猪细环病毒流行病学与遗传变异研究进展

猪细环病毒(PTTV)是近年来发现的一种新病毒,属于指环病毒科、ι指环病毒属成员。该病毒在世界范围内广泛存在,在患有断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的猪群中,PTTV的流行率明显高于健康猪群,怀疑该病毒与PCV-2等病原起协同致病作用,但仍没有找到合适的细胞系适于病毒的体外培养。论文主要围绕其流行病学和遗传变异情况进行了综述,简要介绍了该病毒的多种检测方法,这对进一步研究该病毒的分布和致病性及防控有重要意义。     

猪细环病毒检测方法研究进展

猪细环病毒（TTSuV）是近年来新发现的DNA病毒,在世界猪群中广泛存在,严重威胁着养猪业的发展,而且有潜在跨物种传播给人类的可能性,引起了养猪业的极大关注。通过综述TTSuV近年来检测方法研究进展,以期对科研工作者和广大养殖业主更好地防治该病提供参考。     

猪细环病毒LAMP检测方法的建立

为建立一种特异和快速的猪细环病毒(TTSuV)检测方法,本研究通过比对TTSuV的全基因序列,选择其保守区域,设计了针对TTSuV检测的LAMP引物,利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪对反应体系及条件进行了优化,建立TTSuV环介导等温扩增的检测方法.结果表明:该方法最佳反应条件为64℃恒温50 min,病毒的最低检出限为5.5拷贝/μL,并且与其他相关传染病无交叉反应.临床样品检测结果显示,猪繁殖与呼吸综合征病毒-(PRRSV)和2型猪圆环病毒(PCV2)阳性的样品中TTSuV呈高阳性率,分别为92％和87.3％,显著高于非PRRSV和PCV2阳性的猪群.该方法的建立为快速及特异性的检测猪TTSuV提供了有效的方法.     

猪细环病毒和猪圆环病毒2型混合感染状况的调查

为分析我国猪细环病毒(TTSuV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的共感染情况,利用所设计的TTSuV(TTSuV1、TTSuV2)和PCV2特异性引物对我国29个省市采集的猪群血清样品同时进行PCV2和TTSuV(TTSuV1、TTSuV2) PCR检测,分析混合感染情况.结果所检测的1898份样品中,TTSuV阳性为1103份(58％),PCV2阳性为435份(23％).阳性样品中呈混合感染的有275份(14％),其中TTSuV1和PCV2为249份(13％),TTSuV2和PCV2为200份(10％),均为阳性的有174份(9％).调查结果显示,我国猪群中TTSuV和PCV2混合感染现象较为普遍,对地区性分布特征和饲养模式等影响因素的分析表明TTSuV和PCV2混合感染情况存在地区性差异(P＜0.01),但饲养模式并不是共感染的关键因素.     

我国部分地区猪圆环病毒2型和猪细环病毒混合感染的调查

为了解猪圆环病毒2型(PCV-2)和猪细环病毒(TTV)混合感染情况,用PCR方法对来自湖南、江西、广东、福建和广西五省区的193份猪组织样品进行PCV-2、TTV-1和TTV-2进行检测。结果显示,PCV-2感染率为61.1%(118/193),PCV-2和TTV-1混合感染率为32.1%(62/193),PCV-2和TTV-2混合感染率为16.9%(32/193),3种病原混合感染率为9.8%(19/193),2006年PCV-2和TTV的混合感染率最高。由此可见,目前猪群中存在PCV-2和猪TTV的混合感染,PCV-2和TTV-1型混合感染率高于和TTV-2型的混合感染率,且存在一定比例的三重感染情况。     

对青岛地区4个猪场的猪细环病毒II型的分子流行病学调查

为了解青岛地区各猪场中猪细环病毒II型（TTV2）的存在和感染情况,本实验对2012年3月至5月期间采自青岛地区4个猪场的59份猪血清样品利用病毒核酸提取试剂盒进行了猪细环病毒DNA提取,在此基础上利用TTv2的特异性引物进行PCR检测。结果显示只有莱西1个猪场的血清样品中检测到阳性,阳性率为13．8％,并且存在TTV1与TTV2混合感染的情况,混合感染率为6．9％。本实验结果证实某些猪场中存在猪细环病毒感染,由于TTV在猪的多系统衰竭综合征的病症发展中可能扮演一定角色,所以了解TTV在猪场中的存在状况具有重要意义。     

