肿瘤坏死因子的体外诱生及检测

试验以ＢＣＧ和ＬＰＳ为诱导物,在体外培养条件下刺激小鼠腹腔巨噬细胞诱生ＴＮＦ,培养上清对Ｌ９２９细胞具有细胞毒作用。结果显示,ＰＥＣ具有良好的体外诱生ＴＮＦ的能力,产生了并分泌ＴＮＦ的最佳条件是ＬＰＳ浓度为１μｇ／ｍＬ,培养时间为８ｈ;改良的结晶紫染色测定ＴＮＦ活性的方法具有简便,快速,易于重复等优点。     

鸡肿瘤坏死因子的提取及其免疫活性的研究

应用卡介苗(BCG)和大肠杆菌内毒素(脂多糖,Lipopolysuccharide,LPS)鸡体内诱导产生肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF),然后从血清、脾细胞、外周血白细胞提纯TNF,并对其免疫活性(对L929细胞的杀伤作用)进行探讨,将其结果绘出图像,并用方差分析法进行了数据处理。研究结果表明,从鸡体内可以提取TNF。血清TNF活性最强,其次为脾细胞TNF,外周血白细胞TNF活性最弱。血清TNF经用Sephadex G-200分离组分,第一组分活性为最强,但低于全组总活性。     

鸡肿瘤坏死因子的理化性质研究

应用卡介苗(BCG)和内毒素(LPS)在鸡体内诱导产生肿瘤坏死因子(TNF),检测TNF在pH值5.3、7.0、8.0和在60℃、65℃、70℃各处理30min,胰蛋白酶处理30min,对L929细胞的杀伤活性。结果表明,鸡TNF在pH7.0时活性最强,其次为pH5.3,pH8.0时活性最弱。60℃、65℃各处理30 min活性不受影响,70℃和胰蛋白酶处理30 min活性丧失。     

鸡肿瘤坏死因子的理化性质研究

应用卡介苗（BOG）和内毒素（LPS）在鸡体内诱导产生肿瘤坏死因子(TNF），检测TNF在pH值5．5、7．0、8．0和在60℃、65℃、70℃各处理30min，胰蛋白酶处理30min，对L929细胞的杀伤活性。结果表明，鸡TNF在pH7．0时活性最强，其次为pH5．3，pH8．0时活性最弱。60℃、65℃各处理30min活性不受影响，70℃和胰蛋白酶处理30min活性丧失。     

鸡肿瘤坏死因子的分离纯化样品和未分离纯化样品免疫活性比较

在鸡体内诱导产生肿瘤坏死因子,取血清、外周白细胞及脾细胞样品,然后分别取一定量样品用硫酸铵盐析法和葡聚糖凝胶G-200柱层析法进行分离纯化。再将分离纯化的样品和未分离纯化的样品分别作用于L929细胞,检测细胞死亡率。结果表明分离纯化的样品活性高于未分离纯化的样品活性,这种纯化方法能提高鸡TNF的纯度和活性。     

鸡包涵体肝炎病毒FAV-HA株诱生SPF雏鸡体内肿瘤坏死因子的研究

自1975年从动物体内提取肿瘤坏死因子(TNF)以来,许多科学研究者从哺乳动物和禽类体内提取TNF并对其进行了理化性质、生物活性的研究和探讨。以前的研究中用卡介苗和大肠杆菌内毒素等诱导产生TNF。本研究为TNF的诱导产生提供新的思路和试验方法。利用鸡包涵体肝炎病毒FAV-HA株作为TNF的诱生剂,诱导产生SPF雏鸡TNF,其生物活性用L-929细胞进行检测。通过试验证实,FAV-HA能够诱导产生TNF,并且在不同组织器官内TNF的含量有一定差异。     

鸡包涵体肝炎肿瘤坏死因子α的动态变化与病变相关性的研究

应用FAV-Hb株试验感染1日龄SPF雏鸡,感染后分别于第1、2、3、4、5、7、10、13、16、21、26、31、36、41、46、51、56d扑杀,采外周血和脾脏,通过微量细胞病变法经L929细胞测定其TNFα活性,并对肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊和盲肠扁桃体做病理学检查.结果表明FAV-Hb感染后第3 d在外周血开始测出TNFα活性,以后逐渐上升,第4 d达到小的峰值,随后下降,第13 d基本消失,并持续到第16 d,从21 dTNFα活性又开始回升,第46 d时达到最高峰,以后缓慢下降.感染鸡脾脏TNFα活性的变化规律与外周血基本一致,感染后第2 d起在脾脏测出少量TNFα,第7 d出现小峰值,以后下降到基本消失,从第21 d起重新测出TNFα,并逐渐上升,在36 d到56 d持续在较高的水平.病理组织学观察证实,FAV-Hb感染后,除肝脏和淋巴组织的损伤性变化外,从第1 d到第56 d,感染雏鸡肝脏的窦壁细胞,脾脏、胸腺、法氏囊和盲肠扁桃体的网状细胞表现出不同程度的活化增生,其增生程度与外周血和脾脏TNFα活性基本一致.鸡包涵体肝炎肿瘤坏死因子α动态变化的研究表明,FAV-Hb感染后,雏鸡体内TNFα的消长规律与病变的发生发展有较明显的相关性.     

