棉花愈伤组织染色体观察制片方法的探讨（简报）

棉花愈伤组织染色体观察制片方法的探讨（简报）张宝红，李秀兰（中国农业科学院棉花研究所，河南安阳４５５１１２）在棉花愈伤组织细胞学观察中，用胚性愈伤组织或继代后３～７天的愈伤组织进行压片，易获得较多的分裂相。在自来水低温处理、８－羟基喹啉低温处理、秋水...     

长期继代对棉花胚性愈伤组织体胚发生能力及再生植株变异的影响

植物细胞在离体培养时，再生频率和再生植株的质量与培养时间密切相关。为探讨棉花胚性愈伤组织长期继代的可行性和适宜的继代策略，以川棉239胚性愈伤组织为材料，观察其在继代过程中颜色、质地、生长速度和体胚发生能力的变化，体胚及再生植株畸形变异的发生频率。结果表明，通过在MSB＋ET0．1mg/L＋KNO31．9g/L和MSB＋KT0．1mg/L IAA0.1mg/L两种培养基上交替培养并结合选择性继代，川棉239体细胞胚胎发生能力虽然可保持较长时间，但随着继代时间的延长，再生能力却逐渐下降，畸形胚发生频率和再生植株不育率逐渐升高。棉花胚性愈伤组织的继代时间不宜超过1．5年。     

咖啡胚性愈伤悬浮培养体系的构建与优化

为解决咖啡胚性愈伤悬浮培养增殖效率较低、悬浮增殖培养获得的胚性细胞在后续体胚转化率低的问题,以中粒种咖啡叶片诱导的胚性愈伤组织为材料,建立了咖啡胚性愈伤悬浮培养体系。在此基础上,分别探讨了起始胚性愈伤培养时间、继代起始浓度以及培养基中不同激素水平等条件对悬浮培养及后续体胚转化率（胚性保持）的影响。结果表明,起始胚性愈伤培养时间为3周,继代起始浓度为0.03mL胚性细胞/1mL培养液,细胞生长素2,4-D与细胞分裂素KT比例为1∶1时,净增殖率最高且胚性愈伤组织后续的体胚诱导率相对较高。探讨了咖啡胚性愈伤悬浮培养的适宜条件,对构建咖啡胚性愈伤悬浮培养系,提高组织培养种苗繁育效率具有一定意义。     

继代培养时间对抗性黑松体胚发生的影响

以继代培养0.5、1.5 a和3.5 a的抗性黑松37#家系胚性愈伤组织为材料,观察不同培养时间胚性细胞的形态和体胚成熟的过程,并对愈伤组织的增殖率、每克愈伤形成的体胚数量及体胚萌发率和植株成活率进行测定。结果表明:在继代培养过程中,胚性胚柄细胞团(ESM)结构逐渐疏松,胚柄细胞呈现缩短、增粗的现象;培养时间对抗性黑松愈伤组织的增殖、分化、体胚萌发及植株成活率均有显著影响。3种不同培养时间愈伤组织的增殖率分别为200.37%、182.47%和111.63%,每克胚性愈伤组织形成成熟体细胞胚分别为77、31、5个,萌发率分别为84.43%、51.10%、11.13%;植株成活率分别为73.00%、50.00%、6.70%,均呈下降趋势;3种愈伤体胚成熟的时间也存在显著差异,继代培养时间越长,体胚分化成熟过程越慢,愈伤组织形成子叶胚的时间最短为46 d,最长为74 d。因此,抗性黑松胚性愈伤组织在继代培养过程中胚性逐步降低,体胚发生和植株再生能力下降,短期培养的胚性愈伤组织(0.5 a)为抗性黑松体胚发生较为理想的初始材料,且愈伤组织继代培养时间不宜超过1.5 a。     

龙眼胚性愈伤组织继代过程中的衰老与死亡规律初步研究

在常规离体培养中，龙眼胚性愈伤组织继代周期短，需每隔20d继代一次。这样短的周期对离体种质保存来说过于频繁，为避免增加愈伤组织被污染的机会及快速生长分裂带来的高变异率，本研究试图通过对龙眼胚性愈伤组织生长规律和继代过程中生理活性变化的研究，找出能够延缓龙眼胚性愈伤组织生长并且能够延长继代周期，保持愈伤组织遗传稳定性的方法，以达到能够长期保存龙眼胚性愈伤组织的目的。     

