPO基因的PCR-SSCP多态性研究

以巴州牦牛、大通牦牛和九龙牦牛为对象,对促红细胞生成素(EPO)基因用PCR-SSCP方法进行了多态性检测。结果表明:大通牦牛、巴州牦牛、九龙牦牛具有较丰富的遗传多样性,表现为AA,AB和BB3种基因型,AB为优势基因型,A为优势等位基因;经χ2适合性检验,3个牦牛品种在该基因位点上均处于Hardy-Weinberg平衡状态。同时发现随着海拔高度的增加,A等位基因频率逐渐升高,BB型的频率则降低,群体杂合度和多态信息含量也逐渐降低,这种变化可能与牦牛对低氧的适应能力有一定的关系。     

"大通牦牛"Lfcin基因克隆及生物信息学分析

[目的]克隆“大通牦牛”Lfcin基因,为将该基因应用于饲料工业和养殖业提供依据。[方法]利用PCR技术从“大通牦牛”基因组DNA中获得乳铁蛋白素（Lactoferricin,Lfcin）基因序列;将Lfcin基因连接于pGEM-T easy载体,送至生物公司测序;将“大通牦牛”与奶牛的Lfcin基因序列进行比对;同时,对牦牛、奶牛、人、小鼠等物种的Lfcin蛋白进行序列分析和进化树分析。[结果]克隆获得了含“大通牦牛”LF（Lactoferrin）第二外显子的DNA序列,共778bp,其中Lfcin基因编码区长75bp,编码25个氨基酸;序列分析显示,克隆获得的牦牛DNA序列与奶牛该序列存在11个碱基的变异;牦牛和奶牛的Lfcin蛋白质序列完全相同,各物种Lfcin蛋白具有较高的同源性;进化树分析表明Lfcin进化树符合物种进化规律。[结论]该研究为Lfcin基因在原核或真核细胞中的表达研究以及进一步研究Lfcin蛋白的生活活性奠定了基础。     

“大通＂牦牛Lfcin基因克隆及生物信息学分析

乳铁蛋白素（Lactoferricin,Lfcin）是从乳铁蛋白（LF）上被胃蛋白酶水解下来的25个氨基酸残基的小肽,位于乳铁蛋白第二外显子,是乳铁蛋白的抗菌活性中心,其抗菌活性是LF的几百倍。Lfcin具有广谱抗菌活性,对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有效,同时具有抗真菌、抗病毒、抑制肿瘤细胞生长、参与免疫调节等多种生物学功能和维持动物肠道菌群正常生态稳定的功能,从而起到提高动物生产性能的作用。     

麦洼牦牛血红蛋白α链基因的克隆测序

从麦洼牦牛脊髓中提取总RNA，利用RT-PCR扩增血红蛋白α链基因，获得了532bp的cDNA，连接到PMD-l8载体上，然后转化TOP-10感受态细胞进行克隆测序。结果显示，牦牛血红蛋白α链基因与普通牛相比存在2个碱基差异，并导致血红蛋白α链71位的1个氨基酸改变。此外，还用电泳方法研究了血红蛋白在新生犊牦牛中的表达。     

“大通”牦牛Lfcin基因克隆及生物信息学分析(英文)

[Objective] This study was to clone Lfcin gene from Datong yak, so as to provide reference for applying this gene in feed industry and breeding industry. [Method] Using PCR technology, the lactoferricin(Lfcin)-encoding gene was obtained from genome of Datong yak; then it was cloned into pGEM-T easy vector, and then sequenced; the sequencing results were subsequently aligned with the sequences of dairy cow accessed in GenBank. Moreover, amino acid sequences of Lfcin gene from various species including yak, dairy cow, human and mouse were used for sequence alignment and phylogenesis analysis. [Result] The second exon of lactoferrin(LF) from Datong yak, which is 778 bp in length, was obtained, within which the coding region of Lfcin gene is 75 bp (25 amino acid residues); sequence analysis showed that there is discrepancy of eleven bases between Datong yak and dairy cow; Lfcin proteins from various species shared high homeology, of which that from Datong yak and dairy cow were completely identical; phylogenesis analysis showed that cladogram based on Lfcin was consistent with species evolutionary law. [Conclusion] This study laid a foundation for the prokaryotic or eukaryotic expression of Lfcin gene and further understanding the activity of Lfcin protein.