鸡马立克病血清肿瘤坏死因子的活性研究

鸡马立克病(Marek′s disease,MD)是由疱疹病毒引起的一种传染性淋巴组织肿瘤性疾病。自20世纪70年代后期以来,由于火鸡疱疹病毒疫苗的广泛应用,基本上控制了该病的流行。但受种种因素的影响至今还不能绝迹。近几年,有马立克病毒(MDV)毒力不断增强趋势。肿瘤坏死因子(Tumor Nec     

鸡肿瘤坏死因子α基因片段的分子克隆及序列测定

应用LPS诱生的鸡培养白细胞提取总RNA,参考几种动物的TNFα保守序列设计一对引物,以提取的培养白细胞总RNA为模板,通过RT-PCR扩增目的基因片段,将PCR产物与PUC19连接,转化到大肠杆菌DH52进行分子克隆,对提取的重组质粒经PCR鉴定和酶切鉴定,表明重组的基因片段是目的基因片段,其长度为576bp。     

鸡包涵体肝炎肿瘤坏死因子消长规律的研究

自1975年从动物体内提取肿瘤坏死因子（TNF）以来，许多科学家从哺乳动物及禽类体内提取TNF并对其理化性质、生物学活性进行了不同程度的研究和探讨。而用鸡包涵体肝炎病毒诱生TNF与该病之间相关性及产生的消长规律的研究尚属空白。本研究应用鸡包涵体肝炎病毒（FAV-HA毒株）接种SPF雏鸡，在接种后的不同日龄采血，提取TNF，并对其免疫活性（对L₉₂₉细胞的杀伤率）进行了检测，从而进一步研究其产生TNF的消长规律及与该病毒的相关性。研究结果表明，鸡包涵体肝炎病毒经口腔感染SPF雏鸡可刺激机体产生TNF，在感染的不同日龄鸡的TNF活性出现一定的消长规律。这进一步说明鸡包涵体肝炎(IBH)与TNF的产生及其活性具有密切的相关性。     

SPF雏鸡感染网状内皮组织增殖病病毒后肿瘤坏死因子的动态变化

采用微量细胞病变法和四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ）法研究了１日龄ＳＰＦ雏鸡感染网状内皮细胞增殖病病毒（ＲＥＶ）后,免疫器官脾脏肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）诱生活性动态变化。结果表明,雏鸡感染ＲＥＶ后脾脏细胞ＴＮＦ诱生活性极显著增高（Ｐ〈０．０１）,ＴＮＦ诱生活性明显增高与ＲＥＶ在机体各器官内长期大量繁殖紧密相关,并引起各免疫器官严重的变质性变化,以及由于ＴＮＦ高含量的免疫损伤作用而降低机体各免疫器官的机能。     

利用酵母双杂交系统筛选TRADD的互作牛分枝杆菌蛋白

为研究牛分枝杆菌抑制肿瘤坏死因子介导的细胞凋亡来逃避宿主免疫反应的机制,本试验采用酵母双杂交系统在牛分枝杆菌中筛选可与肿瘤坏死因子受体1相关死亡域蛋白（TRADD）相互作用的蛋白。通过限制性内切酶Sau3AⅠ部分消化牛分枝杆菌基因组,回收片段随机插入pGADT7载体中,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建牛分枝杆菌基因组文库。PCR扩增人tradd基因,将扩增产物克隆于pGBKT7载体上,构建重组诱饵质粒pGBKT7-tradd,转化酵母菌Y2HGold。用诱饵质粒pGBKT7-tradd对牛分枝杆菌基因组文库进行筛选,以获得与TRADD互作的阳性候选克隆;提取阳性候选克隆中的质粒,经测序和同源性比对分析,获得与TRADD互作的牛分枝杆菌蛋白的生物学信息。结果显示,构建的文库滴度为2×10⁶ CFU,平均插入片段在1.5 kb左右,文库重组率>95%。经Western blotting验证,诱饵质粒pGBKT7-tradd可在酵母菌中表达诱饵蛋白TRADD,且TRADD的表达对酵母菌无毒性,不会在酵母菌中自激活。应用酵母双杂交系统初步筛选出20个与TRADD互作的阳性克隆,经复筛、测序和BLAST对比,最终发现7个基因序列。本研究应用酵母双杂交技术成功筛选到7个与TRADD互作的牛分枝杆菌蛋白,为进一步研究牛分枝杆菌对细胞凋亡的抑制机制提供线索。     

传染性造血器官坏死病毒焦磷酸测序检测技术的建立

根据传染性造血器官坏死病毒(IHNV)基因序列,设计了IHNV最为保守的指纹序列,以及测序引物,建立了IHNV焦磷酸测序检测方法。对所构建的IHNV焦磷酸检测方法进行特异性试验和灵敏度检测。结果表明,所建立的方法特异性好,在8种鱼类病毒中能够特异性检测出目的病毒,检测方法灵敏度高,最低检出核酸量为10pg/μL。对建立的焦磷酸测序检测方法进行了实际应用研究,选取国内采集与进口的鱼类样本共计80批次进行IHNV检测。结果显示,焦磷酸测序检测方法可以有效的检出常规RTPCR不能检出的假阴性样本和弱阳性样本,该方法的灵敏度和特异性可以满足水生动物疫病检测的需要。     

