浙江省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的遗传变异分析

为了解2004-2009年猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) ORF5基因的变异情况,从浙江省各个地区采集了109份临床疑似病料,共检测到61份ORF5基因阳性,经序列测定得到可比序列11 7个.在核苷酸序列分析中,发现2004-2005年PRRSV ORF5序列之间同源性为83.6％～99.3％,2006年同源性最高达98.3～99.2％,2008-2009年同源性又有所降低.在氨基酸主要位点分析中,分离毒株的非中和表位27～～30位点与美洲株相比,2004-2006年大部分毒株的29 aa由A29-V29,而2007-2009年大部分毒株的29 aa又由V29-A29;在表位37～45 aa中,所有39位点处由L39”一I39;在表位80～197 aa中,从2004-2009年185 aa大部分都发生了变异,由V185-A185,第189位点由I189-L189.在蛋白生化特性分析中,发现与参考株VR2332 (AY150564)和CH la(AY032626)相比,浙江省PRRSV-GP5蛋白的第100～106位亲水性、表面可及性明显增加,抗原性指数也有所提高,而与参考毒株JX-06-2-EU480750相似.该试验结果说明随着时间的推移,PRRSV ORF5基因发生明显的变异.     

浙江省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的遗传变异分析

为了解2014-2016年浙江地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）ORF5基因变异情况,试验通过RT-PCR方法对从浙江省各地区采集的PRRSV阳性病料进行ORF5基因扩增,应用DNAStar和Mega 5.1软件对所测序列进行同源性和遗传变异分析。结果显示,54株2014-2016年浙江分离株ORF5序列之间核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.1%~100%和80.6%~100%,与经典株VR2332核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.8%~90.4%和81.6%~90.0%,与高致病PRRSV毒株JXA1核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.5%~99.5%和83.1%~99.0%。系统进化分析表明,54个毒株均为美洲型毒株,属于Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ 3个不同的基因亚型,其中基因亚型Ⅲ和Ⅳ毒株是浙江省近年来新出现的毒株。氨基酸序列分析结果显示,54个毒株在GP5蛋白的信号肽区域、非中和抗体表位的氨基酸序列变异较大,而在中和表位氨基酸序列变异较小。本研究结果表明,浙江地区PRRSV流行出现了新形势,多种基因亚型共同存在,其中以基因亚型Ⅰ毒株为主。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的变异及其基因工程疫苗研究进展

ORF5基因编码的E蛋白是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的主要结构蛋白,糖基化的囊膜蛋白E蛋白具有良好的免疫原性,能够代替PRRSV诱导机体产生免疫应答,产生保护性中和抗体,是研发基因工程疫苗的优良候选基因之一,在防控PRRS方面有着重要的意义。目前PRRS的流行毒株存在着广泛的变异,尤其是稳定性较差的ORF5基因的变异给PRRSV的检测和防控带来很大的困难。本文就国内外学者对ORF5基因的变异情况以及基于PRRSV ORF5基因在基因工程疫苗方面的研究进展作了综述。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因变异分析

采用RT-PCR方法对不同省份疑似PRRS阳性病料进行克隆和测序,获得14个ORF5基因片段.序列分析结果表明,获得的14个ORF5基因序列不存在缺失现象,核苷酸的同源性为98.8%～99.7%,推导编码氨基酸同源性为96.5%～99%.与国内毒株相比,核苷酸同源性为85.2%～100%,氨基酸同源性为84.6%～99%;与中国代表毒株CH-1a、美洲型代表毒株VR-2332的核苷酸序列同源性分别在94.4%～95.2%和86.7%～87.9%之间,与疫苗株MLV的同源性在86.4%～87.6%之间,而与欧洲型代表株LV的同源性在54.1%～55.7%之间,推导编码的氨基酸序列同源性则分别在91.5%～93.5%、86.6%～88.6%、85.6%～87.6%、54.7%～56.2%之间.表明所获得序列的流行毒株均属于美洲型.进一步分析发现与近期国内流行的高致病性猪蓝耳病病毒同源性非常之高,说明这些毒株可能均起源于同一个毒株,通过猪的运输流通等在全国流行.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒柳州地方株NSP2和ORF5基因变异分析

