橡胶树次生体胚发生及其再生植株遗传稳定性的分子检测

以热研7-33-97花药为材料,建立橡胶树次生体胚发生和植株再生体系,主要包括初生花药体胚诱导、次生体胚发生和次生胚植株再生三个步骤.结果表明,来自花药初生异常胚和初生子叶期胚的0.2～0.3 cm胚块均能成功诱导次生体胚发生,并均能获得成熟子叶期胚.以初生异常胚为外植体,每个胚块获得子叶期胚数为0.64个.以初生子叶期胚为外植体连续3次诱导次生体胚发生,随诱导次数增加,体胚发生频率先上升,后保持稳定.2,4-D对次生体胚植株再生具有明显影响.添加4.5 μmol/L和9 μmol/L 2,4-D植株再生培养基中植株再生频率达到85.0%.AYLP检测次生体胚植株遗传稳定结果显示:(1)来自初生异常胚的次生体胚植株60.0%植株DNA发生变异;(2)来自初生子叶期胚的次生体胚植株,随次生体胚发生次数增加,检测到DNA变异植株频率由30.0%升高到52.4%.AFLP聚类分析结果显示,次生体胚植株与热研7-33-97高度相似,相似系数大于0.904.     

橡胶树品种产量稳定性的分析研究

根据我院早年建立的橡胶品种比较试验区头6年割胶资料进行统计处理,按照Eberhart-Russell模型对品种的稳定性详细说明其分析经过,并就目前国内外对作物品种产量稳定性参数的分析方法作简要的介绍。旨在通过对稳产性的分析研究,对试验品种作出较为全面的评价。     

TaNAC14转基因小麦外源目标基因拷贝数及遗传稳定性分析

外源基因拷贝数是影响转基因植物遗传稳定性及其自身表达水平的重要因素。为了探析TaNAC14基因在小麦生长发育中的生物学功能,本研究通过农杆菌介导的遗传转化法获得了14个T0代TaNAC14转基因小麦植株,采用BASTA溶液涂抹和目标序列PCR检测相结合的方法,从14个转基因小麦植株中鉴定出9个阳性植株。通过TaqMan实时定量PCR方法,以小麦内源单拷贝基因Pinb为内参基因,对9个T0代转基因小麦阳性植株中外源目标基因拷贝数进行检测,结果表明,T0代转基因小麦再生植株中有5株为单拷贝,4株为双拷贝,其中单拷贝插入整合的比率接近55.6%。选取单拷贝转基因植株收获的种子进行种植,根据BASTA溶液涂抹鉴定对T0:1代小麦株系遗传情况进行分析,结果表明目标基因TaNAC14是可遗传的。此外,还对T1代转基因小麦目标基因表达水平进行测定,结果表明,与野生型JW1相比,各转基因小麦植株目的基因TaNAC14表达量均极显著增加。该研究结果为后续TaNAC14基因的功能研究奠定了基础。     

转基因橡胶树中载体骨架序列的初步研究

以橡胶树转基因材料为研究对象,首次基于载体左右边界序列设计的特异引物进行载体骨架序列的初步PCR检测,结果表明,15个转基因阳性株系中有5个和2个株系分别含有左侧和右侧的边界序列,占33.3%和13.3%,结合这些株系PCR产物的序列分析结果进一步证实除T-DNA区以外的载体骨架序列确实整合到这些株系的植物基因组中。同时对载体骨架序列存在的弊端及可能的解决途径做了相应的分析。     

多重PCR技术在橡胶树转基因分子鉴定中的应用

为了同时检测橡胶树转基因胚状体和叶片中含有的多个目标基因序列,并排除扩增结果的假阴性,利用正交试验首次建立了橡胶树管家基因(HbActin)、目标基因新霉素磷酸转移酶II(NptII)基因和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因的多重PCR检测体系。利用2种酶(PCR Mix酶和Taq酶)对18个转基因胚状体和叶片进行单一引物PCR扩增和多重PCR检测。结果表明:多重PCR检测结果与单一PCR结果完全一致,且多重PCR体系带型清晰,无非特异性扩增,更易读取。多重PCR检测系统具有简单、准确并且高效等特点,只需要进行一个反应就可以检测多个目标基因序列,因而在转基因分子鉴定上具有非常重要的应用价值与潜力。     

