H9N2亚型禽流感病毒细胞灭活疫苗的免疫效果评价

由于经济和技术因素的制约,尚未有成功的禽流感细胞疫苗产品上市.为此,本研究在细胞扩增而来的含有H9亚型禽流感病毒(AIV)HA和NA基因的SH441HANAPR8(NS mutant)重组病毒里加入终浓度为0.1％的甲醛进行灭活.结果显示,37℃条件下灭活24 h的效果最佳.灭活好的H9 AIV SH441HANAPR8(NS mutant)与佐剂Montanide ISA 70VG乳化制备成灭活苗,以0.05、0.1、0.2、0.3 mL/只的剂量,分别胸部肌肉注射免疫3周龄的SPF鸡,并于免疫后21d静脉感染A/Chicken/Shanghai/441/2009 (H9N2) AIV.结果显示,该疫苗的最小免疫剂量为0.2 mL.此外,研究还发现,当HI抗体效价≥25时,疫苗对鸡只的攻毒保护率达到100％.     

H9N2亚型禽流感病毒的研究现状

H9N2亚型禽流感病毒已在世界范围内的禽类中分离确认,并被证实可以传播到人类和低等哺乳类动物。对于它存在的潜在危害已经越来越多地受到关注,相关的研究也相继开展。许多遗传进化的分析为禽或猪流感可以直接感染人提供了证据,通过在人体的适应或与人流感病毒基因重组,可以形成新的病毒株,引起人类流感疫情暴发。文章提示应当密切监控H9N2亚型禽流感病毒,防止人类流感大流行。     

H9N2亚型禽流感病毒分离鉴定及免疫试验

为了更好防控H9N2亚型禽流感,且做到科学免疫,免疫减负.本研究采集疑似感染低致病禽流感鸡群病料,将其无菌处理后接种SPF鸡胚后进行病毒分离,通过分子生物学试验对其进行病原学鉴定.结果显示:分离鉴定出一株H9亚型禽流感病毒(AIV);血凝试验(HA)效价在10～11,该病毒属于欧亚分支的BJ亚分支.将病毒纯化后,制备灭...     

H9N2亚型禽流感病毒疫苗研究进展

H9N2亚型禽流感病毒在世界范围内广泛存在,给养禽业造成巨大的经济损失,并危害人类健康。流感病毒抗原易发生漂移和转换,使流感病毒的防控变得困难。疫苗接种是防控禽流感最有效的手段之一,全病毒灭活疫苗保护效果好,制备简单,是流感病毒常用的疫苗,但该疫苗局部副反应大,并伴随生物安全问题。随着分子生物学技术的发展,活载体疫苗、核酸疫苗、亚单位疫苗等新型疫苗的开发,给H9N2亚型禽流感病毒的防控提供了新的手段。新型疫苗除具有传统疫苗的保护效果外,在生物安全和普遍防控方面具有广泛的优势,是流感病毒疫苗发展的新方向。     

H9N2亚型禽流感灭活疫苗的免疫效果评价

为充分了解10多年来在生产中普遍使用的H9N2亚型禽流感(AI)灭活疫苗(F株)对鸡群的免疫保护效果,本研究以F株灭活疫苗分别接种SPF鸡和罗曼鸡,通过检测其抗体水平,分析比较抗体消长规律;同时以2009～2010年间从免疫鸡群中分离到的9株H9N2亚型AIV为素材,通过F株灭活苗免疫攻击试验,来评价该疫苗对上述9株分离株体内感染的免疫保护效果。结果显示:F株灭活疫苗免疫SPF鸡和罗曼鸡3周后,产生的HI抗体效价均在7log2以上,且持续时间长,SPF鸡达15周,罗曼鸡在11周以上。SPF鸡免疫群用F9株、L9株、S9株和D9株和F株攻击7d后,对鸡的咽喉和泄殖腔排毒有100%的抑制作用,用其它5株(F119、W9、YD、M和D119)攻击后的抑制作用为90%;罗曼鸡免疫群用L9株、F9株、S9株、D9株、W9株和F株攻击7d后,对鸡咽喉和泄殖腔排毒有100%的抑制作用,用其它4株(F119株、YD株、M株和D119株)攻击后的抑制作用为90%;未接种疫苗的对照组鸡攻击7d后排毒率均为10/10。     