为了给广西柳州预防和控制猪繁殖与呼吸综合症提供理论数据,本研究对利用RT-PCR方法扩增了该地区流行株LZ5和LZ6的NSP2和ORF5基因并进行测序分析,然后与GenBank中已发表的PRRSV毒株的NSP2和ORF5基因序列进行比较。结果显示,2株柳州地方流行株均属于美洲型,在NSP2基因第483位和535~563位氨基酸均存在30个氨基酸的不连续缺失,其NSP2和ORF5基因的核苷酸同源性分别为99.5%和99.7%,推导的氨基酸同源性分别为100%和99.5%;与近几年国内流行的高致病性蓝耳病代表性毒株之间的NSP2、ORF5基因核苷酸同源性分别为94.7%~96.2%和97.2%~98.0%,其推导的氨基酸同源性分别为92.0%~95.5%和94.5%~97.0%。序列分析结果表明此次柳州流行的PRRSV与2006年夏高热病引起的基因序列高度同源,在基因序列上并未显示出新的特性,在国内也缺乏明显的地域性差异。     

tPA信号肽和猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因原核表达载体的构建

根据GenBank（序列号E00896）上公布的人组织型纤溶酶原激活因子（tissue plasminogen activator,tPA）的序列,利用在线信号肽分析工具Signal P3.0 Server预测出人tPA的信号肽共有63 bp,设计1对能互为模板直接进行扩增的特异性引物,通过重叠PCR的方法扩增出tPA信号肽。另设计1对连接引物,利用PCR方法将tPA信号肽与已删除自身信号肽的ORF5基因相连,成功构建了用tPA信号肽取代猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因原有信号肽的原核表达质粒,为下一步GP5蛋白分泌表达及猪繁殖与呼吸综合征疫苗开发、诊断试剂盒的研制与应用奠定基础。     

河北猪繁殖与呼吸综合征病毒地方株HB-3（cz）株ORF5基因变异分析

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiration Syndrome,PRRS）是近年来新发现的由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种猪传染病。PRRSV属套式病毒目动脉炎病毒科成员,基因组全长约15kb,为单股正链RNA病毒,含9个开放阅读框（ORF）,其中ORF5编码病毒糖基化囊膜蛋白（E蛋白）,E蛋白为PRRSV3个主要结构蛋白之一,参与体液免疫和细胞免疫,具有较高的免疫原性和中和活性。不同国家和地区分离株的ORF5基因差异较大。PRRSV有2种基因型,     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5和Nsp2基因变异分析

采用RT-PCR方法对2006-2007年华南地区部分省份的疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)阳性病料进行克隆和测序,获得13个Nsp2基因的部分序列片段和14个ORF5基因片段。序列分析结果表明,所获得的13个Nsp2基因序列中均有2个区域存在明显缺失,核苷酸的同源性为96.9%～99.1%,与中国代表毒株CH-1a、美洲株代表毒株VR-2332的核苷酸序列同源性分别为85.1%～86.4%和67.2%～68.9%,与疫苗株MLV的同源性在67.6%～68.9%之间,而与欧洲株代表株LV的同源性在54.1%～55.9%之间;获得的14个ORF5基因序列不存在缺失现象,核苷酸的相似性为同源性为98.8%～99.7%,推导编码氨基酸同源性为96.5%～99%。与国内毒株相比,核苷酸同源性为85.2%～100%,氨基酸同源性为84.6%～99%;与中国代表毒株CH-1a、美洲型代表毒株VR-2332的核苷酸序列同源性分别在94.4%～95.2%和86.7%～87.9%之间,与疫苗株MLV的同源性在86.4%～87.6%之间,而与欧洲型代表株LV的同源性在54.1%～55.7%之间,推导编码的氨基酸序列同源性则分别在91.5%～93.5%,86.6%～88.6%,85.6%～87.6%,54.7%～56.2%之间。结果表明所获得序列的流行毒株均属于美洲型,进一步分析发现这些毒株可能均起源于同一个毒株,通过猪运输流通等途径在全国范围流行扩散。     

