白斑综合征病毒(WSSV)基因VP28原核表达与检测

VP28是对虾白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV) 的囊膜蛋白。将VP28基因序列密码子优化后合成,经限制性内切酶Nde I、Xho I酶切后,按正确的阅读框顺序插入到pET-28a( )表达载体上。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经质粒双酶切、测序鉴定后,证实成功地构建了 VP28 基因原核表达载体pET-28a-VP28。转化菌经 IPTG 诱导,SDS-PAGE 显示含有与预期大小一致的约30kDa蛋白带,主要以包涵体形式表达。采用Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,获得了纯度为95%的大肠杆菌重组蛋白VP28。该纯化蛋白作为绝对定量Western的标准品,梯度稀释建立标准曲线,以定量检测转基因鱼腥藻7120中的VP28绝对表达量。实验结果表明,大肠杆菌BL21(DE3)表达的重组蛋白VP28与鱼腥藻7120中表达的VP28分子量基本相同,纯化后的大肠杆菌重组蛋白梯度稀释作为绝对定量Western标准曲线,计算出转基因鱼腥藻7120在培养第17天时,VP28的表达量最大,为5.14μg/mL,占转基因鱼腥藻7120总蛋白浓度的1.45%。这不仅对转基因鱼腥藻的高效培养具有重要意义,也为日后确定投喂对虾口服疫苗有效剂量防治白斑综合症奠定了基础。     

RNA干扰南美白对虾白斑病毒VP28基因的体外研究

为方便筛选VP28特异性siRNAs,通过构建真核表达载体pEGFP-VP28,然后将设计的siRNA与pEGFP-VP28共转染BHK细胞,并采用Western blotting检测GFP-VP28融合蛋白的表达情况以及半定量RT-PCR检验siRNA抑制VP28转录的效果,建立了体外RNA干扰法筛选系统。结果表明,pEGFP-VP28能在BHK细胞正常表达,设计的3对siRNA对VP28的mRNA转录均有不同程度的干扰效果,其中siRNA2的干扰效果最为显著。研究结论为开展RNA干扰在对虾体内抑制WSSV的研究建立基础。     

感染白斑综合征病毒的斑节对虾免疫酶变化特征

研究了斑节对虾(Penaeus monodon)感染白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)后的发病情况和4种免疫酶活性的变化特征。通过对斑节对虾进行WSSV急性攻毒试验,发现在感染50h左右出现死亡高峰,感染60h后大部分死亡虾出现明显的白斑。血液酚氧化物酶(PO)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、酸性磷酸酶(ACP)活性在感染WSSV后都呈现先降低再升高再降低的趋势,并在感染后60h左右,活性达到最大值。肝脏、肌肉组织中的ACP、SOD活性变化规律与其在血液中的变化类似,肝脏中的ACP、SOD活性明显高于肌肉组织中的活性。     

白斑综合征病毒(WSSV)在几种经济类淡水甲壳动物中的感染与流行调查研究

2007年江苏、浙江等地暴发养殖克氏原螯虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)病,2008年该病在江苏地区进一步蔓延,调查发现,在一些虾蟹混养池塘,中华绒螯蟹也有批量死亡的现象.本研究通过采集发病池塘中的克氏原螯虾、中华绒螯蟹与日本沼虾,将上述3种淡水甲壳动物进行超薄切片透射电子显微镜观察,同时利用建立的WSSV特异性引物PCR方法进行检测.试验结果表明,在上述3种淡水甲壳动物中均发现类似WSSV颗粒,PCR检测进一步证实已感染WSSV.流行病学调查及人工回感试验表明该病毒对克氏原螯虾和中华绒螯蟹具有较强毒性,日本沼虾则无明显发病症状.     

LAMP和巢式PCR检测克氏原螯虾白斑综合征病毒(WSSV)的比较

白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是克氏原螫虾(Procambarus clarkii)养殖生产中危害最大的病原之一,也是其他一些要经济虾类的主要病害,但是目前没有相应的有效治疗药物.为了减少WSSV对克氏原螯虾的危害,及早发现病原,以便采取相应措施将损失降到最小程度,笔者开展了以环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)法检测克氏原螯虾WSSV的研究,并且与灵敏度非常高的巢式PCR检测法进行了比较.结果表明,用LAMP法可以快速、灵敏、特异性地检测克氏原螫虾WSSV,其灵敏度与巢式PCR相比,高出约500倍,且不需要专用的PCR仪,是检测WSSV的一种理想方法.该结果也为其他虾类的WSSV检测提供了重要参考.     

