牛γ-干扰素在昆虫细胞中的高效表达

应用RT-PCR技术从经植物血凝素(PHA)刺激诱导的奶牛脾脏淋巴细胞总RNA中扩增出牛-γ干扰素基因(bovine interferon-γ,BovIFN-γ)cDNA,并克隆到pGEM-T easy载体中,经过限制性酶切分析和测序证实,所克隆到的基因编码区序列与已报道的序列完全一致.将含信号肽的BoIFN-γ基因整个编码区cDNA亚克隆到杆状病毒转座载体pFastBac Ⅰ中,构建了转移载体pFastBac 1-BoIFN-γ,转座到宿主菌DH10 Bac中,在含庆大霉素、四环素、卡那霉素、IPTG和X-gal的KGTIX LB平板上筛选白色菌落,提取DNA获得重组穿梭载体Bacmid-BoIFN-γ质粒,与脂质体共转染Sf9细胞,产生有感染力的重组杆状病毒reBac-BoIFN-γ.重组病毒经过传代扩增感染Sf9细胞,通过IFA试验、Western-blot和抗病毒活性测定证实,BoIFN-γ基因在感染的昆虫细胞和上清中得到了表达,上清中活性可达2.651×105U/mL.表达条件优化结果表明,不同MOI对rBoIFN-γ的表达产量影响不大,上清中干扰素活性在感染后5 d达到高峰.     

牛-干扰素在昆虫细胞中的高效表达

应用RT-PCR技术从经植物血凝素(PHA)刺激诱导的奶牛脾脏淋巴细胞总RNA中扩增出牛-γ干扰素基因(bovine interferon-γ,BovIFN-γ)cDNA,并克隆到pGEM-T easy载体中,经过限制性酶切分析和测序证实,所克隆到的基因编码区序列与已报道的序列完全一致。将含信号肽的BoIFN-γ基因整个编码区cDNA亚克隆到杆状病毒转座载体pFastBac中,构建了转移载体pFastBac-BoIFN-γ,转座到宿主菌DH10Bac中,在含庆大霉素、四环素、卡那霉素、IPTG和X-gal的KGTIX LB平板上筛选白色菌落,提取DNA获得重组穿梭载体Bacmid-BoIFN-γ质粒,与脂质体共转染Sf9细胞,产生有感染力的重组杆状病毒reBac-BoIFN-γ。重组病毒经过传代扩增感染Sf9细胞,通过IFA试验、Western-blot和抗病毒活性测定证实,BoIFN-γ基因在感染的昆虫细胞和上清中得到了表达,上清中活性可达2.651×105U/mL。表达条件优化结果表明,不同MOI对rBoIFN-γ的表达产量影响不大,上清中干扰素活性在感染后5d达到高峰。     

鸡γ-干扰素在重组杆状病毒中的表达及抗病毒活性的测定

本研究构建了表达鸡-γ-干扰素（Chicken interferon-γ，ChIFN-γ）的重组杆状病毒rBac-ChIFN-γ。采用鼠抗ChIFN-γ免疫血清作为一抗进行间接免疫荧光（1FA）及间接ELISA检测，表明ChIFN-γ在重组杆状病毒rBac-ChIFN-γ感染的昆虫细胞中获得表达。细胞病变抑制法测定重组ChIFN-γ抗病毒活性试验显示，重组杆状病毒表达ChIFN-γ能有效抑制水疱性口炎病毒（VSV）在鸡胚成纤维细胞（CEF）上的复制。而且其抗病毒活性可以被鼠抗ChIFN-γ免疫血清阻断。试验结果表明，重组杆状病毒能良好表达ChIFN-γ，并具有高效抗病毒活性。     

牛γ干扰素在CHO细胞中的表达和鉴定

为获得高活性的牛γ干扰素(BoIFN-γ),依据GenBank中已发表的BoIFN-γ基因序列(M29867)进行人工合成,应用PCR方法扩增该基因,将其插入pIRESneo构建真核表达质粒,转染到CHO细胞中,用SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白的表达,并用牛γ干扰素检测试剂盒鉴定其反应原性.结果:成功的构建了pIRES-BoIFN-γ真核表达载体,实现了其在CHO细胞上的表达.表达产物经γ-干扰素检测试剂盒检测具有良好的反应原性,为研究BoIFN-γ结构与生物学功能以及建立牛结核BoIFN-γ检测法奠定了基础.     

