巴西橡胶树HbWRKY1基因5'调控序列的克隆及功能初步鉴定

为深入研究巴西橡胶树HbWRKY1基因的表达调控机制,采用染色体步移法克隆了HbWRKY1基因的5'调控区序列.结果表明,该序列具有预测的核心启动子区域位于-6～-57 bp,转录起始位点位于翻译起始位点上游41 bp处;该序列具有TATA-box,CAAT-box和GATA-box等多个典型的真核生物启动子基本的顺式作用元件,同时还具有低温响应元件LTR,赤霉素反应元件GARE-motif’生长素响应元件TGA-element和脱落酸响应元件ABRE等参与激素调控元件,此外还有与MYB结合的MBS元件,热胁迫反应的HSE,厌氧诱导元件ARE和增强诱发厌氧反应的GC-motif等顺式作用元件.构建了不同长度的HbWRKY1启动子片段的植物表达载体并转化本生烟草,通过潮霉素抗性和PCR鉴定,获得了转基因植株.对获得的转HbWRKY1不同长度启动子片段的转基因T1植株GUS染色发现,植株的茎、叶柄、主叶脉和根中均可呈现蓝色,表明HbWRKY1基因的5'调控区可以启动GUS基因的表达,具有启动子的活性.     

巴西橡胶树小橡胶粒子蛋白基因5＇调控序列的克隆及功能初步鉴定

在橡胶树中小橡胶粒子蛋白是催化和调控天然橡胶生物合成的重要蛋白因子。根据小橡胶粒子蛋白基因(HbSRPP)的mRNA序列(GenBank登陆号：AF051317)设计引物,利用Genome Walking方法克隆了HbSRPP起始密码子上游1 159 bp的5′调控序列。序列分析表明,该序列A/T含量为68.25 %,含有典型的真核生物核心启动子区域(-141bp-99 bp),一些与真核生物典型的顺式调控元件相似的TATA-box、增强子元件、CAAT-box、GATA-box也存在序列中,此外还发现一     

巴西橡胶树法尼基焦磷酸合酶基因5＇调控序列的克隆及功能初步鉴定

法尼基焦磷酸合酶是异戊二烯生物合成途径中的一个关键酶,根据NCBI数据库中巴西橡胶树法尼基焦磷酸合酶基因HbFPS序列设计引物,克隆了HbFPS起始密码子上游1066 bp的5＇调控序列。序列分析表明,该序列A/T含量为77.39 %,含有典型的真核生物核心启动子区域,在该序列中发现了一些与真核生物典型的顺式调控元件相似的TATA-box、增强子元件、CAAT-box和GATA-box以及一些与激素、胁迫诱导、转录因子相关的顺式作用元件。构建了含有该序列的植物表达载体并转化烟草,对获得的转基因烟草T0代植     

橡胶树HbWRKY3的克隆及其响应逆境胁迫的表达分析

通过RACE技术扩增获得橡胶树HbWRKY3基因,并对该基因及其所编码氨基酸序列进行生物信息学分析和响应逆境胁迫的表达分析,结果表明：该基因含有2个WRKYGQK结构域和2个C2H2锌指结构,属于WRKY基因家族第Ⅰ类;由4个外显子和3个内含子组成,DNA序列全长3 780 bp;开放阅读框长度为2 211 bp,编码由737个氨基酸组成的多肽。该基因定位于细胞核中,在橡胶树叶片、树皮、花、胶乳等不同组织中都有表达,以花中的表达水平最高。盐、PEG、茉莉酸、水杨酸等非生物胁迫均可诱导HbWRKY3的表达,但干旱、ABA、乙烯和低温胁迫的诱导较为明显。     

巴西橡胶树HbSERK1启动子的克隆及功能鉴定

利用Genome Walker方法从巴西橡胶树中克隆了Hb SERK1起始密码子上游1 395 bp的5′调控序列,序列分析表明,该序列A/T含量高达66.2%,符合真核生物启动子序列的特征。Hb SERK1启动子序列中含有多个典型的真核生物启动子基本元件,如:TATA-box,CAAT-box等,同时存在其它应答元件,如:CAT-box、02-site、ERE、ARE、TCA-element、GCN4-motif、ACA-motif等。将Hb SERK1启动子进行5′缺失,并构建了5个植物缺失表达载体。利用真空渗透法和农杆菌介导法将植物缺失表达载体转化烟草,对烟草转化植株进行GUS活性定量分析结果表明,除了SP5外,其它缺失表达载体均可以驱动GUS蛋白的表达,说明在Hb SERK1启动子-1 395~-252 bp区域可以驱动GUS的表达,表明Hb SERK1启动子是具有生物活性的启动子。     