转基因耐除草剂大豆ZH10-6目标性状遗传稳定性分析

为评估转G2-EPSPS和GAT基因耐除草剂大豆ZH10-6耐30％草甘膦水剂(孟山都,农达)目标性状在不同世代中的遗传稳定性,利用酶联免疫吸附测定法(ELISA),检测了转基因大豆ZH10-6不同世代(T2～T4)、不同生育期以及不同器官中的目标蛋白含量.同时,通过喷施不同剂量的草甘膦,考察了 3个世代转基因大豆对目...     

转基因在豌豆中的表达及稳定性

转基因在豌豆中的表达及稳定性Ｈ．Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ等现在，基因工程技术可以用于无亲缘关系物种间遗传性状的转移。转基因在豌豆中的再复制技术、农杆菌介导技术以及转化后繁殖程序的发展促进了豌豆（ＰｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍＬ．）的外源基因的导入。为了改良这种作...     

橡胶树尖孢炭疽菌分子检测及遗传多态性分析

根据GeneBank中Colletotrichum属的20个种的ITS序列,比较设计出1对引物CAF53/CAR356(CAF53 5’-GGG CAG GGG AAG CCT CTC G-3’;CAR356 5’-AGC GGT GCT TGA GGG TTG-3’);该引物可以扩增出1条303 bp的尖孢炭疽菌特异性DNA条带。并利用ISSR和RAPD分子标记技术对从海南、广东、广西和云南等垦区橡胶树上收集的21个尖孢炭疽菌株进行遗传多态性分析,以杧果上分离的尖孢作为参照菌株进行了聚类分析。结果表明,RAPD的平均遗传相似系数为0.8,ISSR的平均遗传相似系数为0.7,2种分子标记的平均遗传相似系数基本一致,均可揭示尖孢炭疽病菌的遗传多态性;2种分子标记产生的聚类分析结果存在一定差异;ISSR和RAPD类群与菌株的地理来源均不存在相关性。     

转基因烟草生产生物可降解塑料(PHA)遗传稳定性的初步分析

为检测转只pseudoalkaligenese YS1的PHA合成酶phaC1、phaC2双价基因在转基因烟草后代植株的遗传稳定性，以已获得的两株转PHA合成酶phaC1、phaC2双价基因的烟草及其后代为材料，通过对转基因烟草各后代进行PCR、PCR-Southern检测，初步确定了P.pseudoalkaligenese YS1 PHA合成酶phaC1、vhaC2双价基因能在转基因植株的后代中稳定地遗传；利用卡那霉素抗性大田直接筛选、Southern blot等方法对阳性植株作了进一步检测。用氯仿-次氯酸钠对74株PCR-Southern检测为阳性的转化植株中进行PHAs抽提，有61株中得到目的产物。所转化的烟草在产物合成水平上转化率为67．7％。     

橡胶树死皮植株割面调整

橡胶树死皮已经成为严重制约橡胶树单产提高的主要因素。本文结合海南天然橡胶产业集团股份有限公司龙江基地分公司割胶生产实践，详细介绍利用割面调整与规划等技术措施，对常规割制、新制度割胶以及老龄橡胶树死皮植株进行处理与复割，有助于预防和控制橡胶树死皮发生与发展。     

用EST-SSR标记分析巴西橡胶树的遗传多样性

利用19对EST-SSRs引物对41份巴西橡胶树材料(6个野生材料和35个栽培种)进行遗传多样性分析.结果表明:19对引物均获得了预期的扩增结果,得到92个多态性位点,每对引物检测到的等位基因数为2～7个,平均为4.84个.在相似系数为0.64的水平上,野生材料和栽培种区分开来,在相似系数0.75的水平上,又可将栽培种材料分为四个类群;栽培种和野生材料间的遗传距离在0.11～1.16之间,栽培种间遗传距离较小,野生材料间遗传距离相对较大.在栽培种和野生材料之间,遗传距离最大的是AC/T/15/114与PR261(1.16),最小的是保亭155与热研7-20-59(0.11).     