白斑综合征病毒囊膜蛋白VP26和VP28的原核表达及多克隆抗体的制备

对虾白斑综合征病毒(WSSV)是一种能快速繁殖并且传播的致死病原体,在全球范围威胁虾蟹的生存.它感染的宿主范围很广,不仅侵染各种野生及养殖对虾,而且侵染其他水生甲壳类如蟹类、螯虾和龙虾等.VP28、VP26是WSSV病毒粒子的2个主要囊膜蛋白.本试验成功构建了其原核表达体系,制备了多克隆抗体,为进一步研究对虾白斑综合征病防治措施的免疫试验提供抗体和依据.     

对虾白斑综合征病毒(WSSV)致病相关基因研究进展

介绍了最近几年白斑综合征病毒WSSV致病相关基因的研究进展,包括病毒囊膜蛋白基因、核衣壳蛋白基因、病毒复制过程的关键酶基因、细胞因子受体基因、潜伏相关基因和抑制宿主细胞凋亡机制的基因等。     

对虾白斑综合症病毒PCR检测体系的优化研究

通过改进WSSVPCR模板制备方法、引物的筛选、PCR反应的优化,建立稳定的WSSVPCR检测体系。结果表明,该体系具有稳定、快速、灵敏等特点,可用于生产中对WSSV的检测。     

VP28蛋白鸡源抗WSSV卵黄抗体的制备及性能分析

为了研制鸡源抗对虾白斑综合征病毒（WSSV）卵黄抗体（IgY）,利用WSSV毒株及其衣壳蛋白VP28制备成2种不同的疫苗,并分别免疫接种健康蛋鸡群,使鸡群产生不同的IgY,经病毒中和试验证实,2种IgY均有明显的抗WSSV效果,其中WSSV粗提液1∶1000倍稀释时,WSSV灭活苗免疫蛋鸡产生的IgY对南美白对虾的保护率为61.7%,重组VP28疫苗免疫蛋鸡产生的IgY保护率为48.3%;而WSSV粗提液1∶10000倍稀释时,WSSV灭活苗免疫蛋鸡产生的IgY保护率为85.0%,重组VP28疫苗免疫蛋鸡产生的IgY保护率为75.0%.     

宁波地区南美白对虾白斑综合征病毒（WSSV）的检测与分析

为了解浙江宁波地区南美白对虾白斑综合征病毒（WSSV）的流行情况,为科学防控该病提供参考依据,应用PCR方法对2004～2008年采自宁波地区对虾养殖场的1201份南美白对虾样品进行WSSV检测。结果表明,1201份样品中有364份样品呈阳性,总阳性率为30.31%;2004～2008年的WSSV年平均阳性检出率均较高,且呈不规律变化,其中以2006年南美白对虾白斑综合征发病最严重,阳性感染率达42.66%,但2006～2008年WSSV的年平均阳性检出率呈下降趋势。     

白斑综合征病毒囊膜蛋白VP31与该病毒侵染的相关性

白斑综合征病毒(WSSV)是一种已给世界养虾业造成了严重危害的病原体.根据GenBank上公布的WSSV囊膜蛋白基因VP31的序列,设计并合成特异引物,PCR扩增得到VP31基因,大小为783 bp.通过引物两端的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点连接该基因,然后将其构建到家蚕杆状病毒表达载体pFAST BAC HTB上.重组的家蚕杆状病毒转染5龄家蚕幼体内表达,表达产物经SDS-PAGE检测,显示与预期31 kD大小相吻合的蛋白带.用Ni2 柱纯化该蛋白免疫新西兰大白兔制备抗体,肌肉注射克氏鳌虾进行活体中和病毒试验.中和试验结果显示,囊膜蛋白VP31与白斑综合征病毒的侵染性相关,对病毒的侵染性可能起着重要作用.     

白斑综合征病毒囊膜蛋白VP31与该病毒侵染的相关性

白斑综合征病毒(WSSV)是一种已给世界养虾业造成了严重危害的病原体.根据GenBank上公布的WSSV囊膜蛋白基因VP31的序列,设计并合成特异引物,PCR扩增得到VP31基因,大小为783 bp.通过引物两端的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点连接该基因,然后将其构建到家蚕杆状病毒表达载体pFAST BAC HTB上.重组的家蚕杆状病毒转染5龄家蚕幼体内表达,表达产物经SDS-PAGE检测,显示与预期31 kD大小相吻合的蛋白带.用Ni2 柱纯化该蛋白免疫新西兰大白兔制备抗体,肌肉注射克氏鳌虾进行活体中和病毒试验.中和试验结果显示,囊膜蛋白VP31与白斑综合征病毒的侵染性相关,对病毒的侵染性可能起着重要作用.     