龙眼胚性细胞系的建立与保持

本研究比较了生长调节剂、ＡｇＮＯ３、活性炭、碳源、基本培养基、光照度、胚发育时期以及基因型等对龙眼幼胚培养诱导愈伤组织的影响．从幼胚培养中，诱导出多种类型的愈伤组织，经继代培养并筛选，获得松散、生长旺盛、胚胎发生能力极强的松散型胚性愈伤组织．该类型胚性愈伤组织适宜建立悬浮细胞系和分离原生质体，并且转移至含体积分数为０．０５椰子汁的ＭＳ固体培养基上，形成大量的胚状体．采用在附加１ｍｇＬ－１２，４－Ｄ的ＭＳ培养基与附加１ｍｇＬ－１２，４－Ｄ、０．５ｍｇＬ－１ＫＴ和５ｍｇＬ－１ＡｇＮＯ３的ＭＳ培养基交替继代培养，该类型胚性愈伤组织可长期保持     

长期继代培养过程中楸树愈伤组织的分化能力

以长期继代培养的楸树愈伤组织和新诱导的楸树愈伤组织为试验材料,利用石蜡切片比较分析它们的组织形态特征,并测定过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和淀粉酶的活性,以及可溶性蛋白与可溶性糖的含量,以探究楸树愈伤组织长期继代培养后分化再生困难的形成原因。组织形态学观察分析发现,继代培养7 a的白色颗粒状愈伤组织细胞中淀粉粒含量丰富,分布均匀,仍为胚性愈伤组织;新诱导的浅绿色愈伤组织存在明显的细胞分化中心,有均匀分布的淀粉粒,为早期胚性愈伤组织;新诱导的黄白色致密愈伤组织为非胚性向胚性转化的愈伤组织,新诱导黄白色疏松愈伤组织为非胚性愈伤组织。生理生化指标测定分析发现,继代培养7 a的楸树胚性愈伤组织中可溶性糖和可溶性蛋白的含量均显著高于新诱导出的3种愈伤组织,但其同工酶活性却较低,表明在长期继代培养的过程中,楸树愈伤组织的生理生化代谢活性降低。由此推测生理生化代谢活性的下降可能是造成楸树胚性愈伤组织长期继代培养后分化再生困难的重要因素。     

濒危植物香果树愈伤组织经长期继代后的6种同工酶研究

[目的]研究濒危植物香果树愈伤组织经长期继代后的6种同工酶酶谱的变化。[方法]采用用非变性聚丙烯凝胶电泳技术对长期继代后的香果树愈伤组织的酯酶（EST）、酸性磷酸酯酶（ACP）、ATP酶（ATPase）、淀粉酶（AMY）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）6种同工酶进行分析。[结果]香果树的胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织在6种同工酶水平上均有差异,均可作为鉴别2者的依据。非胚性愈伤组织中的EST、ACP和POD的表达量明显高于胚性愈伤组织。褐化的非胚性愈伤组织与正常非胚性愈伤组织相比,在AMY、SOD和POD同工酶水平上无差别,而EST、ACP和ATPase同工酶含量减少;褐化的胚性愈伤组织与正常胚性愈伤组织相比,EST同工酶含量升高,其他5种同工酶含量降低。[结论]为研究香果树的长期组织培养过程中愈伤组织形态差异及褐化现象提供理论基础。     

新疆长绒棉胚性悬浮细胞原生质体的培养及再生

在进行新疆长绒棉胚性细胞原生质体培养期间，比较酶液中不同甘露醇浓度，悬浮细胞不同继代时间及不同培养方法，不同包埋培养基，不同滴加液对原生质体培养的影响。发现琼脂糖珠包埋培养最适宜其培养，获得了原生质体的再生，植板率为２９．８４％（以第八天计），进一步培养，获得再生愈伤组织，愈伤是胚性愈伤。     