2016-2017年江西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及ORF5基因变异分析

为了解近年来江西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）分子流行病学和其遗传变异情况,本次调查于2016-2017年从江西省各地区规模化猪场采集453份疑似猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的病料,采用RT-PCR方法对所有病料进行检测。结果发现,其中321份病料为PRRSV阳性,阳性率为70.86%,各地区的阳性率在19.15%~84.85%之间。挑选14份阳性样品测序后,经ORF5基因序列分析,江西地区各PRRSV毒株ORF5基因的核苷酸同源性为83%~100%,PRRSV流行毒株与参考毒株的同源性在59.9%~98.5%之间。基于ORF5基因的进化树分析表明,14个测序毒株均为美洲型毒株,其中有4株为基因亚型Ⅰ,即高致病性毒株（HP-PRRSV）;3株为基因亚型Ⅱ,即经典毒株;3株为基因亚型Ⅲ,即NADC30-like毒株;4株为新出现的基因亚型Ⅳ。氨基酸序列比对分析表明,基因亚型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ毒株ORF5基因编码的GP5蛋白氨基酸在3个表位及2个重要的抗原相关区域存在较大变异,其中以NADC30毒株为代表的基因亚型Ⅲ毒株和以GD1404毒株为代表的基因亚型Ⅳ毒株均表现出独有的氨基酸变异,这些变异可能会影响GP5蛋白的免疫原性。本次调查结果表明,2016-2017年江西地区PRRSV流行出现了新形势,美洲型毒株出现了多基因亚型共同存在的局面,以高致病性毒株（HP-PRRSV）为主,NADC30-like毒株和新基因亚型等新毒株的比例较高,同时还存在经典毒株;持续实时监测PRRSV的毒株流行和变异情况,可为临床诊断、药物和疫苗开发及PRRS的科学防控提供依据。     

山东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子特征

为揭示2009～2010年山东地区流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的分子特征,通过RT-PCR扩增采自山东地区不同猪场病猪组织样本中PRRSV的Nsp2、ORF5、ORF6、ORF7序列,用DNAStar软件分析所测序列,并与北美洲型VR-2332株、欧洲型LV株及国内分离株进行核苷酸和推导的氨基酸同源性比较...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆与原核表达

通过PCR方法从重组质粒扩增得到猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)结构蛋白ORF5基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a,得到重组表达载体pET-32a-GP5,转化大肠埃希菌BL21.用不同浓度的IPTG分别于37 ℃诱导.经SDS-PAGE分析,所表达的融合蛋白分子量约为31.4 ku;薄层扫描分析显示,表达量占菌体总蛋白含量的28.8%.重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别,可用于PRRSV的检测.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离及ORF5基因的序列分析

采集菏泽地区某猪场PRRS疑似病料,在Marc-145细胞上进行病毒分离,得到一株病毒HZ0622,通过免疫荧光试验初步鉴定分离病毒为PRRSV。对ORF5基因进行克隆和测序,并利用DNAStar软件将测定序列与国内外代表性毒株进行同源性比较,结果表明：分离株HZ0622 ORF5基因与美洲型代表毒株VR-2332的同源性为89.55%,与LV株同源性为61.17%,与中国高致病性PRRSV毒株JXA1、HEB1、SY0608、SD-4的同源性分别为98.84%、98.34%、99.00%、99.34%;进化树分析结果表明,分离株HZ0622和高致病性PRRSV在同一进化分支,且与2007年分离的SD-4有更近的亲缘关系。HZ0622分离株属于美洲型毒株,可能属于高致病性PRRSV。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒湖南分离株ORF5基因的遗传进化分析