H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因序列的初步分析

禽流行性感冒 ,简称禽流感 (ＡｖｉａｎＩｎｆｌｕｅｎｚａ ,ＡＩ)是由正黏病毒科、流感病毒属、Ａ型流感病毒所引起的禽类的感染和/或疾病综合症 ,被国际兽疫局确定为Ｉ类烈性传染病 ,并被列入国际生物武器公约动物传染病名单。ＯＩＥ根据对家禽所造成的疾病程度 ,将禽流感划分为高致病禽流感ＨＰＡＩ和低致病禽流感ＬＰＡＩ。Ｈ9Ｎ2亚型禽流感病毒 ,属低致病力禽流感病毒。 1994～ 1999年期间 ,该亚型病毒在全球呈广泛流行趋势 ,且危害日趋严重。中国在 1994年 ,由陈伯伦等[1] 人报道 ,在广东某鸡场的蛋鸡中分离到我国第 1株Ｈ9Ｎ2亚型禽…     

用红细胞吸附释放法纯化H9N2亚型禽流感病毒

制备50%的红细胞悬液,将H9N2禽流感病毒尿囊液(HA≤29)采用鸡红细胞吸附释放法进行纯化,然后分别将纯化的病毒液及弃去的上清进行血凝试验测定。结果表明,使用50%的鸡红细胞悬液基本能将病毒吸附完全,HA效价提高23倍。因此鸡红细胞吸附释放法是一种经济实用、操作简便,并有较高纯化效率的方法。     

免疫鸡群中分离的H9N2亚型禽流感病毒的分子特征研究

为研究浙江省禽流感病毒(AIV)的流行病学情况,本实验应用鸡胚传代方法从AIV疫苗免疫鸡群中表现典型呼吸症状的产蛋鸡体内分离1株H9N2亚型AIV A/Chicken/Jiande/01/2009(H9N2)。氨基酸序列分析显示,HA受体结合位点出现了人流感病毒结合位点226L,M基因出现S31N的突变。遗传进化分析显示,A/Chicken/Jiande/01/2009的M基因和PB2基因属于G1-Like谱系,HA基因、NA基因和NS基因属于Ck/BJ/1/94-Like分支,而NP基因、PA基因和PB1基因属于Ck/SH/F/98-Like谱系。这些资料表明,A/Chicken/Jiande/01/2009(H9N2)为一株重排病毒。     

禽流感病毒H9N2亚型HL株与H9亚型流行株抗原相关性及交互免疫的研究

禽流感病毒的基因结构的特殊性决定了该病毒的多变性。为了实时掌握H9N2亚型禽流感病毒的流行变异情况,本文研究了2001年从河南洛阳分离到的HL株H9N2亚型禽流感病毒与2005年以后从我国部分省份分离到的6株H9N2亚型禽流感毒株,就毒力、免疫原性和HA基因的变异等方面进行了比较,旨在为生产用毒种的选择提供理论依据。结果表明,HL株和2005年以后从其他几个省份分离的毒株有很好的免疫交叉保护性,能够对当前的流行毒株提供足够的抵抗力。     

鸭H9N2亚型禽流感病毒的研究进展

H9N2亚型禽流感病毒目前已经是世界范围内传播最为广泛的人兽共患病毒之一,其感染谱和传染源都在逐渐扩大,引起大众重视H9N2对公共卫生安全存在的潜在威胁。鸭H9N2病毒普遍认为是以水禽类—陆地禽类—人类的路径实现人的感染,H9N2可作为重组病毒的基因供体和其他类型的流感病毒基因进行重排重组具备感染人的能力。加强禽类饲养管理、做好养禽场的防病管理、加大对禽场工作人员宣传教育的力度可以有效的防控H9N2亚型禽流感病毒的传播,疫苗接种、建立准确又灵敏的检测方法是禽流感病毒防控工作的重要手段。     