巴西橡胶树AnnHb1基因的克隆及表达分析

根据一个从巴西橡树胶乳cDNA文库中获得的EST片段的序列设计引物,通过RACE的方法获得了橡胶树编码annexin的cDNA,命名为AnnHb1。序列分析表明,AnnHb1长为1 198 bp,含有945 bp的阅读框,62 bp的5'-UTR和191 bp的3'-UTR,编码314个氨基酸,分子量为35.99 ku,等电点为8.18。该氨基酸序列与蓖麻、麻疯树、棉花、苜蓿、烟草和拟南芥中的annexin的同源性分别为82%、72%、72%、64%、60%和60%。半定量RT-PCR分析结果表明AnnHb1基因在愈伤、花、树皮、叶、胶乳中均有表达,其中在愈伤组织中表达量最低,树皮中表达量最高。     

巴西橡胶树泛素结合酶基因HbUBC5的克隆和表达分析

根据先前获得的EST序列,从橡胶树中克隆了1个编码泛素结合酶的基因HbUBC5。HbUBC5 cDNA长度为567 bp,编码185个氨基酸;HbUBC5在基因组中序列长度为2 441 bp,包含6个外显子和5个内含子。HbUBC5编码蛋白具有典型的植物泛素结合酶E2的结构特征,包含1个保守的UBC结构域和1个高度保守的半胱氨酸活性位点,和其他植物中的E2蛋白具有很高的同源性。对HbUBC5启动子区域进行分析,发现含有众多应答激素和胁迫信号元件。实时荧光定量分析结果表明,HbUBC5在树皮的表达量最高,在花中的表达量次之,在胶乳和叶片中的表达量相对较低;乙烯诱导能显著上调基因的表达。研究结果表明,HbUBC5能对乙烯做出响应,推测其可能参与了乙烯利刺激橡胶树产生副作用的过程。     

巴西橡胶树SUMO活化酶基因HbSAE1的克隆及表达

根据一个从巴西橡胶树胶乳cDNA文库中获得的EST片段的序列设计引物,通过RACE的方法获得了橡胶树编码SUMO活化酶(SUMO-activating enzyme,SAE)的cDNA,命名为HbSAE1。序列分析结果表明HbSAE1长为2 411 bp,含有1917 bp的阅读框,214 bp的5'-UTR和280 bp的3'-UTR,编码638个氨基酸,分子量为70.79 ku,等电点为5.41。半定量RT-PCR分析结果表明HbSAE1基因在花、树皮、叶、胶乳中均有表达,其中在胶乳中表达量最高。     

巴西橡胶树叶绿体型果糖-1,6-二磷酸酶基因的全长cDNA克隆与表达分析

利用RACE技术从巴西橡胶树中克隆到一个叶绿体型FBPase基因,命名为HbcpFBPase。该基因的c DNA全长为1 512 bp,包含1 209 bp的开放阅读框,编码一个由402个氨基酸残基组成的蛋白,蛋白分子量大小约为43.88 ku,理论等电点为6.64。多重序列比对表明该基因为叶绿体型果糖-1,6-二磷酸酶。Target P软件预测HbcpFBPase在叶绿体中的概率是0.961。实时荧光定量PCR分析表明,HbcpFBPase基因在雌花中表达量最高,雄花及种子次之;此外,机械伤害和割胶以及多种植物激素如乙烯利ET及植物生长素2,4-D可使HbcpFBPase基因下调表达。研究结果对进一步研究橡胶树光合作用碳固定、以及深入研究光合作用与胶乳合成之间的关系提供理论参考。     