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）在湖南省地方猪保种场的感染情况,本研究在2019－2020年间从湖南省2个地方猪保种场采集287份全血样品。首先将血样混合成41份,采用RT-PCR或PCR法进行PRRSV病原检测,进一步通过高保真PCR扩增从PRRSV阳性样品中扩增PRRSV ORF5基因;测序后利用DNAStar软件分析获得的ORF5基因及其编码的GP5氨基酸与国内外不同PRRSV毒株的遗传进化关系;最后用PRRSV阳性血清接种Marc-145细胞,经盲传分离毒株,并用Reed-Muench法测定病毒滴度。结果显示,检测的41份混样中有3份PRRSV病原核酸呈阳性;从PRRSV阳性混样中单独扩增获得6条PRRSV ORF5基因序列,均属于PRRSV-2型的lineage 8分支,相似性为99.2%~99.8%;6条ORF5基因编码的GP5蛋白氨基酸序列在信号肽区域（第23位）、潜在的N-糖基化位点（第33位）和表位C （第59位）存在差异;PRRSV阳性血清接种Marc-145细胞盲传5代后出现明显的细胞病变,获得1株PRRSV毒株,命名为NX-1,病毒TCID₅₀为4×10⁵/mL。本研究表明,湖南省地方猪保种场存在PRRSV感染,感染的PRRSV属于PRRSV-2型的lineage 8,其GP5氨基酸序列存在的多处变异可能是造成疫苗免疫失败的原因之一,以上结果可为湖南省地方猪保种场的免疫防控提供一定参考。     

PRRSV分离株Nsp2基因和ORF5基因的遗传变异分析

为了解山东省PRRSV流行毒株的遗传变异情况和分子流行病学背景,对2007~2009年分离到的14株山东省内的PRRSV流行毒株进行了Nsp2和ORF5基因序列的测定和分析。结果显示,与参考毒株JXA1相比,14株PRRSV Nsp2与ORF5基因的核苷酸同源性分别达到96.1%~99.8%和98.0%~99.8%,氨基酸序列同源性分别达到92.9%~100%和97.5%~99.5%。序列分析结果表明,14株毒株在Nsp2蛋白内部均存在编码30个氨基酸的碱基对的不连续缺失;ORF5基因编码的GP5蛋白不存在缺失,但存在点突变。遗传进化分析表明,07年分离毒株JQ与参考毒株JXA1亲缘关系很近;09年分离的12株PRRSV,2株仍与国内2006~2007年间的分离株在同一分支,9株已经处在不同分支,1株单独处在一个分支。2007~2009年山东地区流行的PRRSV分离株具有年度特征,无明显的地域特征。     

修饰的ORF5基因增强猪繁殖与呼吸综合征DNA疫苗的体液免疫

为了提高猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因DNA疫苗的免疫效力，将通用型辅助性T淋巴细胞表位(PADRE)插入ORF5的中和表位和覆盖表位间，获得修饰后的ORF5基因ORF5M。在此基础上，进一步构建了ORF5M的真核表达质粒pCl-52M。间接免疫荧光证实体外表达后，免疫BALB／c小鼠，检测免疫后的ELISA抗体和中和抗体，并与未经修饰的ORF5基因真核表达质粒pCl-52进行比较。结果表明，修饰后的DNA疫苗pCl-52M诱导的ELISA抗体和中和抗体均明显优于未经修饰的DNA疫苗pCl-52，是一种具有良好开发前景的PRRS新型疫苗。     