猪伪狂犬病病毒基因缺失灭活疫苗（LA-A株）的最小免疫剂量和制品保存期的研究

本研究将伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)变异株(PRV AH02LA株)的gE基因缺失株(LA-A株)接种BHK-21细胞,经纯悬浮培养制备抗原,甲醛灭活后制备油乳剂灭活疫苗,并确定该灭活疫苗的最小免疫剂量和效力检验方法,以及在2~8℃保存期。结果显示:猪伪狂犬病病毒基因缺失灭活疫苗(LA-A株)的效力检验方法为以2.0 mL(抗原含量108.20TCID50)接种4~5周龄PRV阴性健康仔猪,颈部肌肉注射,间隔28 d以相同剂量和方法加强免疫,加强免疫后第21 d,免疫猪血清PRV抗体中和指数应不低于10000,攻毒保护率应不低于80%;最小免疫剂量为1.0 mL(抗原含量107.90 TCID50);制品保存期:在2~8℃保存期为18个月。该研究结果为新型疫苗的研制提供了重要的试验依据。     

重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型）对鸭和鹅的免疫效果观察

由H5N1亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）引起的高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza, HPAI）是禽类的一种烈性传染病,疫苗免疫是禽流感防控中的重要环节。本试验采用重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1,Re-5株）和重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（H5N1、Re-5株+Re-4株）进行了鸭和鹅的免疫试验,对免疫鸭和鹅的抗体水平进行了动态监测。试验结果表明,两种疫苗对鸭和鹅均具有良好的免疫效果。基于试验结果提出了鸭和鹅禽流感免疫程序：2 w左右首免,4~5 w时二免,开产前三免,此后每隔4~5个月加强免疫一次。     

H9亚型禽流感病毒基质蛋白M1单克隆抗体的制备与鉴定

本研究用纯化的H9N2亚型禽流感病毒免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。对杂交瘤细胞及时筛选,阳性孔经3次有限稀释法克隆,成功获得3株能稳定传代并分泌抗H9亚型禽流感病毒基质蛋白M1单克隆抗体的杂交瘤细胞：3G8、2F6、5F2。间接ELISA方法检测,3株单克隆抗体的腹水间接ELISA效价达106以上。构建了真核表达载体pCAGGS-M1并转染于MDCK细胞,以用于腹水的Western blot和间接免疫荧光鉴定。间接免疫荧光结果表明,3株单克隆抗体皆与真核表达蛋白M1反应。这些单克隆抗体的制备为后期研究M1蛋白在流感病毒复制与出芽过程中的重要生物学功能奠定了基础。     

H9N2亚型禽流感病毒荧光定量PCR方法的建立及初步应用

H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV）是我国主要流行的低致病性禽流感病毒亚型,因而对其进行病毒的监测与诊断显得极其重要。通过比对GenBank上H9亚型禽流感病毒HA基因序列,设计了一个特异性针对H9 AIV HA的探针。特异性和扩增曲线实验结果显示,该探针具有较好的扩增效率,且仅特异性识别H9亚型AIV。通过重组质粒pMD19-T-H9HA 10倍梯度稀释液为模板,进行荧光定量PCR。实验结果表明,本研究所建立的荧光定量PCR方法敏感性能达到100个DNA拷贝数,比传统PCR方法检测敏感性提高了1000倍。此外,本方法还能检测到10EID50个病毒,比传统PCR方法检测敏感性也提高了1000倍。通过批间和批内试验,结果表明,这两个试验的变异系数分别小于5%和1%,说明本研究的方法具有较好的重复性。此外,通过检测人工感染动物咽拭子,结果表明H9亚型AIV荧光定量PCR方法比传统PCR的方法检测敏感性提高了100倍。在临床样品的检测中,H9亚型AIV荧光定量PCR方法检测的阳性率比传统PCR法检测的阳性率提高了大约30%。综上所述,本研究所建立的H9N2亚型禽流感病毒荧光定量PCR方法具有较高的特异性、准确性和敏感性,对H9亚型禽流感疫情防控及其流行病学调查具有积极的科学意义。     