棉花花药愈伤组织培养与胚胎发生

棉花花药愈伤组织的生长与增殖受基因型、糖源、培养基成分等多种因素的影响。经多次继代筛选后，棉花花药愈伤组织中可形成一种能分化出胚状体的胚性愈伤组织，并能产生不同发育时期的胚状体。胚状体转入胚荫发培养基中，可萌发形成小植株。本实验获得了鲁棉６号小植株和Ｓｉｏｋｒａｌ－３及珂字２０１的于叶胚。     

继代培养对水稻胚性愈伤组织染色体变异及体细胞无性系变异的影响

以79106、金早6号、中花9号和南粳35等4个水稻品种的成熟胚胚性愈伤组织为材料,研究继代培养对胚性细胞染色体的数量和结构变异及体细胞无性系农艺性状变异的影响,结果表明,经60d继代培养后,胚性细胞染色体变异频率明显高于未继代培养的愈伤组织,并出现多种变异类型,愈伤组织继代培养后的再生植株农艺性状变异范围明显增大,但以继代培养天数不超过60 d的愈伤组织再生植株较之其它处理不仅有较丰富的变异类型,而且有足够大的群体供选择。     

长期继代培育对玉米幼胚愈伤组织的影响

[目的]研究玉米胚性愈伤组织长期继代培育的特性变化。[方法]以5种基因型的胚性愈伤组织为材料研究它们继代10次与20次的特性变化。[结果]继代20次愈伤组织的单个培养周期生长量、胚性愈伤组织比率和愈伤组织幼苗再生率和继代10次愈伤组织相比均有下降,但变化幅度因基因型或愈伤组织类型而不同。Ⅰ型愈伤组织继代20次后生长量、胚性愈伤组织比率下降明显,而Ⅱ型愈伤组织相对稳定。[结论]与Ⅰ型愈伤组织相比,玉米Ⅱ型愈伤组织是建立长期玉米组织培养体系的理想材料。     

甜玉米和糯玉米幼胚离体培养试验

以N1、N28、T5、1＇6等4个玉米（Zea mays L．）自交系为材料,进行幼胚离体培养．通过愈伤组织的诱导、继代、分化和植株再生等试验,对影响玉米幼胚愈伤组织诱导率和胚性率的因素进行了分析．结果表明,甜、糯玉米幼胚诱导出愈伤组织的能力较为普遍,但诱导率及胚性率因基因型不同、所选用培养基不同而不同,基因型是影响玉米幼胚愈伤组织诱导和幼苗再生的一个重要因素;选择大小为1～2mm的幼胚作为外植体有利于诱导出理想的胚性愈伤组织;2,4-D是愈伤组织诱导和继代不可缺少的植物激素,在愈伤组织诱导及继代过程中2,4-D含量以2．0mg／L为宜;AgNO3有利于胚性愈伤组织的诱导和生长,最佳含量为10mg／L,比对照高27．15％．     

沙田柚杂种胚性愈伤组织的诱导及遗传鉴定

【目的】沙田柚（Citrus grandis [L.] Osbeck cv.Shatian）是中国的特有品种，其愈伤组织难以诱导。为进一步进行细胞工程研究，本研究通过与其它品种杂交的方法获得杂种胚性愈伤组织。【方法】以沙田柚为母本，用体细胞杂种橘柚+无酸甜橙 ([C.reticulata Blanco× C.paradisi Macf.] cv.Nova+C.sinensis [L.] Osbeck cv.Succari)为父本进行杂交，90 d后将幼胚取出，在MT + ME（麦芽提取物，500 mg·L-1）和MT + GA3（1 mg·L-1）两种固体培养基上培养。【结果】幼胚培养约5个月左右，在两种培养基上从胚状体和幼小植株的下胚轴处都长出了可继代保存的胚性愈伤组织，经细胞流式仪和SSR鉴定，该胚性愈伤是三倍体杂种愈伤，继代保存两年后，在MT+乳糖（50 g·L-1）培养基上仍可以产生大量的胚状体，具有较强的胚状体发生能力。【结论】沙田柚与体细胞杂种杂交后，可以较容易地获得其杂种的胚性愈伤，对沙田柚种质资源的保存和利用具有重要价值。     