巴西橡胶树HbRPS6-2基因的克隆与生物信息学分析

从巴西橡胶树甲基化过滤文库中筛选到一个与RPS6同源性较高的基因片段,根据该基因片段序列信息,设计特异引物,利用RACE进行特异片段的5’和3’扩增,获得长度为1 327 bp的HbRPS6-2基因克隆。生物信息学分析表明,该基因包含483 bp的开放阅读框,5’非翻译区为357 bp,3’非翻译区为475 bp,编码161个氨基酸。在HbRPS6-2氨基酸序列中没有预测到信号肽和跨膜区,二级结构分析表明其属于混合型蛋白。HbRPS6-2在N端前18个氨基酸区域内有一个较强的疏水区,但整条多肽链表现为亲水性。对15个RPS6系统进化分析发现,巴西橡胶树的RPS6-2基因与多杀性巴氏杆菌的RPS6基因亲缘关系最近,而与拟南芥和玉米等亲缘关系相对较远。     

橡胶树PGAM基因的克隆及表达特性分析

从橡胶树中克隆并获得磷酸甘油酸变位酶基因（HbPGAM），该基因的cDNA序列全长1 559 bp，包含长度为1 260 bp的完整开放阅读框，编码一个由419个氨基酸残基组成的蛋白，氨基酸同源性分析发现，该蛋白含有保守的磷酸变构酶组氨酸磷酸酶结构域，属于磷酸甘油酸变位酶。生物信息学分析显示，HbPGAM蛋白无导肽酶切位点，不具有跨膜结构域且为亲水蛋白，该蛋白可能在细胞质中发挥作用。实时荧光定量PCR分析表明，HbPGAM基因在分析的7种组织中均表达，但在胶乳（产胶细胞乳管的细胞质）中的表达水平最高，且该基因在胶乳中的表达受割胶影响，推测其参与橡胶树胶乳再生过程。此外，HbPGAM基因表达受部分植物激素如乙烯利ET、植物生长素2,4-D及水杨酸SA调控，但调控不明显。结果说明，胶乳再生过程中HbPGAM对胶乳糖酵解起到一定的调控作用，为全面了解橡胶树PGAM家族奠定理论基础。     

巴西橡胶树HbHMAD1的克隆及表达

根据已获得的在橡胶树自根幼态无性系与老态无性系胶乳中一个差异表达的片段序列设计引物,通过RACE法获得了橡胶树编码含有重金属相关结构域蛋白的cDNA,命名为HbHMADl.序列分析结果表明,HbHMA D1长为814bp,含有453 bp的阅读框,78bp的5’-UTR和283 bp的Y-UTR,编码150个氨基酸,分子量为16.9 ku,等电点为10.4.HbHMAD1含有重金属相关结构域,与蓖麻(Ricinus communis)、拟南芥(Arabodopsis thesis)(3个)和玉米(Zea mays)中的含有重金属相关结构域蛋白的同源性分别为85％、64％、63％、60％和55％.半定量RT-PCR分析表明HbHMA D1基因在胶乳和树皮中表达,在叶中微量表达,在花中基本不表达.     

橡胶树羟基腈水解酶基因的克隆、表达和基因家族分析

植物体内羟基腈水解酶(HNL)催化羟基腈类化合物水解,释放氢氰酸,抵御害虫和病原菌的侵害。橡胶树是产氰植物,生物信息学研究表明,橡胶树有6个HNL基因,在分子进化分析中与大戟科其他植物的HNL基因聚为一类,与十字花科等植物的HNL亲缘关系较远,说明大戟科HNL基因的重复发生在与十字花科等植物分化之后,大戟科植物通过HNL基因的重复强化对病虫害的防御作用。通过RT-PCR从橡胶树热研7-33-97品系中克隆了其中最重要的1个HNL蛋白编码基因Hb HNL-1。该基因c DNA序列全长1 003 bp,阅读框771 bp,编码257个氨基酸,其编码蛋白分子量为29.2 ku,理论等电点为5.7。定量PCR分析表明,Hb HNL-1在初生胶乳中的表达量是次生胶乳中的100多倍,在幼嫩叶片中的表达量为成熟叶片的8倍。说明橡胶树的幼嫩组织器官是Hb HNL-1的重点防御部位。