重组禽流感病毒(H5N2)的拯救及其生物学特性分析

为控制在我国流行的H5N1高致病性禽流感(Avian influenza virus,AIV)和筛选具有标记的疫苗毒株,用流行的H5N1亚型AIV的HA基因和H9N2亚型AIV的NA基因及H1N1亚型AIV(A/PR/8/34毒株)的6个内部基因通过流感8质粒反向遗传操作系统拯救了重组病毒rH5N2/PR8株。为了降低重组病毒的毒力,对H5N1亚型AIV的HA基因进行了修饰,使其裂解模式由PLRERRRKR↓GL修饰为PLIETR↓GL。将获得的rH5N2/PR8株在9日龄SPF鸡胚上连续传10代。该重组病毒的血凝效价稳定在1:2048,其半数感染量(EID50)可达10-8.77/0.1 mL。该病毒的毒力显著降低,对鸡胚的半数致死量(ELD50)为10-5/0.1 mL。将该病毒灭活与油佐剂乳化,制成灭活疫苗,给6周龄SFP鸡接种不同剂量,接种21 d后,用H5N1流行野毒A/Chicken/SD/2010(H5N1)攻击,结果显示:接种剂量为0.1 mL/只的试验组,10只鸡中有5只获得保护;接种0.3 mL/只的试验组可获得100%保护。以上说明,本实验获得的重组病毒具有疫苗标记、繁殖滴度高、毒力低、免疫原性好等特点,非常适合作为"标记疫苗"候选株,为AIV(H5N1)的标记疫苗研发奠定了坚实基础。     

猪源H9N2亚型流感病毒的分离鉴定和遗传进化分析

2008年10月~2009年3月采集剖检病死猪喉拭样品41份,从中分离鉴定了2株H9N2亚型猪流感病毒,对其进行部分生物学特性的研究、全基因测序和遗传演化分析,发现血凝素（hemagglutinin,HA）蛋白335~338的裂解位点上,A/Swine/Yangzhou/1/08为RSNR,A/Swine/Taizhou/5/08为RSSR,均为典型低致病性禽流感病毒的特征性序列。2株病毒的HA、神经氨酸酶（neuraminidase,NA）、核衣壳蛋白（nucleocapsid protein,NP）、非结构蛋白（nonstructural protein,NS）、血清前白蛋白（prealbumin,PA）和多聚酶蛋白（polymerase protein1,PB1）基因均来源于A/Chicken/Shanghai/F/98,基质蛋白（matrix,M）基因与A/Swine/Yangzhou/1/08的PB2基因来源于A/Quai/Hong Kong/G1/97,值得注意的是A/Swine/Taizhou/5/08的PB2基因虽然可能来源于A/Chicken/Shanghai/F/98但与A/environment/Hunan/1-35/2007（H5N1）的高度同源,生物学特性试验也表明A/Swine/Taizhou/5/08比A/Swine/Yangzhou/1/08毒力强。     

上海市三株H9N2鸭禽流感病毒全基因遗传进化分析

为了解上海市鸭群中H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）的遗传变异特征,以及与疫苗株A/Chicken/Shan dong/6/1996和A/Chicken/Shanghai/F/1998之间的遗传距离,对2007年和2009年分离自上海市鸭气管和泄殖腔样品采用荧光RT-PCR检测,将H9亚型禽流感病毒核酸阳性样品处理后,经鸡胚尿囊腔接种分离病毒,HI进一步确定血凝素（haemagglutin,HA）亚型,随后进行了全基因测序,并结合GenBank中的相关序列进行遗传进化分析。结果表明：3株分离毒株为H9N2亚型鸭禽流感病毒,HA蛋白裂解位点的氨基酸组成为PARSSRGLF,符合低致病性禽流感病毒特征,均属于经典的H9N2 Ck/Bei群系;NA基因均属于Y280系;NP、PA基因和A/Goose/Guangdong/1/1996（H5亚型）归为一群;PB2和M基因属于Qa/HK/G1/97系;NS基因仍为Ck/Bei系;2007年的分离株和2009年的分离株在PB1基因上分属不同亚群。3株病毒的HA1基因与疫苗株A/Chicken/Shandong/6/1996和A/Chicken/Shanghai/F/1998之间的遗传距离均大于7%。由此可见,3株鸭H9N2亚型毒株可能是由不同禽流感病毒基因亚群间发生自然重排的产物,现有疫苗对分离株的保护性需要进一步评估。     