棉花组织培养植株再生技术的研究

以陆地棉珂字２０１３日龄无菌苗的下胚轴为外植株，建立了棉花体细胞胚发生和植株再生的培养程序。大多数激素或其组织均能诱导获得胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织，其中ＴＤＺ的诱导效果较好，正确选择胚性愈伤组织进行继代培养，有利于提高胚的获得率和缩短培养周期；液体悬浮培养是获得大量发育同步胚的关键技术。胚的萌发有３种类型，且受激素的调控，其中０．１ｍｇ／ＬＮＡＡ最有利于体细胞胚萌发成苗。     

小麦原生质体培养与植株再生的研究

原缩短继代间隔的方法，从小麦３５８１６幼穗俞伤组织中筛选到由小颗粒组成的松脆型胚性愈伤组织，并建立了胚性细胞悬浮系。     

水稻胚性愈伤组织继代培养中的生理生化特性

为探明水稻胚性愈伤组织继代培养中的生理生化特性,以水稻湘早籼１３号和超丰早１号的幼穗和胚轴诱导的胚性愈伤组织为材料,研究了继代培养中所建立的胚性愈伤组织无性系过氧化物酶、酸性磷酸酯酶的活性变化及同工酶谱变化。结果表明,不同基因型与不同外植体来源的胚性愈伤组织无性系,继代培养过程中两种酶活性均呈下降趋势,与胚性愈伤组织无性系培养力降低的结果一致,其同工酶谱也发生了一定的变化。     

木薯胚性愈伤组织离体保存条件的筛选

本试验以木薯品种GR3嫩枝侧芽诱导胚性愈伤组织为试材,研究不同植物生长调节剂浓度以及不同浓度蔗糖在不同温度条件下保存对胚性愈伤组织的形态指标及细胞活力进行限制性保存条件的筛选。结果表明,在20℃条件下,将木薯胚性愈伤组织保存在添加比久（B9）浓度均为6mg/L的保存培养基（含Picloram12mg/L＋蔗糖30g/L＋脂琼6.5g/L的GD培养基,pH值5.8）中,胚性愈伤质地及生长情况表现良好,保存效果最佳,继代时间延长至100d。     

鲁棉6号体细胞胚胎发生过程及植株再生

以黄河流域棉花品种鲁棉6号为试验材料,以易再生的棉花品系YZ1为对照,通过不同质量浓度的激素组合成功诱导鲁棉6号产生体细胞胚并发育成苗。结果表明:所用的12种激素组合均能有效诱导出愈伤组织,其中以1.0 mg/L IBA或0.1 mg/L 2,4-D和0.2 mg/L KT组合的诱导效果最佳;愈伤组织继代时培养基中生长素质量浓度减半,KNO3质量浓度加倍;挑选黄绿色或灰绿色、质地疏松的颗粒状愈伤继代于0.01 mg/L 2,4-D和0.1 mg/L KT或0.1 mg/L IBA且KNO3用量加倍的培养基中,可在1~2个月内产生胚性愈伤组织,胚性愈伤组织再转到分化培养基上可产生体细胞胚;体细胞胚在1/2 MS培养基中进一步发育成再生小苗。利用该组织培养再生系统,鲁棉6号和YZ1都能在6~8个月内成功获得再生植株。组织学观察表明,IBA处理下鲁棉6号胚性愈伤组织细胞主要来源于棉花下胚轴初生形成层的细胞。     

棉花胚性愈伤的快速诱导和繁殖

棉花（Gossypium hirsutum L.）是世界上最重要的商业纤维作物。与其他作物相比,棉花再生体系较难。通过生物技术对棉花进行遗传改良往往受制于缺乏高效的再生体系。高效、快速的再生体系的开发有助于提高棉花转化效率。在0.10 mg/L的吲哚乙酸（IAA）、0.09 mg/L细胞分裂素（KT）和0.09 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）的MSB5培养基上产生高效愈伤组织。胚性愈伤组织可在愈伤组织基础上与SM2培养基中诱导出来,也可在“M1-SM1-SM2”培养基交替使用过程中诱导出来。利用此方法可在2~3月内诱导出胚性愈伤,大大缩短再生周期。胚性愈伤在PM1或PM2培养基中可以维持良好的再生状态。可见建立的快速诱导和繁殖胚性愈伤的方法可以用于棉花基因工程遗传改良。