巴西橡胶树HbHMAD1的克隆及表达

根据已获得的在橡胶树自根幼态无性系与老态无性系胶乳中一个差异表达的片段序列设计引物,通过RACE法获得了橡胶树编码含有重金属相关结构域蛋白的cDNA,命名为HbHMADl.序列分析结果表明,HbHMA D1长为814bp,含有453 bp的阅读框,78bp的5’-UTR和283 bp的Y-UTR,编码150个氨基酸,分子量为16.9 ku,等电点为10.4.HbHMAD1含有重金属相关结构域,与蓖麻(Ricinus communis)、拟南芥(Arabodopsis thesis)(3个)和玉米(Zea mays)中的含有重金属相关结构域蛋白的同源性分别为85％、64％、63％、60％和55％.半定量RT-PCR分析表明HbHMA D1基因在胶乳和树皮中表达,在叶中微量表达,在花中基本不表达.     

巴西橡胶树病程相关蛋白基因（HbPR1）的克隆及分析

利用同源克隆技术,在前期课题组对橡胶树转录组进行测序的基础上,根据模式植物中PR1蛋白的氨基酸序列进行同源搜索并设计引物,通过RT-PCR方法扩增巴西橡胶树PR1同源基因的cDNA片段,命名为HbPR1。该片段包含一个450 bp的开放阅读框,编码150个氨基酸的多肽。生物信息学分析结果表明,该氨基酸序列与杨树(Populus tomentosa)、葡萄(Vitis vinifera)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的PR1蛋白高度同源,同源性分别为76%,74%和72%,并含有SCP_PR1_like结构域。半定量分析结果表明,该基因表达受水杨酸的诱导。以上结果暗示该基因为橡胶树的PR1同源基因,可作为橡胶树系统获得性抗性产生的标签基因。     

巴西橡胶树乳管细胞HbWRKY1基因克隆及表达分析

采用PCR和RACE技术,从巴西橡胶树无性系热研7-33-97的乳管细胞中克隆了WRKY转录因子家族的一个成员HbWRKY1。该基因全长为1755 bp,含有1个1440 bp阅读框,编码479个氨基酸。生物信息学分析表明,HbWRKY1含有2个WRKY结构域和C2H2锌指结构基序,与蓖麻、杨树、葡萄、黄瓜、拟南芥的WRKY成员的氨基酸序列同源性分别为64.14%、60.04%、42.54%、40.61%和35.4%,属于Ⅰ类WRKY家族成员。实时荧光定量PCR分析表明,割胶和乙烯显著上调HbWRKY1基因的表达,但茉莉酸和机械伤害对HbWRKY1的表达没有明显影响,表明HbWRKY1可能在乙烯信号途径对防卫蛋白的调节中起重要作用。     

橡胶树cystatin基因HbCYS1的克隆及割胶应答

在植物中,半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cystatin)广泛参与逆境胁迫应答和发育调控。在已建立的胶乳EST序列数据库中,鉴定了一个注释为cystatin的序列重叠群(Contig)。利用RACE和RT-PCR进一步获得1个长度为947 bp、包含完整读码框(741 bp)的cDNA,命名为HbCYS1;去除N端27个aa的信号肽后,HbCYS1蛋白生成1个包含219个aa的成熟蛋白(24.2 ku),具有cystatin反应位点的保守序列基序GG、QXVXG和A/PW,同时具有植物cystatin所特有的LARFAV基序;推测HbCYS1是一种分泌性蛋白,与同样来自大戟科的1个蓖麻cystatin蛋白(CAA89697)的亲缘关系最近,氨基酸序列的一致性达79%;在胶乳中,割胶明显促进HbCYS1基因的上调表达。割胶是一种典型的非生物胁迫,橡胶树对割胶胁迫的适应能力是决定其持续生产力的一个重要因素,推测HbCYS1基因可能参与橡胶树的胁迫应答与胶乳再生。     

巴西橡胶树HbMYC1基因的克隆及序列分析

从GenBank中搜索到1条来自橡胶树的MYC(Myelocytomatosis)家族基因EST序列,以该序列为保守区,通过RACE技术获得了该基因全长cDNA序列,共1817bp。通过BLAST工具搜索GenBank数据库,结果表明,该cDNA序列同其他植物的MYC家族基因高度同源,认为该cDNA序列为橡胶树MYC家族成员。利用GenScan和Clastal X对该序列进行分析,推测其编码区长度为1428bp,编码476个氨基酸。生物信息学分析结果表明,巴西橡胶树的MYC基因编码的氨基酸序列与其他物种的相似性很高,同时推导的蛋白质序列中还存在着1个螺旋-环-螺旋的DNA结合区域和1个核定位信号,表明克隆到的基因是1个MYC家族成员的转录因子。     