利用家蚕杆状病毒表达系统表达牛α干扰素和λ1干扰素

牛干扰素可用于对各种类型牛传染性疾病的预防和治疗。利用家蚕杆状病毒表达系统表达牛α干扰素(BoIFN-α)及牛λ1干扰素(BoIFN-λ1)。首先对BoIFN-α和BoIFN-λ1的编码基因序列进行优化合成,优化合成的BoIFN-α和BoIFN-λ1基因的密码子适应指数(CAI)值提高,更适合在家蚕中表达,且翻译后的氨基酸序列与原始氨基酸序列完全一致。将优化合成的2个基因序列分别克隆至杆状病毒转移载体pVL1393,与缺失了orf1629的亲本杆状病毒BmBacmid共转染Bm N细胞,通过同源重组将BoIFN-α和BoIFN-λ1基因插入到杆状病毒多角体蛋白基因启动子下游,获得重组病毒rBmBac-BoIFN-α和rBmBac-BoIFN-λ1。用纯化的重组病毒感染家蚕5龄幼虫融合表达BoIFN-α和BoIFN-λ1干扰素,并通过PCR鉴定了2个目标蛋白基因在蚕体内的复制。采用微量细胞病变抑制法在Vero/VSV*GFP表达系统检测蚕体中表达重组BoIFN-α的效价可达1.0×10~6U/mL左右,重组BoIFN-λ1的效价可达5.01×10~4U/m L左右。试验结果提示,利用家蚕杆状病毒表达系统在蚕体内表达牛α干扰素及牛λ1干扰素是生产牛干扰素制剂更加廉价而高效的途径。     

牛干扰素-γ基因的克隆、序列分析及表达研究

为了使干扰素-γ(interferon γ,IFN-γ)在牛结核等疾病的诊断和防制方面取得更有效的应用,试验采用RT-PCR法从云南本地黄牛外周血淋巴细胞总RNA中扩增牛IFN-γ(BoIFN-γ)基因,测序并进行序列分析;然后亚克隆至pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。序列分析结果表明,克隆的IFN-γ基因与GenBank中荷斯坦牛IFN-γ序列同源性达99.60%。表达产物经SDS-PAGE分析,在大小约23 ku处可见目的蛋白表达条带,与预期结果一致;用ELISA检测,表达的蛋白具有明显的生物学活性,在菌体中的含量为244 ng/mL。本试验结果为牛IFN-γ蛋白的进一步研究和应用奠定了基础。     

鹅γ-干扰素的原核表达及抗病毒活性研究

本研究采用RT-PCR方法从培养的鹅外周血淋巴细胞总RNA中成功扩增到鹅IFN-γ基因。将克隆在pMD18-T载体中的鹅IFN-γ基因插入原核表达载体pGEX-6P-1,得到重组质粒pGEX-6P-1-IFN-γ。重组质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导后作SDS-PAGE分析,得到约43 ku融合表达蛋白特异条带。用GST亲和纯化柱对原核表达产物中目的蛋白进行纯化,得到1.2 mg/L的纯化蛋白。用100TCID50病毒量在鹅副黏病毒(GPMV)/鹅胚成纤维细胞系统上测定表达蛋白的抗病毒活性,观察不同处理组的细胞形态并用RT-PCR方法鉴定,发现表达蛋白稀释倍数小于104可抑制GPMV复制,按照Reed-Muench法计算表达的鹅IFN-γ抗病毒效价为2.0×103U/mL,表明表达蛋白具有良好的抗病毒活性。     

牛γ-干扰素在牛结核检测中的研究应用

γ-干扰素是细胞因子超家族中IFN家族的重要成员,具有广泛的生物学功能,其功能的多样性是通过诱导细胞表达多种蛋白质而实现的。作者对γ-干扰素的产生、诱导、临床试验、检测诊断及γ-干扰素的优点和其他用途的研究进展进行综述。     

抗牛γ-干扰素特异性单克隆抗体的制备

为了制备抗牛γ-干扰素(IFN-γ)的单克隆抗体(McAb),并对其部分生物学特性进行初步研究,试验用重组牛IFN-γ蛋白免疫小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术和间接ELISA方法进行试验.结果表明:共获得5株抗IFN-γ的单克隆抗体,Ig亚类鉴定均为IgGI,轻链为k链;经Weatern-blot试验证实5株McAb均能与IFN-γ发生特异性反应,而与其他蛋白不发生反应,特异性好;以5株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株制备腹水,效价均达到1:50 000以上.     