2012年上海地区发病鸡群H9N2亚型禽流感病毒的变异分析

为了了解2012年分离自上海发病鸡群的H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus, AIS）的遗传变异特征,采集发病鸡群中病死鸡气管、肺、脑和肾脏等内脏,经实验室诊断为H9亚型禽流感病毒核酸阳性。将阳性样品处理后,经鸡胚尿囊腔接种分离病毒,HI进一步确定HA亚型,通过RT-PCR方法分别扩增了3个分离株的8个基因片段并进行了序列分析。3株分离株均为H9N2亚型禽流感病毒,与以往从上海地区健康鸡群中分离的4株H9N2毒株相比,本研究中的3株分离株由于HA基因220位的氨基酸发生了变异,缺失了HA上218~220位的一个潜在的糖基化位点,并且HA基因受体结合位点的左缘235位发生了变异。从HA基因抗原位点的分析表明,与疫苗株Ck/SD/6/96相比,这3株H9N2亚型禽流感病毒7个抗原位点中已有4个发生了改变。遗传发生关系表明这3株分离株均属于Ck/Bei/1/94系,与08年的分离株Ck/SH/Y1/088个基因片段所属基因型相同。2012年上海地区发病鸡群中分离的上述3株H9N2禽流感病毒基因序列已发生变异,是否导致其生物学特性发生改变以及目前使用的疫苗能否给禽群提供足够的保护力还需要作进一步的研究。     

血清2型鸭疫里默氏杆菌制苗用菌株的筛选及灭活油乳剂疫苗的研制

血清2型鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)分离株经雏鸭体内复壮、回收、鉴定后,选取其中2株细菌NJ3和Yb2进行毒力测定,结果表明其半数致死量分别为5.62×107CFU和1.07×105CFU。选取5株细菌制备灭活油乳剂疫苗后免疫鸭,并进行攻毒保护试验。结果表明不同菌株制备的疫苗均可使免疫鸭产生高水平的RA特异性ELISA抗体和攻毒保护力,但是攻毒保护性差异较大,NJ3免疫后的攻毒保护性最好。抗体检测及攻毒保护实验表明NJ-3是较理想的制苗用菌株。     

福建省鸭禽流感病毒分离株（A/Duck/Fujian/FQ107/2007〔H9N2〕）全基因测序及遗传进化分析

为了解一株可引起产蛋鸭产蛋异常的H9N2亚型禽流感病毒A/Duck/Fujian/FQ107/2007（H9N2）（以下简称Dk/FQ107/07）分离株的分子特性及其遗传进化地位,运用RT-PCR方法对其基因组进行扩增,克隆至pMD18-T载体后测序。结果显示,Dk/FQ107/07病毒株的血凝素（haemagglutini,HA）蛋白裂解位点的氨基酸组成为-PARSSR↓GLF-,其静脉接种指数（intravenous pathogenicity index,IVPI）为0.04,符合低致病性禽流感病毒特征;Dk/FQ107/07株HA基因与A/chicken/Shantou/5269/2005（H9N2）同源性最高,为98.9%,和我国首次哺乳动物流感病毒分离株A/Swine/HongKong/9/98（H9N2）有较近的遗传进化关系,三者均属于经典的H9N2/Y280群系;神经氨酸酶（neuraminidase,NA）基因与中国大陆首次分离株A/chicken/Beijing/1/1994（H9N2）相比,在63、64、65位点上缺失3个氨基酸（T、E、I）;核蛋白（nucleoprotein,NP）基因与高致病性鸭源禽流感分离株A/Duck/Fujian/1734/05（H5N1）和A/Duck/Fujian/9713/2005（H5N1）在同一遗传进化分支上,而从聚合酶（polymerase PA,PA）基因的遗传进化分析发现其基因属于H9N2/Y439群系。由此可见,Dk/FQ107/07可能是由不同禽流感病毒基因亚群间发生自然重排的产物。