人工诱发鸡大肠杆菌病的接种规律

采用鸡大肠杆菌 O2标准强毒株 ,对 4 80羽宝万斯 -高兰蛋雏鸡颈部皮下注射进行人工发病 ,研究了细菌培养时间、接种量与致病力之间的关系和规律。结果表明 ,在同一毒株条件下 ,细菌致病力强弱 ,主要取决于接种感染菌数 ,只要接种菌数适宜 ,4～ 2 4 h细菌培养液均可成功发病 ,不必受普遍采用 1 8h细菌培养液接种的时间约束。这一试验结果可为灵活、合理安排抗菌新兽药试验中人工病例复制提供参考     

Endotoxemia and Tumor Necrosis Factor Activity in Dogs With Naturally Occurring Parvoviral Enteritis

A prospective, nonrandomized study was performed to evaluate the role of endotoxin and tumor necrosis factor (TNF) in dogs with parvoviral enteritis. Seventeen dogs with naturally occurring parvoviral enteritis were enrolled in the study. Plasma samples were obtained for quantification of endotoxin and TNF on presentation and at 3 and 6 hours after therapy with either fluids prior to antibiotics, or fluids concurrently with antibiotics. All dogs received standard supportive therapy. Fourteen of 17 dogs had endotoxin in their plasma during the study period; 7 of 17 dogs had measurable TNF. No endotoxin or TNF was detectable in plasma from normal puppies. An increase in TNF activity was pre dictive of mortality ( P = .041). There was a trend for increasing endotoxin activity to predict mortality ( P = .0769). Animals that received antibiotics with fluids were significantly older than those that received fluids prior to antibiotics, and there was a trend for animals that received antibiotics with fluids to have a decrease in endotoxin activity after treatment ( P = .054). Endotoxin and activation of the cytokine cascade are integral to the pathophysiology of parvoviral enteritis. Measures to limit endotoxemia and the systemic inflammatory response may improve survival.     

促卵泡素和表皮生长因子对鸡胚精原细胞增殖的作用

利用精原细胞-体细胞体外无血清共培养模型研究了促卵泡素(FSH)和表皮生长因子(EGF)对鸡胚精原细胞增殖的作用。结果表明:单独的FSH(10～100ng/mL)或EGF(10～100ng/mL)可显著增加精原细胞的数目以及增殖细胞核抗原的表达。EGF(10ng/mL)联合FSH(10ng/mL)具有加性效应,但更高剂量的EGF(100ng/mL)则降低了FSH的促进作用。因此,FSH联合适量的EGF可促进精原细胞的增殖。     

鲤鱼肿瘤坏死因子α1基因cDNA的克隆及序列分析

试验以鲤鱼外周血白细胞肿瘤坏死因子α1(tumor necrosis factor alpha 1,TNFα1) EST序列为基础,经地高辛标记作为探针对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,从0.9×10⁴个重组噬菌体中,经过2轮筛选获得3个阳性克隆。序列分析结果显示,该序列包含128 bp的5''非编码区(5''-UTR),423 bp的3''非编码区(3''-UTR),开放阅读框ORF长768 bp,共编码255个氨基酸,在其3''非编码区存在几个ATTTA不稳定基序。预测蛋白等电点为8.20,分子质量大小为28.1 ku。序列同源性比较结果表明,所获序列与GenBank上登录的鲤鱼TNFα基因的同源性达94%。蛋白质的序列和结构分析结果发现,其具有TNF家族的典型序列特征、1个跨膜区结构和1个假定的产生成熟肽的裂解位点。     

猪脾转移因子对雏鸡免疫应答的作用研究

将猪脾转移因子(Transfer Factor,TF)与鸡新城疫疫苗配合应用,比较猪脾转移因子对人工接种新城疫疫苗的鸡淋巴细胞转化率和新城疫HI效价的影响。结果表明,应用TF试验组的淋巴细胞转化率和血清抗体效价与单独接种疫苗对照组相比较,差异显著,说明TF与疫苗配合应用时具有协同作用,可显著地提高机体的细胞免疫和体液免疫功能,增强疫苗的免疫效果。     

PCR及相关技术在鸡球虫种株鉴别方面的应用

鸡球虫病是危害养禽业的重大疫病之一,其病原属于艾美耳属(Eimeria)的球虫,世界上公认有7种。过去,其病原的鉴别一直是研究的难点。近年来,由于分子生物学技术,尤其是PCR及其相关技术的迅猛发展及在寄生虫分类中的应用,鸡球虫种、株鉴别方法也由以形态特征和生活史等为标准的传统分类学进入了以核酸为材料的现代分子分类学时代。文章对PCR及其相关技术在鸡球虫种、株鉴别方面的应用做了较为全面的阐述,并分析了其优缺点。