猪细环病毒数字PCR定量检测方法的建立

[目的]实现猪细环病毒(TTSuV)的准确定量检测。[方法 ]根据TTSuV的序列特点,设计特异性引物、探针,建立数字PCR检测技术。对数字PCR反应体系中的引物和探针浓度进行优化,分析方法的灵敏度、特异性,并初步应用于进行临床检测。[结果 ]最终确定TTSuV1a和TTSuV1b数字PCR反应体系中最佳引物浓度均为250 nmol/L,最佳探针浓度均为300 nmol/L,TTSuV1a型和TTSuV1b型灵敏度均可达到单个拷贝数;以猪圆环病毒Ⅱ型、猪细小病毒和猪伪狂犬病毒进行特异性试验,结果无交叉反应;批内和批间试验表明,该方法的重复性良好;本实验室留存的92份血清样本的检测结果与其背景信息一致。[结论 ]本研究建立的TTSuV数字PCR法具有特异性强、灵敏度高、检测限低等优点,可用于TTSuV的定量检测。     

猪细环病毒PCR-DHPLC检测技术的建立及应用

为了应用PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术检测猪细环病毒1型和2型,根据猪细环病毒的序列特点设计特异性引物,PCR扩增产物经DHPLC技术进行快速检测。选择猪细小病毒、猪圆环病毒Ⅱ型和猪伪狂犬病毒进行特异性试验,无交叉反应。该检测方法具有较好的特异性和重复性;用质粒标准品进行TTSuV1和TTSuV2的PCR-DHPLC检测,灵敏度可达1.0×101拷贝·μL-1。对80份血清样本分别应用实时荧光PCR法、PCR-凝胶电泳法及本文所建立的PCR-DHPLC法与进行检测,发现TTSuV1有63份PCR-DHPLC阳性,63份实时荧光PCR阳性,54份PCR-凝胶电泳阳性;TTSuV2有69份PCR-DHPLC阳性,69份实时荧光PCR阳性,56份PCR-凝胶电泳阳性。本试验建立的PCR-DHPLC法具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于TTSuV感染的分子流行病学调查。     

两株猪细环病毒的全基因组序列分析

为了研究猪细环病毒(Torque teno sus virus, TTSuV)的流行及遗传变异情况,试验采用PCR方法对从河南省南阳市某规模化养猪场采集的疑似TTSuV阳性猪的淋巴结、肺脏、血清等样品进行检测,并对TTSuV1阳性样品进行全基因组序列测定、同源性分析、遗传进化分析和基因重组分析。结果表明：试验成功从样品中鉴定出2株TTSuV1毒株,其全基因组序列长度分别为2 906,2 920 bp,分别命名为HeN1-A9株和HeN1-A11株。两毒株与GenBank中TTSuV1型参考毒株的同源性为68.8%～96.0%,与GenBank中TTSuVk2型参考毒株同源性为46.8%～47.6%,两毒株之间的同源性为86.4%。基于TTSuV1全基因组序列构建的遗传进化树分析,两毒株均属于TTSuV1c亚型;而基于TTSuV1第3段基因组序列构建的遗传进化树分析,两毒株均属于TTSuV1b亚型。两毒株均是重组毒株,以西班牙的G21株(GU570201)为亲本毒株,我国的LNJZ株(KT968712)提供重组片段,重组位点分别位于基因组2 195～2 530 bp和2 147～2 65...     

猪细环病毒2型环介导等温扩增检测方法的建立

为了能快速、特异的检测猪细环病毒2型(TTSuV2),本研究针对TTSuV2全基因序列的非编码区域和第1个开放性阅读框前端设计了2对引物,建立了TTSuV2的环介导等温扩增(LAMP)检测方法并对反应成分和条件进行了梯度摸索。试验结果显示,该LAMP检测方法最佳反应条件为64 ℃恒温90 min,可特异性检测TTSuV2,与猪细环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪博卡病毒无交叉反应,病毒最低检出限为100拷贝/μL。结果表明,建立的LAMP方法具有快速、特异且灵敏的特点,可在TTSuV2快速检测方面提供一定的技术支持。     

Cloning and Sequence Analysis of ORF1 Gene of Porcine Torque Teno sus Virus Type 1a

In order to know the ORF1 gene of the Fujian isolates of porcine Torque teno sus virus (PTTSuV) type 1a,the study amplified the ORF1 gene of PTTSuV type 1a from the DNA isolated in the feces with diarrhea in Fujian province.The target PCR fragments were cloned and sequenced,and spliced with SeqMan software.The results showed that the cloned ORF1 gene of PTTSuV type 1a was 1 947 bp in length,coding an open reading frame (ORF) with 648 amino acids,its theoretical isoelectric point was 10.06.The nucleotide sequence and the amino acid sequence deduced from the gene were analyzed by the bioinformatics software.Compared with the PTTSuV type 1a ORF1 gene from GenBank,the sequenced gene shared the highest homology with TTV1 Bj2-1 strain (GenBank accession number:HM633243) at 99.7%.The phylogenetic tree was constructed with Mega 6.06,the PTTSuV type 1a could be divided into 2 different phylogenetic clusters (clusterⅠ and cluster Ⅱ),the cluster Ⅰ also had two distinguish branch (Ⅰa and Ⅰb).The results of this study could enrich the genomic characterization of PTTSuV type 1a in Fujian.     