巴西橡胶树CBF1基因的克隆和序列分析

通过RT-PCR技术从橡胶树中克隆了CBF基因家族的保守区,并通过5＇端RACE和3＇端RACE技术克隆了全长为1121 bp的cDNA序列,通过BLAST工具搜索Genbank数据库.结果表明,该cDNA序列同其他植物中的CBF家族基因高度同源,认为该cDNA序列就是橡胶树中的CBF基因.利用genescan和ClastalX工具对该序列进行分析,推测其编码区为693bp,编码231 Aa,并包含一个AP2 DNA结合域.氨基酸同源性分析结果表明,来自橡胶树的CBF基因氨基酸序列与热带起源的作物同源性较高,而与北方种植作物相似性较低.     

巴西橡胶树磷饥饿调控基因HbPHR1克隆与生物信息学分析

天然橡胶主要来源于巴西橡胶树。海南植胶土壤磷素缺乏,而缺磷会导致橡胶树生长缓慢、干胶产量降低。本文通过RT-PCR技术从橡胶树中克隆了一个磷饥饿信号关键调控基因HbPHR1,基因全长1 560 bp,包含一个1 476 bp的完整读码框(ORF),编码491个氨基酸,分子量约为53.48 kD。HbPHR1具有MYB结构域和CC结构域,属于MYB-CC家族成员,为酸性不稳定蛋白,具有较强的亲水性。进化树分析表明,HbPHR1与拟南芥AtPHR1、油菜BnPHR1归为一个亚类。HbPHR1的克隆对解析橡胶树磷信号转导机制、创制磷营养高效利用橡胶树材料具有重要意义。     

巴西橡胶树HbAGL62基因的克隆及表达分析

从巴西橡胶树早花材料与普通种质cDNA差减文库中筛选到一个具有MADS保守序列的EST基因片段,根据该片段序列信息设计特异引物,利用RACE进行特异片段的5′扩增,获得长度为935 bp的HbAGL62基因克隆。生物信息学分析表明,该基因包含795 bp的开放阅读框,编码265个氨基酸,含有MADS保守结构域,与拟南芥、葡萄和苜蓿AGL62基因进化距离最近。实时荧光定量PCR表明,HbAGL62在橡胶树根和皮中不表达,在花和胚中表达,存在组织特异性表达;在叶芽分化阶段不表达,花芽分化时高效表达,表明HbAGL62与橡胶树开花调控有重要关系。     

巴西橡胶树HbCytb561的克隆及表达分析

细胞色素b561通过参与抗坏血酸的再生在活性氧淬灭、生长发育和抗旱等生理过程中起作用。从巴西橡胶树热研7-33-97叶片中克隆一个细胞色素b561基因,其推导氨基酸含有特征性Cyt_b561家族结构域,命名为HbCytb561。该基因在花、叶片和胶乳中表达,在树皮中不表达。干旱、机械伤害和白粉菌侵染均显著上调该基因在橡胶树叶片中表达。结果说明HbCytb561基因受逆境反应诱导,参与橡胶树抗逆响应的生理和分子机制。     

巴西橡胶树HbR3HP1的克隆及表达分析

根据已获得的1个在巴西橡胶树自根幼态无性系与老态无性系之间差异表达的SSH片段的序列信息设计引物,通过RACE方法获得了1个橡胶树编码含有R3H结构域蛋白的cDNA（命名为HbR3HP1）。序列分析结果表明：HbR3HP1长为1 286 bp,含有1 056 bp的阅读框、30 bp的5′-UTR和160 bp的3′-UTR,HbR3HP1编码的蛋白质由351个氨基酸组成,分子量为40.23 ku,等电点为8.29。HbR3HP1含有保守的R3H结构域, 与1个蓖麻、1个蒺藜苜蓿和3个拟南芥的含有R3H结构域蛋白的同源性分别为82％、64％、65％、56％和54％。定量PCR分析结果表明,HbR3HP1在橡胶树的根、花、叶、树皮、胶乳中均有表达,在树皮和胶乳中表达量相对较高;茉莉酸可以诱导HbR3HP1的表达,乙烯对HbR3HP1的表达基本无影响。     

巴西橡胶树AnnHb1基因的克隆及表达分析

根据一个从巴西橡树胶乳cDNA文库中获得的EST片段的序列设计引物,通过RACE的方法获得了橡胶树编码annexin的cDNA,命名为AnnHb1。序列分析表明,AnnHb1长为1 198 bp,含有945 bp的阅读框,62 bp的5'-UTR和191 bp的3'-UTR,编码314个氨基酸,分子量为35.99 ku,等电点为8.18。该氨基酸序列与蓖麻、麻疯树、棉花、苜蓿、烟草和拟南芥中的annexin的同源性分别为82%、72%、72%、64%、60%和60%。半定量RT-PCR分析结果表明AnnHb1基因在愈伤、花、树皮、叶、胶乳中均有表达,其中在愈伤组织中表达量最低,树皮中表达量最高。     