牛γ-干扰素基因的克隆及序列分析

根据GenBank中已公布的牛γ-干扰素(BovIFN-γ)基因序列设计引物,应用一步法逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,以从牛外周血淋巴细胞提取的总RNA为模板,扩增出γ-干扰素成熟肽基因片断,并对其进行了克隆、测序及序列分析.结果表明,试验所设计引物可以成功用于扩增牛γ-干扰素成熟肽基因片段,所扩增序列与GenBank中已有序列同源性达99.77%.     

梅花鹿γ干扰素克隆表达及抗病毒活性测定

提取经植物血凝素诱导培养的梅花鹿外周血淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR方法扩增出梅花鹿γ干扰素成熟蛋白基因并将其克隆到pMD18-T载体上,测序结果表明,扩增片段为梅花鹿γ干扰素成熟蛋白序列,与GenBank上发表的干扰素序列同源性为100%.将其重组到原核表达载体pET32a(+)上,并在大肠埃希菌BL21中实现了高效表达.表达产物以His-Tag融合蛋白的形式存在,表达量约占细菌总蛋白的32.6%.用镍亲和层析法对蛋白进行纯化,并利用VSV-MDBK/IBRV细胞系统分析其生物活性,重组梅花鹿γ干扰素抗病毒活性分别约为7.25×104 U/mL和4.61×104 U/mL.结果表明,重组梅花鹿γ干扰素特异性好,而且抗病毒活性比较稳定.     

牛γ-干扰素EIA与TST检测牛结核病的比较

采用牛γ-干扰素EIA（酶免疫分析）与结核菌素皮内试验（TST）两种方法对某奶牛场中182头奶牛进行牛结核病的检测,并对牛γ-干扰素EIA与TST两种检测方法进行比较。结果：TST检出阳性123份、可疑20份、阴性39份,牛γ-干扰素EIA检出阳性58份、阴性124份,TST的阳性率大于牛γ-干扰素EIA,EIA与TST相比,敏感性为30.30%、特异性为82.05%、符合率为39.56%。     

蜂素信号肽介导猪干扰素-γ在杆状病毒中分泌表达及抗病毒活性检测

应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将编码成熟的猪干扰素-γ基因插入供体质粒pFastBacTM1polyhedrin启动子控制下的多克隆位点,引入昆虫细胞可识别的蜂素信号肽(Honeybee melittin signal peptide)取代猪干扰素-γ原有信号肽以实现在昆虫细胞中分泌型表达,并在C端融合6个组氨酸标签以利于纯化。将构建质粒转化DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭载体质粒,转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。重组蛋白通过SDS-PAGE、间接免疫荧光、Western-blot证明在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中获得分泌表达。通过在猪肾细胞(PK-15)上抑制水泡性口炎病毒(VSV)致病变作用检测重组蛋白的抗病毒活性是1.38×106U/mL。     

重组牛γ-干扰素对牛外周血淋巴细胞分裂抑制作用

观察重组牛γ-干扰素对牛外周血淋巴细胞的作用。无菌采取牛外周血，分离培养淋巴细胞，取第一代细胞，分为试验组和对照组。试验组加入不同浓度的重组牛γ-干扰素，作用5d，观察细胞数量及细胞凋亡效应。结果为试验组淋巴细胞数目下降，细胞凋亡效应减弱。试验结果表明，重组牛γ-干扰素对牛外周血淋巴细胞具有抑制分裂及抗凋亡的作用。     

牛干扰素-γ基因的RT-PCR扩增、序列分析及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank上发表的牛干扰素γ基因序列设计引物,从牛外周血淋巴细胞中提取基因组RNA,采用RTPCR技术,扩增出干扰素γ基因并进行序列分析。琼脂糖凝胶电泳显示牛干扰素γ扩增片段约为500bp。序列分析结果表明,牛干扰素γ基因序列全长517bp,开放阅读框架内501个核苷酸,共编码166个氨基酸,分子质量19.4ku,与参考序列完全一致。克隆序列经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切后连接到经同样双酶切的PBV220质粒中,转化入大肠杆菌DH5α中,筛选阳性克隆进行温度诱导表达,经SDSPAGE分析,在约19.4ku处有表达的蛋白带,表达产物经免疫荧光染色鉴定为阳性。     