白斑综合征病毒单克隆抗体的制备及BA-ELISA方法的建立

白斑综合征病毒(white spot syndrom virus,WSSV)是甲壳类动物的重要病原,作者采用提纯的WSSV免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA法筛选阳性孔,经有限稀释法克隆,共得到3株能特异分泌抗WSSV的单克隆抗体(Mab)的杂交瘤细胞(1E9、1E10、4F5)。将3株杂交瘤细胞注射小鼠,制备腹水单克隆抗体,ELISA效价为1∶104~105。1E9、4F5的抗体亚型均为IgG1,1E10的抗体亚型为IgG2b。特异性实验表明:3株单抗与虾类病原桃拉综合征病毒(TSV)、罗氏沼虾诺达病毒(MrNV)、哈维氏弧菌(V.harveyi)均无交叉反应。Western bolt分析表明:单抗1E9与病毒28kD外膜蛋白特异性结合。采用生物素标记纯化后的单抗1E9,并建立了生物素-亲和素酶联免疫吸附法(Biotin-Adivin ELISA,BA-ELISA)用于WSSV的检测,该方法对提纯病毒的检测灵敏度约为4 ng,对病虾血淋巴的检测灵敏度达1∶25000。     

黄芪多糖对克氏原螯虾抗白斑综合征病毒(WSSV)感染的效果研究

研究了基础饲料中添加不同浓度的黄芪多糖(astragalus polysaccharides,APS)对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)抗白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)的效果。用添加0%、0.2%、0.4%、0.8%黄芪多糖的基础饲料作为药饵,投喂20 d后,对各组经PCR检测WSSV呈阴性的健康克氏原螯虾进行WSSV病毒悬液腹节背部注射攻毒试验,当添加0%黄芪多糖的阳性对照组中死亡率达到100%时,添加0.2%、0.4%、0.8%黄芪多糖实验组的死亡率分别为(86.67±13.33)%、(91.11±7.70)%、(73.33±17.64)%。为了评价黄芪多糖对克氏原螯虾各器官组织的影响,对其鳃、肝胰腺、心肌组织进行病理组织切片观察,结果发现:添加0%黄芪多糖的阳性对照组中克氏原螯虾的鳃、肝胰腺、心肌组织出现细胞排列无序、细胞破裂、核仁皱缩等明显的病理变化;而添加0.8%黄芪多糖的实验组中克氏原螯虾的鳃、肝胰腺组织未见明显病变,心肌组织核仁出现一定程度的皱缩,但细胞尚未破裂。研究表明:与阳性对照组相比,添加0.8%的黄芪多糖可提高26.67%的存活率,对克氏原螯虾抗WSSV感染有很好的提高效果,可望在生产中收到良好的经济效益。     

不同靶点shRNA干扰对虾白斑综合征病毒增殖效果分析

设计合成了靶向对虾白斑综合征病毒(WSSV)基因组不同佗点的5个shRNA:RR9、RR1、DP1、DP2和PK1,并在凡纳滨对虾体内实施了RNA干扰(RNAi)抗WSSV增殖的试验.结果显示:5个shRNA不同程度地抑制了WSSV的复制,降低了对虾的死亡率,其中,靶向病毒核糖核酸还原酶的shRNA RR9的RNA干扰效果最佳.     

不同温度下哈维氏弧菌和白斑综合症病毒对凡纳滨对虾的致病性

在不同温度[(19±1)、(25±1)、(31±1)℃]条件下,研究了不同浓度哈维氏弧菌Vibrio harveyi和白斑综合症病毒(WSSV)对凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei(体长8.12 cm±0.83 cm)的致病性。结果表明:温度为(19±1)℃时,整个试验过程中对虾死亡率均低于8.9%,各组病毒携带量低于3.9×104copy/g;温度为(25±1)℃时,病毒单独感染组对虾的死亡率和病毒携带量(最大值71.1%,1.9×105copy/g)和高浓度继发感染组的死亡率和病毒携带量(最大值77.8%,3.2×106copy/g)从试验中期开始明显高于其他组,死亡加快,病毒携带量迅速增加,单独感染细菌组死亡率随感染浓度的升高而升高(最大值为21.1%);温度为(31±1)℃时,病毒单独感染组的死亡率和病毒携带量(最大值47.8%,2.2×104copy/g)从试验中期开始明显低于继发感染组(最大值80.0%,6.1×106copy/g),单独感染细菌组的累积死亡率随细菌浓度的升高而升高(最大值24.4%)。研究表明,温度对WSSV和哈维氏弧菌的致病力影响显著,继发感染和细菌单独感染随温度的升高致病力升高,高温和低温对WSSV的致病力有抑制作用。