2018年四川地区猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的分子流行病学调查研究

为研究四川地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的流行及进化趋势,本研究以GP5蛋白为研究对象,对2018年间收集的378份四川省不同区市县PRRSV疑似病料进行了实时荧光定量PCR检测,并对部分毒株ORF5基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行进化分析和N-糖基化位点预测。通过疑似病料实时荧光定量PCR检测,共检出阳性样品69份,阳性率为18.25%。对其中23株PRRSV的ORF5基因序列分析结果显示,ORF5基因之间核苷酸同源性为81.6%~100%,推导的氨基酸同源性为81.4%~100%,均属于美洲型毒株。其中,1株属于以经典毒株VR2332为代表的亚型Ⅰ,17株属于以高致病毒株JXA1为代表的亚型Ⅱ,5株属于重组毒株NADC30为代表的亚型Ⅲ,说明2018年间四川省PRRSV流行毒株存在基因多样性,HP-PRRSV依然是主要流行毒株,但仍存在不断进化的经典毒株,同时,类似NADC30和QYYZ的重组毒株也开始出现。通过氨基酸突变位点和N-糖基化位点分析发现,23株PRRSV在GP5两个重要抗原表位相关区域和毒力相关位点均发生了一定程度的突变,推测这些突变可能影响了病毒逃避机体免疫和病毒毒力,提示在PRRSV防控中,应该加强遗传进化分析,根据不同类型的毒株选择有针对性的疫苗和防控策略。     

猪繁殖和呼吸综合症山东分离株ORF7基因的克隆、测序及鉴定

山东某些养殖场发生以母猪流产或产死胎、木乃伊等为特症的流行性繁殖障碍病,怀疑为猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)所致。自行设计了一对针对PRRSV的N基因的特异性引物P1和P2,通过RT-PCR技术对分别从潍坊和济南收集到的可疑病料进行检测,结果为阳性,并得到1条366bp的DNA片段。纯化此扩增产物,然后与PMD-18T载体连接,转化大肠杆菌DH5α。结果得到了1个ORF7基因与PMD-18T载体的重组质粒PMD-18T- ORF7。通过EcoRI/BamHI双酶切及PCR证明此重组质粒即为ORF7基因与PMD-18T载体的重组质粒,从而为ORF7基因及其表达的核表壳蛋白进一步研究奠定了基础。     

猪繁殖和呼吸综合症山东分离株ORF7基因的克隆、测序及鉴定

山东某些养殖场发生以母猪流产或产死胎、木乃伊等为特症的流行性繁殖障碍病,怀疑为猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)所致.自行设计了一对针对PRRSV的N基因的特异性引物P1和P2,通过RT-PCR技术对分别从潍坊和济南收集到的可疑病料进行检测,结果为阳性,并得到1条366bp的DNA片段.纯化此扩增产物,然后与PMD-18T载体连接,转化大肠杆菌DH5α.结果得到了1个ORF7基因与PMD-18T载体的重组质粒PMD-18T-ORF7.通过EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切及PCR证明此重组质粒即为ORF7基因与PMD-18T载体的重组质粒,从而为ORF7基因及其表达的核衣壳蛋白进一步研究奠定了基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒山西分离株ORF5基因的序列分析

采用RT-PCR方法对2009—2011年山西省疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)阳性病料进行克隆和测序,获得5个ORF5基因片段,并对其基因序列和推导的氨基酸序列与国内外毒株进行了同源性分析。序列分析结果表明,5个ORF5基因序列之间核苷酸同源性为97.7%～98.5%,与欧洲型代表株LV、美洲型代表株VR-2332、2006—2007年国内分离的PRRSV变异株(JXA1、HuN、HUN4、HUB1)、2006年以前中国分离毒株(CH-1a、HB-1(sh)、HB-2(sh))和2个疫苗株(Resp PRRS MLV、MLV RespPRRS/Repro)核苷酸同源性分别为63.5%～64.0%、88.7%～89.2%、97.7%～99.3%、88.1%～96.7%和88.6%～89.1%;氨基酸同源性分别为56.1%～56.6%、87.8%～88.8%、96.6%～98.5%、85.9%～93.2%、86.8%～87.9%。结果表明山西地区的PRRSV流行毒株均属于美洲型,且毒株同源性很高,亲缘关系紧密。