猪细环病毒1a型ORF1基因的克隆与序列分析

为明确猪细环病毒(porcine Torque teno sus virus,PTTSuV)1a型福建株ORF1基因的特征,本研究采用分段扩增的办法从PTTSuV 1a型感染阳性粪便中扩增PTTSuV 1a型福建株ORF1基因,对PCR扩增产物胶回收克隆测序后利用SeqMan软件拼接出完整的PTTSuV 1a型福建株ORF1基因,通过分子生物学软件对其编码蛋白进行生物信息学分析。结果表明,PTTSuV 1a型福建株ORF1基因全长为1 947 bp,编码648个氨基酸,其理论等电点为10.06。核苷酸同源性比对结果表明,本试验PTTSuV 1a型福建株ORF1基因和PTTSuV 1a型TTV1 Bj2-1株(GenBank登录号:HM633243)同源性最高,达99.7%。利用Mega 6.06绘制其遗传进化树,可见PTTSuV 1a型ORF1基因在遗传进化上呈两个大的遗传进化分支(分支Ⅰ和分支Ⅱ),分支Ⅰ又可分为两个小的分支(Ⅰa和Ⅰb),本研究为丰富福建源PTTSuV 1a型分子流行病学数据库奠定基础。     

猪细环病毒1b型ORF3基因克隆及序列分析

为明确福建省猪细环病毒（porcine torque teno sus virus,PTTSuV）1b型（PTTSuV-1b）ORF3基因的遗传进化特征,本研究根据GenBank中登录的PTTSuV-1b基因组特征设计特异性引物,对福建省某猪场患有仔猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的猪血清进行PTTSuV-1b分段扩增,并分别对PCR扩增产物进行胶回收后克隆测序,将测序结果经BLAST分析后进行序列拼接。试验结果表明,所扩增的目的片段编码有完整的PTTSuV-1b ORF3蛋白,全长为600 bp,编码有199个氨基酸。将获得的PTTSuV-1b型福建株与GenBank中PTTSuV-1b型的ORF3基因进行比对分析,其与FJ/China/2010/TTV2/2株核苷酸同源性最高,为99.7%,与西班牙PTTSuV-1b分离株TTV2_G43核苷酸同源性为97.3%,与SC株核苷酸同源性稍低,但也达94.0%;而与猪细环病毒K2型德国家猪分离株472142株核苷酸同源性仅为60.7%,与猪细环病毒1a型西班牙分离株PTTV1_1914株核苷酸同源性仅为46.8%。从遗传进化关系上看,PTTSuV-1b ORF3基因在遗传进化上呈2个大的遗传进化分支（分支Ⅰ和分支Ⅱ）,本研究分离株处于分支Ⅰ。     

Development of Loop-mediated Isothermal Amplification Assay for Detection of Torque teno sus Virus Type 2

In order to develop a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for rapid and specific detection of Torque teno sus virus type 2 (TTSuV2), two pairs of primers were designed according to the untranslated regions and the part of open reading frame 1 of TTSuV2.The LAMP system was optimized by adjusting the concentrations of some components and reaction conditions.The optimized amplification conditions of LAMP assay was at 64 ℃ for 90 min.The results showed the LAMP assay was specific for TTSuV2 detection, which could achieve a detection limit of 100 copies/μL viral nucleic acid, and no cross-reaction with TTSuV1, PCV2, CSFV, PRRSV and PBoV.In conclusion, this assay was a rapid, specific and sensitive detection technique which could provide a assistance for the rapid detection of TTSuV2.     

Molecular detection of Torque teno sus virus in lymphoid tissues in concomitant infections with other porcine viral pathogens

In this study, 40 pigs with respiratory and wasting disorders from Cuban swine herds were screened by PCR for the presence of TTSuV1, TTSuV2, PCV-2, PPV and CSFV in spleen samples. The variability of the porcine TTSuV sequences obtained was investigated by phylogenetic analysis. This study showed for the first time that TTSuV1 and TTSuV2 were present in Cuban swine herds. The investigation revealed the following infection rates: TTSuV1 40%, TTSuV2 37.5%, PCV-2 70%, PPV 37.5% and CSFV in 52.5%. The presence of two or more of these viruses at different rates in the same spleen samples was revealed. Also, a higher genetic diversity of TTSuV2 sequences was observed regarding TTSuV1 sequences.