牛γ干扰素基因的原核表达及其单克隆抗体的研制

为了制备高质量高效价抗牛γ干扰素(Bo IFN-γ)的单克隆抗体,本研究将Bo IFN-γ基因克隆到His标签的大肠杆菌表达载体p ET32a+中,诱导表达并纯化蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体。结果筛选到9株单抗,分别命名为Bo IFN-γ-1E10、Bo IFN-γ-3C2、Bo IFN-γ-3E1、Bo IFN-γ-6C6、Bo IFN-γ-6H9、Bo IFN-γ-6B6、Bo IFN-γ-6E5、Bo IFN-γ-2A10和Bo IFN-γ-2G10。ELISA、Western blot和间接免疫荧光试验结果显示,制备的单克隆抗体与原核、真核表达的Bo IFN-γ都具有良好的反应性。本研究制备获得的针对牛γ干扰素的单克隆抗体为建立检测天然Bo IFN-γ的方法提供了重要的生物材料。     

γ-干扰素的研究及应用进展

γ-干扰素自被发现以来,由于其广谱抗病毒、抗肿瘤活性及其强大的免疫调节作用而受到研究者们的重视,在其基因结构、作用机理以及体外重组表达等方面都取得了巨大突破。本文综述了γ-干扰素的基本特性、生物学活性和在畜牧业的作用及其研究进展。     

绵羊γ干扰素在家蚕杆状病毒表达系统中的表达及产物的抗病毒活性

干扰素(IFN)具有广谱的抗病毒作用,利用杆状病毒表达系统安全、高效和后加工过程完整的特点,在家蚕体内表达生产重组绵羊γ干扰素(Ovi IFN-γ)。依据家蚕的密码子偏好性对Ovi IFN-γ基因核苷酸序列进行优化和PCR,并克隆了带有His标签编码序列的Ovi IFN-γ基因序列Ovi IFN-His-Tagged-γ,构建分别插入Ovi IFN-γ和Ovi IFN-His-Tagged-γ基因的重组病毒。将2种重组病毒感染家蚕5龄幼虫,Western blot检测蚕体血淋巴中重组Ovi IFN-γ和Ovi IFN-His-Tagged-γ成功表达。采用细胞病变抑制法测定蚕体血淋巴中重组Ovi IFN-γ的效价为1.6×106U/m L,重组Ovi IFN-His-Tagged-γ的效价为2.8×105U/m L,前者的抗病毒活性强于后者,稀释至2.0×104倍时,能够完全抑制VSV-GFP病毒感染。上述结果为利用家蚕杆状病毒表达系统在蚕体内高效、安全生产具有抗病毒活性的重组绵羊γ干扰素提供了试验依据。     

重组牛γ-干扰素单克隆抗体的研制

为制备针对重组牛γ-干扰素(rBoIFN-γ)的单克隆抗体(mAb),以纯化的原核表达融合蛋白rHis-BOIFN-γ为免疫原,用纯化的rGST-BoIFN-γ为筛选抗原,应用淋巴细胞杂交瘤技术,研制抗rBoIFN-γ的mAb.结果获得13株稳定分泌抗BoIFN-γ mAb的细胞株,命名为1C12、1F7、1G5、3E6、4D5、5E11、5G4、6F8、6G6、7E9、8D3、8F8和9G11.腹水的效价除单抗9G11外,其余效价都在1:80000以上;除5G4 mAb亚类为IgG2b外,其余均为IgG1.Dot-ELISA结果表明,所得单抗只与融合蛋白rHis-BoIFN-γ和rGST-BoIFN-γ反应,而不与其它重组细胞因子和对照细菌反应,显示其良好的特异性.Western blot显示所获单抗能与相应的融合蛋白发生反应,出现特异性务带.同时所获单抗均能与牛IFN-γ标准品反应.13株单抗均为针对rBoIFN-γ的特异性mAb,为进一步研究rBoIFN-γmAb在牛的免疫调控、牛疫病的致病机制及其诊断中的应用奠定基础.