橡胶树炭疽病菌Cap20基因的克隆和序列分析

根据鳄梨胶孢炭疽菌Cap20基因序列设计引物,利用同源基因克隆法获得橡胶树胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌Cap20基因,同时进行核苷酸序列、氨基酸序列及聚类分析。结果表明:2种橡胶树炭疽菌的Cap20基因均含2个外显子和1个内含子,编码183个氨基酸;橡胶树胶孢炭疽菌与鳄梨胶孢炭疽菌同源性最高,其核苷酸序列同源性达90.3%,氨基酸序列同源性达98.9%;来自橡胶树的2种炭疽菌Cap20基因序列存在较大差异,其核苷酸水平同源性仅为73.8%,氨基酸水平同源性为79.8%;炭疽菌CAP20和绿僵菌MPL1蛋白结构具有42%的同源性,所含蛋白结构域相似,推测炭疽菌Cap20基因可能与绿僵菌Mpl1基因功能具有相似性。     

巴西橡胶树SnRK1家族基因的克隆与表达分析

蔗糖非酵解型蛋白激酶I(Sn RK1)是植物糖信号途径的关键因子,广泛参与植物生长发育。以蓖麻Sn RK1基因序列为探针,采用同源克隆的方法获得了橡胶树Sn RK1家族2个基因的全长c DNA,分别命名为Hb Sn RK1-1(KX237690.1)和Hb Sn RK1-2(KX237691.1)。2个Hb Sn RK1基因均编码含515个氨基酸且序列高度一致(96.5%)的蛋白质;2个基因均含10个外显子、9个内含子,且外显子大小相近,但基因长度差异明显。在6种橡胶树组织中,2个Hb Sn RK1基因均有表达,但Hb Sn RK1-1在胶乳(产胶细胞乳管的细胞质)中的表达量明显高于Hb Sn RK1-2;在叶片发育不同时期,Hb Sn RK1-1的表达变化不显著,而Hb Sn RK1-2的表达随叶片发育明显下降;在胶乳中,Hb Sn RK1-1的表达显著受乙烯和茉莉酸诱导、受2,4-D抑制,但Hb Sn RK1-2表达受激素处理的影响较小,推测Hb Sn RK1可能参与胶乳再生的激素调控。     

巴西橡胶树HbMADS4的克隆及原核表达分析

为了探讨巴西橡胶树自根幼态无性系高产的分子机制,通过抑制缩减杂交获得了在巴西橡胶树自根幼态无性系和老态无性系胶乳中差异表达的基因片段。为进一步鉴定差异表达基因的功能,对相关基因进行克隆。通过RACE方法克隆一个新的橡胶树MADS-box转录因子基因（命名为HbMADS4）, HbMADS4全长984 bp,含有633 bp的阅读框,编码230个氨基酸。推测HbMADS4蛋白分子量为23.71 ku,等电点为7.61,在N端含有典型的MADS-box结构域。构建HbMADS4原核表达载体pHbMADS4,将其转化E. coli, 经优化条件后,在20 ℃,0.1 mmol/L IPTG诱导4 h的条件下,获得HbMADS4融合蛋白。HbMADS4的克隆和HbMADS4融合蛋白的获得为深入研究HbMADS4的功能奠定基础。     

橡胶树胶乳HbPLDα1基因及其启动子的克隆与生物信息学分析

植物磷脂酶PLDα1与伤害信号转导密切相关,是伤害诱导内源茉莉酸（Jasmonic acid, JA）生物合成的关键酶之一。橡胶树胶乳PLDα1基因（HbPLDα1）表达的研究将有助于揭示橡胶树乳管细胞JA信号转导及其调控橡胶生物合成的机制。在EST序列的基础上,通过RACE和Genome Walking方法分别克隆了橡胶树胶乳的HbPLDα1基因及其启动子序列。HbPLDα1基因的cDNA全长为2 870 bp,包含长度为2 427 bp的完整开放阅读框（ORF）,具有典型的植物PLDα蛋白保守功能域,与同属大戟科的蓖麻和麻风树的PLDα1基因亲缘关系最近。HbPLDα1基因启动子区域长为1 559 bp,除含有TATA box和CAAT box等基本顺式作用元件外,还存在JA和脱落酸等激素响应元件以及干旱胁迫等环境信号响应元件,这表明HbPLDα1基因的表达可能受激素和环境信号的调控,在橡胶树乳管细胞对激素和环境信号的响应过程中发挥重要作用。